• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    利用小RNA測序技術(shù)檢測貴州西番蓮病毒

    2019-07-09 11:37:20嚴(yán)佳文袁啟鳳解璞王立娟馬玉華王正媛
    熱帶作物學(xué)報(bào) 2019年8期
    關(guān)鍵詞:西番蓮鑒定病毒

    嚴(yán)佳文 袁啟鳳 解璞 王立娟 馬玉華 王正媛

    摘 ?要 ?病毒病害是西番蓮重要病害之一,明確病毒種類可為病害防治提供理論依據(jù)。本研究應(yīng)用小RNA測序技術(shù)對(duì)6份疑似病毒侵染的西番蓮葉片樣本進(jìn)行病毒種類鑒定,發(fā)現(xiàn)混合樣本中含有黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)和夜來香花葉病毒(Telosma mosaic virus, TeMV)。應(yīng)用RT-PCR分別擴(kuò)增6份樣本中2種病毒的外殼蛋白(coat protein, CP)基因序列,進(jìn)一步證實(shí)6份樣本中均含有CMV和TeMV。CMV的CP基因開放閱讀框大小為657 bp,與已報(bào)道的其他分離物的一致性為82.3%~95.9%;TeMV的CP基因開放閱讀框?yàn)?16 bp,與其他分離物的一致性分別為87.8%~99.3%和87.8%~98.3%。上述結(jié)果表明,貴州西番蓮中的病毒是CMV和TeMV的分離物,分別命名為CMV-GZ(CP基因登錄號(hào)為MH623077)、TeMV-GZ1(MH623078)和TeMV-GZ2(MH623079)。

    關(guān)鍵詞 ?西番蓮;病毒;小RNA測序;鑒定

    中圖分類號(hào) ?S436.67 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ?A

    Abstract ?Virus disease is one of the main diseases of Passiflora edulis, and the identification of virus species can provide a theoretical basis for the disease prevention. In this study, six suspected virus-infected leaf samples were mixed and analyzed by small RNA deep sequencing. Cucumber mosaic virus (CMV) and Telosma mosaic virus (TeMV) were detected from the mixed sample. Viruses identified by small RNA sequencing were validated by virus coat protein gene (CP) specific RT-PCR from the above six samples. CMV and TeMV was detected from all six samples, respectively. The open reading frame of CP gene of CMV and TeMV obtained by RT-PCR was 657 bp and 816 bp, correspondingly. The nucleotide sequence identity of CMV-GZ (accession number: MH623077), TeMV-GZ1 (accession number: MH623078) and TeMV-GZ2 (accession number: MH623079) was 82.3%95.9%, 87.8%99.3% and 87.8%98.3%, respectively, with the reported CMV and TeMV isolates. CMV and TeMV in P. edulis was first reported Guizhou. The combined infection of the two viruses may be a potential threat to P. edulis.

    Keywords ?Passiflora edulis; virus; small RNA sequencing; identification

    DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.08.018

    西番蓮(Passiflora spp.)是西番蓮科(Passifl oraceae)西番蓮屬(Passiflora)果樹,原產(chǎn)于南美洲,約有530個(gè)種和400多個(gè)人工雜種,其中可食用的有80余種[1-2]。西番蓮兼具食用和藥用價(jià)值,具有重要的經(jīng)濟(jì)意義[3]。我國早在1901年就引種西番蓮,目前在臺(tái)灣、廣東、海南、福建、貴州、廣西、云南和四川等省區(qū)廣泛種植[4]。近年來,西番蓮種植面積迅速擴(kuò)大,各省區(qū)之間引種、苗木銷售活動(dòng)頻繁,一定程度上加速了各種病害的傳播和蔓延[5]。病毒病害嚴(yán)重影響西番蓮的產(chǎn)量和品質(zhì),是產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的主要限制因素之一[6]。

    國內(nèi)外已報(bào)道了26種侵染西番蓮的病毒,包括馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)、菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)、香石竹潛隱病毒屬(Carl avirus)、黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)、蕪菁黃花葉病毒屬(Tymovirus)、柑橘粗糙病毒屬(Cilevirus)、煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)、線蟲傳多面體病毒屬(Nepovirus)等[5]。我國主要有黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus, CMV)、東亞西番蓮病毒(East Asian Passiflora virus, EAPV)、西番蓮斑駁病毒(Passion fruit mottle virus, PaMV)、廣東番木瓜曲葉病毒(Papaya leaf curl Guangdong virus, PaLCuGdV)、大戟曲葉病毒(Euphorbia leaf curl virus, EuLCV)和夜來香花葉病毒(Telosma mosaic virus, TeMV)[6-9]。國內(nèi)西番蓮病毒病害主要發(fā)生在臺(tái)灣、福建、海南和廣東等省區(qū)[5],貴州暫未見西番蓮病毒病相關(guān)報(bào)道。筆者通過田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)貴州各個(gè)主產(chǎn)區(qū)均有疑似病毒病侵染的植株,部分果園尤為明顯。鑒定侵染貴州西番蓮病毒種類,對(duì)于病害防控具有重要意義。

