外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞與膀胱癌患者臨床特征、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

金一，李江松，李博

聊城市中醫(yī)院泌尿外科，山東 聊城2520000

膀胱癌是發(fā)病率和病死率最高的泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，惡性程度較高，常呈現(xiàn)浸潤性發(fā)展，術(shù)后1年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)超過45%[1]。遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是膀胱癌患者死亡的主要原因，尋找一個(gè)有價(jià)值的血清標(biāo)志物來檢測(cè)膀胱癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移情況具有重要意義。血行轉(zhuǎn)移是多數(shù)惡性腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要途徑，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）在惡性腫瘤血行轉(zhuǎn)移的主要表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶脫落，突破一系列屏障進(jìn)入外周血，形成CTC，然后在一定條件下定植于遠(yuǎn)處器官，形成惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移病灶。早期檢測(cè)血液中的CTC，并實(shí)施干預(yù)，對(duì)惡性腫瘤的治療、預(yù)后評(píng)估和隨訪監(jiān)測(cè)具有重要意義[2]。多項(xiàng)研究證實(shí)，CTC與前列腺癌[3]、非小細(xì)胞肺癌[4]、乳腺癌[5]等多種惡性腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)，可作為預(yù)測(cè)惡性腫瘤患者無瘤生存情況的重要指標(biāo)。目前，關(guān)于CTC與膀胱癌的臨床特征和預(yù)后關(guān)系的研究較少。本研究探討膀胱癌患者術(shù)前外周血CTC與臨床特征的關(guān)系，并分析其對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)效果，旨在為臨床提供參考依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月至2016年6月聊城市中醫(yī)院收治的膀胱癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前均接受血清CTC檢測(cè)；②均接受膀胱癌根治術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前已發(fā)現(xiàn)存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；②合并其他惡性腫瘤；③既往接受放療、化療等任何抗腫瘤治療。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入68例膀胱癌患者，其中男47例，女21例，年齡為51～82歲，平均年齡為（63.2±7.1）歲。

1.2 CanPatrolTM法檢測(cè)外周血CTC水平

所有患者術(shù)前1天清晨空腹采集了肘靜脈血5 ml，保存至乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝管中，混勻，室溫靜置30 min后，2000 r/min，離心20 min，去除上清液。將離心后的沉淀轉(zhuǎn)移至過濾器中過濾，甲醛室溫固定60 min。加入透化劑室溫孵育5 min，加入消化酶室溫孵育60 min，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）洗滌3次。將樣品置于40℃生化培養(yǎng)箱中，依次加入探針工作液孵育180 min，預(yù)擴(kuò)增工作液孵育30 min，擴(kuò)增工作液孵育30 min，顯色工作液孵育30 min，每次加入工作液