    目前已經(jīng)報(bào)道的西番蓮病毒鑒定方法主要有生物學(xué)檢測、電子顯微鏡檢測、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測等[5]。這些方法在植物病毒鑒定方面均得以成功應(yīng)用,卻也存在一定的局限性。與逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)等傳統(tǒng)分子生物學(xué)檢測方法相比,小RNA測序技術(shù)(small RNA sequencing, sRNA-seq)不僅可以同時(shí)鑒定多種DNA或RNA病毒,還能發(fā)掘新病毒或新分離物,已被廣泛應(yīng)于各種植物病毒鑒定[10-15]。本研究應(yīng)用小RNA測序技術(shù)分析了貴州省疑似病毒侵染的西番蓮樣本,結(jié)合RT-PCR驗(yàn)證了鑒定結(jié)果,克隆了病毒外殼蛋白(coat protein, CP)基因開放閱讀框序列,并對(duì)所鑒定病毒的不同分離物進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析,為貴州西番蓮病毒病的防控奠定了基礎(chǔ)。

    1 ?材料與方法

    1.1 ?材料

    2017年10月—2018年7月在貴州貞豐、鎮(zhèn)寧、望謨、羅甸、平塘和從江采集疑似病毒侵染的西番蓮葉片6份,其中采自平塘的西番蓮品種為‘平塘1號(hào),其他樣本均為‘紫香1號(hào),樣品信息見表1。以健康西番蓮植株作為陰性對(duì)照。

    1.2 ?方法

    1.2.1 ?西番蓮總RNA提取 ?采用TRIzol試劑(Invitrogen,美國)提取6份疑似病毒侵染葉片混合樣品的總RNA,具體方法參照試劑說明書。應(yīng)用Nanodrop 2000檢測總RNA的濃度和純度,Agilent 2100測定RIN值。選取RIN值≥8.0、OD260/280≥1.8、濃度≥50 ng/μL的RNA用于測序文庫構(gòu)建。

    1.2.2 ?西番蓮sRNA 測序 ?應(yīng)用Small RNA Sample Pre Kit (Illumina,美國)構(gòu)建文庫,使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量,稀釋文庫至1 ng/μL,然后使用Agilent 2100對(duì)文庫的插入片段進(jìn)行檢測。庫檢合格后,用HiSeq2000進(jìn)行高通量測序,測序單端讀長為50 nt。sRNA測序委托北京百邁克生物科技有限公司完成。

    1.2.3 ?sRNA的拼接和注釋 ?去除原始數(shù)據(jù)中的低質(zhì)量序列,保留長度為18~35 nt的序列。應(yīng)用Velvet 1.2軟件對(duì)高質(zhì)量的sRNAs進(jìn)行拼接,獲得一系列contigs。將上述contigs在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLASTn和BLASTx比對(duì),得到可能存在的病毒序列并進(jìn)行分類和注釋,確定樣本中可能存在的病毒種類。

    1.2.4 ?病毒RT-PCR驗(yàn)證 ?根據(jù)拼接得到的病毒核酸序列設(shè)計(jì)CMV和TeMV的特異引物(表2),用于RT-PCR檢測。分別以6份疑似病毒侵染的西番蓮葉片總RNA為模板,合成cDNA第一鏈,逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為:總RNA 2?μg,5×M-MLV buffer 4?μL,M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega,美國)40 U,10?μmol/μL隨機(jī)六聚體引物2?μL,10 mmol/L dNTPs 2 μL,RNA酶抑制劑20 U,以無RNA酶的去離子水補(bǔ)充體積至25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?7?℃孵育1 h,70?℃滅活10 min后備用。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系25 μL:10×PCR buffer 2.5 μL、10 mmol/L的dNTPs 2 μL、2.5 μmol/L的上下游引物各1 μL,Taq DNA聚合酶1 U,cDNA 2 μL,去離子水補(bǔ)充體積至25 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4?℃預(yù)變性3 min;94?℃變性30 s,復(fù)性30?s(退火溫度見表1),72?℃延伸90 s,35次循環(huán),最后72?℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物以1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測,純化、克隆并測序。TA克隆及陽性克隆篩選方法參照pGM-T連接克隆試劑盒 (天根生化科技有限公司,北京),隨機(jī)選擇5個(gè)陽性克隆送上海生工測序。獲得的序列應(yīng)用DNAMAN 8進(jìn)行比對(duì)分析。

    1.2.5 ?病毒CP基因克隆及系統(tǒng)發(fā)育分析 ?根據(jù)拼接得到的病毒核酸序列設(shè)計(jì)CMV和TeMV的CP基因開放閱讀框(open reading frame, ORF)擴(kuò)增引物(表2),用于CP基因克隆。PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物克隆測序方法參照1.2.4。在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索已經(jīng)報(bào)道的侵染西番蓮的CMV以及侵染西番蓮等植物的TeMV的CP基因序列,應(yīng)用MEGA 7.0對(duì)兩種病毒不同分離物進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。采用ClustalW進(jìn)行多序列比對(duì),設(shè)置自展值為1000,以Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

    2 ?結(jié)果與分析

    2.1 ?西番蓮sRNA測序結(jié)果分析

    經(jīng)檢測,西番蓮總RNA濃度為422?ng/μL,OD260/280為8.4,總量為9.7?μg,完全符合sRNA測序要求。sRNA測序獲得28 964 784個(gè)reads,除去接頭和低質(zhì)序列后得到了25?994?547個(gè)clean reads,占reads總數(shù)的89.76%。sRNA長度為18~35?nt,其中長度為21 nt的數(shù)量最多,高達(dá)117 303個(gè),其次是22 nt(92 920個(gè))、20 nt (60?100個(gè))和19 nt(38 724個(gè)),25~35 nt的sRNA較少,總和為27 940個(gè)(圖1)。

    序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中的BLAST比對(duì)結(jié)果顯示,183個(gè)contig可以比對(duì)到2種病毒序列,其中69個(gè)contig可比對(duì)到CMV序列,同源性為90%~ 100%;114個(gè)contig可以比對(duì)到TeMV序列,同源性為65%~93%。以CMV和TeMV基因組序列為參照,將所有contig組裝成4段核酸序列,其中3段序列與CMV的RNA1、RNA2和RNA3全長的覆蓋率分別為85.6%、86.1%和72.5%;1段序列與TeMV基因組的覆蓋率為63.3%(表3)。sRNA序列分析結(jié)果表明,6份混合樣本中可能存在CMV和TeMV。

    2.3 ?RT-PCR分析

    為驗(yàn)證sRNA注釋結(jié)果的可靠性,根據(jù)拼接序列設(shè)計(jì)了CMV和TeMV的特異性引物,分別對(duì)6份樣本進(jìn)行RT-PCR檢測。結(jié)果顯示,所有樣品均擴(kuò)增到2種病毒的核酸片段,大小分別為506 bp和398 bp,與預(yù)期大小一致(圖2)。

    將PCR產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn):6個(gè)樣本的CMV擴(kuò)增產(chǎn)物序列完全一致,該序列與侵染香蕉(Musanana)的CMV分離物HS-5(KT302188)的CP基因序列一致性為98%,將侵染貴州西番蓮的CMV命名為CMV-GZ;樣本PT的TeMV擴(kuò)增產(chǎn)物序列與廣西分離物GX1(KJ789129)的CP基因序列一致性最高為99%,將該侵染貴州西番蓮的TeMV命名為TeMV-GZ1;樣本ZF、ZN、WM、LD和CJ的TeMV擴(kuò)增產(chǎn)物得到2種核酸序列,其中一種與樣本PT的擴(kuò)增序列完全一致,另一種與GX1的CP基因序列一致性為94%,將此分離物命名為TeMV-GZ2。以上結(jié)果說明RT-PCR檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠,與sRNA拼接及注釋結(jié)果一致。樣本ZF、ZN、WM、LD和CJ中含有TeMV-GZ1和TeMV-GZ2 2種分離物。

    將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆測序后,分別在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST分析。其中CMV-GZ(MH623077)的CP基因ORF及其氨基酸序列與侵染胡椒(Piper nigrum)的CMV分離物FT (KU255786)的一致性分別為97.1%和100%,與其他侵染西番蓮的分離物CP基因全序列或部分序列的一致性為82.3%~95.9%,與相應(yīng)氨基酸序列的一致性為97.3%~98.6%(表4);TeMV-GZ1(MH623078)與TeMV-GZ2(MH623079)的CP基因ORF及其氨基酸序列一致性分別為96.5%和96.7%,兩者與其他TeMV分離物的CP基因全序列或部分序列的一致性分別為87.8%~ 99.3%和87.8%~98.3%,與相應(yīng)氨基酸序列的一致性為88.3%~98.2%和88.3%~96.7%(表5)。

    為進(jìn)一步明確CMV-GZ、TeMV-GZ1和TeMV-GZ2與已經(jīng)報(bào)道的CMV和TeMV分離物的進(jìn)化關(guān)系,分別以花生矮縮病毒(Peanut stunt virus, PSV, KM823528)和大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus, SMV, FJ548849)為外組,基于CP基因序列構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹。侵染西番蓮的CMV分離物分成2支,其中CMV-GZ(MH623077)與巴西的4個(gè)分離物(AF418574, AF418575, AF418576, AF418577)、韓國分離物CMV-KoPF(KR 535 607)、中國福建分離物CMV-xm-pf來自不同國家和地區(qū)的14個(gè)TeMV分離物分成兩個(gè)類群(圖5),來自印度尼西亞的8個(gè)分離物和來自越南的1個(gè)分離物以較高的后驗(yàn)概率聚為一支,本研究獲得的TeMV-GZ1(MH623078)、TeMV-GZ2(MH623079)分離物與廣西分離物GX1(KJ789129)、泰國分離物Pangda12(AM 40 9187Pangda15(AM409188)組成第2大類群,其中分離物GZ1與中國廣西分離物GX1以較高的后驗(yàn)概率(PP=100%)先聚為一個(gè)分支,而后與分離物GZ2和泰國分離物Pangda12和Pangda15進(jìn)一步相聚成簇(圖5)。相同地區(qū)或寄主來源的分離物優(yōu)先相聚成簇,表現(xiàn)出較強(qiáng)的地理和寄主特異性。

    3 ?討論

    本研究應(yīng)用小RNA測序技術(shù),從6個(gè)疑似病毒侵染樣品的混合cDNA文庫中檢測到CMV和TeMV兩種病毒,進(jìn)一步應(yīng)用RT-PCR進(jìn)行了驗(yàn)證。CMV是雀麥花葉病毒科(Bromoviridae)黃瓜花葉病毒屬(Cucumovirus)的典型成員。紫果西番蓮(Passiflora edulis)被CMV侵染后,嫩葉上有明顯黃點(diǎn)或黃斑,頂部新抽出嫩葉卷曲;老葉有褪綠及黃化現(xiàn)象。病株矮化,花、果明顯減少。黃果西番蓮(Passiflora edulis f. flavicarpa)受侵染也呈典型花葉,老葉上有黃化斑點(diǎn),但病株無明顯矮化現(xiàn)象[16]。TeMV是馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus,PVY)成員之一,侵染西番蓮引起花葉、葉片皺褶和畸形[17]。這兩種病毒侵染西番蓮在貴州省均為首次報(bào)道。

    按照國際病毒分類委員會(huì)關(guān)于馬鈴薯Y病毒的劃分標(biāo)準(zhǔn),即CP基因氨基酸序列一致性低于80%;CP基因或整個(gè)基因組的核苷酸序列一致性低于76%[18]。本研究測定的TeMV-GZ1和TeMV-GZ2分離物CP基因氨基酸、核苷酸序列與已報(bào)道的TeMV分離物一致性最高分別為99.3%、98.3%和98.2%、96.7%,高于80%、76%標(biāo)準(zhǔn),與馬鈴薯Y病毒的劃分標(biāo)準(zhǔn)相符。因此,TeMV-GZ1和TeMV-GZ2是TeMV的兩個(gè)分離物。CMV-GZ的CP基因序列與已報(bào)道的其他分離物的一致性為82.3%~95.9%,介于張璇等[19]報(bào)道的77.1%~100.0%之間,由此可以確定CMV-GZ是CMV的一個(gè)分離物。根據(jù)寄主范圍、致病性、血清性分析和CP核酸序列分析等,CMV株系或分離物可分為亞組I、亞組II[20]以及兩者的重組型[21],其中亞組I進(jìn)一步分為亞組IA和亞組IB。CMV-GZ的CP基因及其氨基酸序列與侵染胡椒的CMV分離物FT(KU255786)CP基因的核苷酸和氨基酸序列一致性分別為97.1%和100%,CMV-GZ可能與FT同屬于亞組IB[22]。RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果表明,6份樣品中均存在兩種病毒,且樣品ZF、ZN、WM、LD和CJ同時(shí)含有TeMV-GZ1和TeMV-GZ2分離物。

    綜合文獻(xiàn)報(bào)道和NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄的病毒序列信息來看,侵染西番蓮的CMV主要分布于澳大利亞、美國、南非、巴西、厄瓜多爾、意大利、中國和韓國[5, 16, 23],系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示,意大利分離物單獨(dú)聚為一支,巴西、厄瓜多爾、中國和韓國分離物聚為一支。侵染西番蓮的TeMV僅在泰國和中國有報(bào)道,而TeMV的其他自然寄主植物廣藿香(Pogostemon cablin)和夜來香(Telosma cordata)主要分布于越南、印度尼西亞等南亞國家。侵染西番蓮的CMV分布更為廣泛,遍布全球西番蓮主產(chǎn)區(qū);TeMV可能源于南亞地區(qū),通過引種或其他途徑傳播到中國。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示,西番蓮TeMV的貴州分離物TeMV-GZ1、TeMV-GZ2與廣西分離物GX1的遺傳距離最小,其次是泰國分離物Pangda12和Pangda15。相同地區(qū)或寄主來源的分離物優(yōu)先相聚成簇,表現(xiàn)出較強(qiáng)的地理和寄主特異性,這與謝麗雪等[6]的研究結(jié)果較為一致,該病毒的適應(yīng)性進(jìn)化可能同時(shí)受地域和寄主植物驅(qū)動(dòng)。

    參考文獻(xiàn)

    Cerqueira-Silva C B M, Concei??o L D H C S, Souza A P, et al. A history of passion fruit woodiness disease with emphasis on the current situation in Brazil and prospects for Brazilian passion fruit cultivation[J]. European Journal of Plant Pathology, 2014, 139: 261-270.

    Ocampo J, Arias J C, Urrea R. Interspecific hybridization between cultivated and wild species of genus Passiflora L. [J]. Euphytica, 2016, 209(2): 395-408.

    李莉萍. 西番蓮綜合開發(fā)利用研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(28): 13840-13843, 13846.

    王秀榮, 段安安, 許玉蘭. 國內(nèi)西番蓮引種栽培現(xiàn)狀及改良思路[J]. 西南林學(xué)院學(xué)報(bào), 2003, 23(2): 88-91.

    嚴(yán)佳文, 袁啟鳳, 彭志軍, 等. 西番蓮病毒病害研究進(jìn)展[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué), 2018, 38(4): 85-94.

    謝麗雪, 張小艷, 鄭 ?姍, 等. 侵染西番蓮的夜來香花葉病毒的分子鑒定及特異性檢測[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, ?50(24): 4725-4734.

    徐平東, 李 ?梅, 柯 ?沖. 福建西番蓮病毒病的發(fā)生及其病原黃瓜花葉病毒亞組鑒定[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 1999, 26(1): 50-54.

    Chang C A. Characterizarion and comparation of passion fruit mottle virus, a newly recognized potyvirus, with passion fruit woodiness virus[J]. Phytopathology, 1992, 82(11): 1358-1363.

    Cheng Y H, Deng T C, Chen C C, et al. First report of Euphorbia leaf curl virus and Papaya leaf curl Guangdong virus on passion fruit in Taiwan[J]. Plant Disease, 2014, 98 (12): 1746.

    蘇 ?秀, 徐 ?毅, 陳 ?莎, 等. 利用小RNA深度測序和組裝技術(shù)鑒定紫藤花葉病病原[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2015, 45(1): 88-92.

    王 ?芳, 高正良, 周本國, 等. 利用小RNA高通量測序技術(shù)檢測玉米病毒[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2017, 47(3): 422-427.

    劉華珍, 楊作坤, 周友斌, 等. 侵染梨的蘋果莖痘病毒基因組序列及小RNA分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2017, 47(5): 584-590.

    馮 ?耿, 辛 ?敏, 曹孟籍, 等. 深度測序發(fā)現(xiàn)貴陽發(fā)生的辣椒病毒病由多種病毒復(fù)合侵染所致[J]. 植物病理學(xué)報(bào), ?2017, 47(5): 591-597.

    車海彥, 曹學(xué)仁, 劉 ?勇, 等. 利用小RNA深度測序技術(shù)鑒定海南南瓜病毒種類[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào), 2017, 38(11): ?2106-2111.

    于 ?翠, 乾義柯, 于子翔, 等. 利用小RNA深度測序技術(shù)從新疆葡萄上檢出8種病毒[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2018, 45(3): 649-650.

    Fischer I H, Rezende J A M. Diseases of passion flower (Passiflora spp.) [J]. Pest Technology, 2008, 2(1): 1-19.

    Chiemsombat P, Prammanee S, Pipattanawong N. Occurrence of Telosma mosaic virus causing passion fruit severe mosaic disease in Thailand and immunostrip test for rapid virus detection[J]. Crop Protection, 2014, 63(5): 41-47.

    Adams M J, Antoniw J F, Fauquet C M. Molecular criteria for genus and species discrimination within the family Potyviridae[J]. Archives of Virology, 2005, 150(3): 459-479.

    張 ?璇, 趙慧琪, 王德富, 等. 黃瓜花葉病毒(CMV)2個(gè)山西分離物CP序列測定及亞組分類分析[J]. 植物病理學(xué)報(bào), 2018, 48(1): 35-45.

    Wahyuni W S, Dietzgen R G, Hanada K, et al. Serological and biological variation between and within subgroup I and II strains of cucumber mosaic virus[J]. Plant Pathology, 1992, 41(3): 282-297.

    Maoka T, Hayano Y S, Iwasaki M, et al. Mixed infection in tomato to ensure frequent generation of a natural reassortant between two subgroups of Cucumber mosaic virus[J]. Virus genes, 2010, 40(1): 148-150.

    劉培培, 車海彥, 曹學(xué)仁, 等. 侵染胡椒的黃瓜花葉病毒海南分離物全序列分析及亞組鑒定[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào), 2016, 7(2): 265-269.

    Parrella G, Sorrentino D. Identification of a cucumber mosaic virus isolate from Passiflora edulis in southern Italy and validation of subgroup identification by In silico restriction fragment length polymorphism[J]. Journal of Phytopathology, 2009, 157: 762-767.

    猜你喜歡
    西番蓮鑒定病毒
    病毒
    西番蓮屬植物化學(xué)成分的研究進(jìn)展
    云南化工(2021年10期)2021-12-21 07:33:16
    感冒病毒大作戰(zhàn)
    幼兒園(2021年16期)2021-12-06 01:06:36
    病毒,快滾開
    康平鎮(zhèn)西番蓮栽培管理技術(shù)及產(chǎn)業(yè)發(fā)展對(duì)策
    感冒病毒
    越南山羅省人民種植西番蓮出口
    淺議檢察機(jī)關(guān)司法會(huì)計(jì)鑒定的主要職責(zé)
    青銅器鑒定與修復(fù)初探
    資治文摘(2016年7期)2016-11-23 00:23:20
    八種氟喹諾酮類藥物人工抗原的合成及鑒定
    亚洲欧美一区二区三区国产| 久久久亚洲精品成人影院| 色综合亚洲欧美另类图片| 综合色av麻豆| 99热这里只有是精品在线观看| 免费人成在线观看视频色| av.在线天堂| 黄片wwwwww| 久久久久久国产a免费观看| videossex国产| 麻豆av噜噜一区二区三区| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 精品久久国产蜜桃| 久久久午夜欧美精品| 国产毛片a区久久久久| 精品国内亚洲2022精品成人| 免费观看精品视频网站| 啦啦啦韩国在线观看视频| 欧美变态另类bdsm刘玥| 成人亚洲精品一区在线观看 | 亚洲av成人精品一区久久| 国产精品1区2区在线观看.| 精品人妻视频免费看| 综合色av麻豆| 干丝袜人妻中文字幕| 久久久久久久久中文| 亚洲精品aⅴ在线观看| 亚洲精品色激情综合| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 少妇高潮的动态图| av免费在线看不卡| 国产亚洲精品久久久com| 国产久久久一区二区三区| 岛国毛片在线播放| 日本wwww免费看| 久久6这里有精品| 超碰97精品在线观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 特级一级黄色大片| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产毛片a区久久久久| 精品国产一区二区三区久久久樱花 | 国产午夜福利久久久久久| 亚洲精品aⅴ在线观看| 深夜a级毛片| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲国产欧美在线一区| 精品一区在线观看国产| 日韩av在线大香蕉| 国产淫片久久久久久久久| 国产乱来视频区| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美3d第一页| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 亚洲精品色激情综合| 99热网站在线观看| 蜜臀久久99精品久久宅男| 黄片无遮挡物在线观看| 日日啪夜夜撸| 五月伊人婷婷丁香| 免费电影在线观看免费观看| 日韩强制内射视频| 日韩成人av中文字幕在线观看| 男插女下体视频免费在线播放| 在线免费十八禁| 国产v大片淫在线免费观看| 亚洲av在线观看美女高潮| 国产淫语在线视频| 国产精品人妻久久久久久| av福利片在线观看| 久久精品国产自在天天线| 亚洲国产精品成人综合色| 亚洲av电影不卡..在线观看| 插逼视频在线观看| 色哟哟·www| 亚洲国产色片| 人妻一区二区av| 国产真实伦视频高清在线观看| 超碰av人人做人人爽久久| 啦啦啦啦在线视频资源| 一个人看的www免费观看视频| www.色视频.com| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产探花在线观看一区二区| 日韩精品青青久久久久久| 激情 狠狠 欧美| 麻豆乱淫一区二区| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 高清日韩中文字幕在线| 乱系列少妇在线播放| 国产午夜精品一二区理论片| 日本色播在线视频| 一个人观看的视频www高清免费观看| 九九爱精品视频在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜 | 午夜福利视频1000在线观看| 久久久欧美国产精品| 免费高清在线观看视频在线观看| 丝袜美腿在线中文| 亚洲在线自拍视频| 日日啪夜夜撸| 久久午夜福利片| 丝袜喷水一区| 久久久午夜欧美精品| 综合色丁香网| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 看免费成人av毛片| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 在现免费观看毛片| 中文资源天堂在线| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲综合色惰| 久久久久久久国产电影| 成人美女网站在线观看视频| 成人亚洲精品一区在线观看 | 日韩精品有码人妻一区| 国产亚洲5aaaaa淫片| 亚洲美女视频黄频| 精品一区在线观看国产| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 少妇熟女欧美另类| 国产在线一区二区三区精| 国产精品不卡视频一区二区| 老司机影院毛片| 国产一区二区三区av在线| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 午夜爱爱视频在线播放| 欧美日本视频| 日韩伦理黄色片| 男插女下体视频免费在线播放| 美女被艹到高潮喷水动态| 2022亚洲国产成人精品| 国产av国产精品国产| 天堂影院成人在线观看| 免费看a级黄色片| 欧美zozozo另类| 老女人水多毛片| 亚洲精品aⅴ在线观看| 一级二级三级毛片免费看| 国产精品久久久久久久久免| 在线天堂最新版资源| 少妇的逼好多水| 久久久久性生活片| 国产精品久久久久久久电影| av一本久久久久| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产高潮美女av| 国产综合精华液| 日本三级黄在线观看| 麻豆久久精品国产亚洲av| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久久国产一区二区| 91久久精品电影网| 亚洲欧美精品专区久久| 亚洲av成人av| 色播亚洲综合网| 水蜜桃什么品种好| 高清毛片免费看| 色5月婷婷丁香| 日韩精品青青久久久久久| 91aial.com中文字幕在线观看| 九色成人免费人妻av| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 亚洲成人久久爱视频| 最近最新中文字幕大全电影3| 久久鲁丝午夜福利片| 中文欧美无线码| 男女国产视频网站| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 美女主播在线视频| 国产亚洲91精品色在线| 搡老乐熟女国产| 亚洲成人av在线免费| 久久精品人妻少妇| xxx大片免费视频| 午夜福利在线观看吧| 欧美成人精品欧美一级黄| 午夜免费观看性视频| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 男女下面进入的视频免费午夜| 亚洲国产欧美人成| 大香蕉97超碰在线| 亚洲av在线观看美女高潮| 人妻一区二区av| 日韩精品青青久久久久久| xxx大片免费视频| 丰满少妇做爰视频| 中文字幕制服av| 搞女人的毛片| 亚洲成人中文字幕在线播放| 国产黄色视频一区二区在线观看| 国产有黄有色有爽视频| 日本av手机在线免费观看| 又爽又黄a免费视频| 男女边摸边吃奶| 亚洲国产精品成人综合色| 成年女人在线观看亚洲视频 | 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 久久久久精品性色| 大陆偷拍与自拍| 亚洲精品国产成人久久av| 亚洲美女搞黄在线观看| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲在久久综合| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 亚洲经典国产精华液单| 一级二级三级毛片免费看| 国产大屁股一区二区在线视频| 婷婷色麻豆天堂久久| 欧美成人a在线观看| av专区在线播放| 在线观看一区二区三区| 欧美丝袜亚洲另类| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 国产精品久久久久久av不卡| 91狼人影院| 97超视频在线观看视频| 亚洲久久久久久中文字幕| 亚洲精品aⅴ在线观看| 69av精品久久久久久| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 一区二区三区高清视频在线| 国产在视频线精品| 三级经典国产精品| 日本免费a在线| 精品久久久噜噜| 欧美bdsm另类| 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 精品一区二区三区视频在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 深爱激情五月婷婷| 久久久精品免费免费高清| 亚洲美女视频黄频| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产av在哪里看| 国产亚洲精品久久久com| 黄色配什么色好看| 欧美性感艳星| 久久久精品免费免费高清| 色综合亚洲欧美另类图片| 久久99热6这里只有精品| 身体一侧抽搐| 亚洲欧美清纯卡通| 夫妻性生交免费视频一级片| 成人漫画全彩无遮挡| 夜夜爽夜夜爽视频| 我的女老师完整版在线观看| 直男gayav资源| 国产亚洲5aaaaa淫片| 国产精品熟女久久久久浪| 少妇熟女aⅴ在线视频| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 丝瓜视频免费看黄片| 久久99精品国语久久久| 97精品久久久久久久久久精品| 99视频精品全部免费 在线| 国产综合精华液| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产成人免费观看mmmm| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产三级在线视频| 99热6这里只有精品| 国产成人精品久久久久久| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频 | 亚洲欧美精品专区久久| 国产乱来视频区| 亚洲精品aⅴ在线观看| 能在线免费看毛片的网站| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 色综合站精品国产| 免费观看精品视频网站| 国产亚洲91精品色在线| 成人美女网站在线观看视频| 亚洲精品乱久久久久久| 最近最新中文字幕大全电影3| 国产一区二区在线观看日韩| videossex国产| 看黄色毛片网站| 少妇被粗大猛烈的视频| 国产免费福利视频在线观看| 午夜福利网站1000一区二区三区| 久久精品综合一区二区三区| 国产69精品久久久久777片| 久久久国产一区二区| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 午夜福利成人在线免费观看| 91狼人影院| 亚洲av中文av极速乱| 一区二区三区四区激情视频| 午夜精品一区二区三区免费看| 91久久精品电影网| 激情五月婷婷亚洲| 91aial.com中文字幕在线观看| 床上黄色一级片| av女优亚洲男人天堂| 国产在线男女| 国产亚洲5aaaaa淫片| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产淫语在线视频| av播播在线观看一区| 亚洲婷婷狠狠爱综合网| 成年女人在线观看亚洲视频 | 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 日本三级黄在线观看| 久久热精品热| 欧美zozozo另类| 中文字幕久久专区| 亚洲精品自拍成人| 久久6这里有精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂 | 狂野欧美激情性xxxx在线观看| a级毛色黄片| 伦精品一区二区三区| 亚洲精品成人久久久久久| 国产乱来视频区| 男女边摸边吃奶| 简卡轻食公司| 男的添女的下面高潮视频| 久久久色成人| 欧美精品一区二区大全| 日韩 亚洲 欧美在线| 边亲边吃奶的免费视频| av女优亚洲男人天堂| 日本黄大片高清| 一本久久精品| 成年女人看的毛片在线观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 夫妻性生交免费视频一级片| 插阴视频在线观看视频| 精品熟女少妇av免费看| 午夜精品在线福利| 国产高潮美女av| 久久久久网色| 男的添女的下面高潮视频| 精品一区二区三区视频在线| 久久久久久九九精品二区国产| 国产片特级美女逼逼视频| 国产一级毛片七仙女欲春2| 国产亚洲精品久久久com| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 一区二区三区乱码不卡18| 色网站视频免费| 六月丁香七月| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲国产最新在线播放| 成年女人看的毛片在线观看| 精品一区二区三区视频在线| 在线观看av片永久免费下载| 51国产日韩欧美| 久久热精品热| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产黄色免费在线视频| 超碰97精品在线观看| 亚洲自拍偷在线| 天堂俺去俺来也www色官网 | 三级国产精品片| 男人舔奶头视频| 免费在线观看成人毛片| 国产精品无大码| 国产精品伦人一区二区| 欧美bdsm另类| 精品久久久久久久久久久久久| 久久久久久伊人网av| 日日啪夜夜爽| 亚洲av福利一区| 精品国内亚洲2022精品成人| 91久久精品国产一区二区三区| 免费看不卡的av| 成人漫画全彩无遮挡| 伦精品一区二区三区| 天美传媒精品一区二区| 看十八女毛片水多多多| 男插女下体视频免费在线播放| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲av日韩在线播放| 五月天丁香电影| 麻豆久久精品国产亚洲av| 成人av在线播放网站| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久精品夜色国产| 精品人妻视频免费看| 国产精品蜜桃在线观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产精品一及| 免费观看精品视频网站| 舔av片在线| 国产伦一二天堂av在线观看| 午夜福利视频精品| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 国产成人a区在线观看| 亚洲av成人av| 18+在线观看网站| 青青草视频在线视频观看| 久久精品国产亚洲av涩爱| 一二三四中文在线观看免费高清| 精品不卡国产一区二区三区| 99久国产av精品国产电影| 91久久精品电影网| 国产亚洲一区二区精品| 又大又黄又爽视频免费| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 99re6热这里在线精品视频| 欧美zozozo另类| 欧美最新免费一区二区三区| 日本欧美国产在线视频| 日韩一本色道免费dvd| 99热6这里只有精品| 国产一区二区三区av在线| 午夜精品国产一区二区电影 | 国产一区二区亚洲精品在线观看| 欧美+日韩+精品| 丝袜美腿在线中文| 免费观看在线日韩| 亚洲精品第二区| 国产黄频视频在线观看| 成年av动漫网址| 99热网站在线观看| 日韩一区二区视频免费看| 乱人视频在线观看| 黄色配什么色好看| 午夜福利视频1000在线观看| 亚洲精品自拍成人| 亚洲国产成人一精品久久久| 美女黄网站色视频| 国产午夜精品一二区理论片| 成人午夜高清在线视频| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 欧美xxxx性猛交bbbb| 亚洲成人精品中文字幕电影| 高清毛片免费看| 亚洲精品色激情综合| 国产在线男女| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 国产男女超爽视频在线观看| 国产精品一区www在线观看| 只有这里有精品99| 亚洲图色成人| 五月玫瑰六月丁香| 中国美白少妇内射xxxbb| 欧美激情在线99| 日本免费在线观看一区| 亚洲精品成人av观看孕妇| 日本午夜av视频| 伊人久久国产一区二区| 国产精品日韩av在线免费观看| 少妇的逼水好多| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 黄色日韩在线| 亚洲国产精品成人久久小说| 黄片无遮挡物在线观看| 天堂影院成人在线观看| 91久久精品国产一区二区三区| 久热久热在线精品观看| 欧美激情在线99| 中文字幕久久专区| 亚洲av福利一区| 亚洲人成网站高清观看| 精品一区二区免费观看| 亚洲不卡免费看| 国产精品av视频在线免费观看| 国产精品伦人一区二区| 91aial.com中文字幕在线观看| 99热这里只有是精品在线观看| 亚洲精品视频女| 午夜激情欧美在线| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 能在线免费观看的黄片| 我的老师免费观看完整版| 一级毛片我不卡| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲高清免费不卡视频| av福利片在线观看| 丰满少妇做爰视频| 精品不卡国产一区二区三区| 一级毛片我不卡| 全区人妻精品视频| 一本一本综合久久| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 午夜福利高清视频| 国产精品久久久久久久久免| 国产精品人妻久久久影院| 国产伦理片在线播放av一区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 日韩av在线免费看完整版不卡| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 一级片'在线观看视频| 内射极品少妇av片p| 男插女下体视频免费在线播放| 中国国产av一级| 亚洲色图av天堂| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 免费观看a级毛片全部| 国产一区有黄有色的免费视频 | 又爽又黄无遮挡网站| 国产 一区精品| 一级av片app| 中文天堂在线官网| 黄片无遮挡物在线观看| 最近的中文字幕免费完整| 欧美精品一区二区大全| 一本久久精品| 久久草成人影院| 深夜a级毛片| 久热久热在线精品观看| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 麻豆久久精品国产亚洲av| 亚洲av免费高清在线观看| 网址你懂的国产日韩在线| 成人午夜高清在线视频| 国产精品1区2区在线观看.| 精品久久久久久久末码| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 成人性生交大片免费视频hd| 日韩精品青青久久久久久| 少妇人妻精品综合一区二区| 国产av在哪里看| 女人被狂操c到高潮| av国产免费在线观看| 干丝袜人妻中文字幕| 亚洲精品日韩av片在线观看| 欧美极品一区二区三区四区| 一级片'在线观看视频| 黄色配什么色好看| 水蜜桃什么品种好| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 秋霞伦理黄片| 精品久久久久久久末码| 免费高清在线观看视频在线观看| 国产综合懂色| 日本免费a在线| 身体一侧抽搐| 中文字幕免费在线视频6| 高清av免费在线| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产人妻一区二区三区在| 久久精品国产自在天天线| 秋霞伦理黄片| 一区二区三区免费毛片| 亚洲真实伦在线观看| 国产 一区 欧美 日韩| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲精品日韩av片在线观看| 日韩电影二区| 午夜福利视频精品| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 国产乱人偷精品视频| 嫩草影院精品99| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产精品伦人一区二区| 少妇的逼好多水| 网址你懂的国产日韩在线| 久久人人爽人人片av| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 日韩国内少妇激情av| 亚洲精品日本国产第一区| 又大又黄又爽视频免费| 免费av观看视频| 免费观看的影片在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 久久这里有精品视频免费| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 人人妻人人澡欧美一区二区| 天堂网av新在线| 色播亚洲综合网| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产高清三级在线| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日韩人妻高清精品专区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 国产精品精品国产色婷婷| 日本黄大片高清| 欧美成人午夜免费资源| 18禁在线播放成人免费| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日本三级黄在线观看| 欧美一区二区亚洲| 国产免费福利视频在线观看| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 乱人视频在线观看| 精品一区二区三区人妻视频| 国产精品久久久久久久久免| 丰满乱子伦码专区| 国产精品久久久久久久电影| 中文字幕制服av| 久久久精品欧美日韩精品| 国内精品美女久久久久久| 高清毛片免费看| 青青草视频在线视频观看| 22中文网久久字幕| 日日啪夜夜爽| 69人妻影院| 神马国产精品三级电影在线观看| 亚洲av成人精品一区久久| 在线观看免费高清a一片| 日韩一本色道免费dvd| 日本一本二区三区精品| 国产成人a∨麻豆精品| 亚洲真实伦在线观看|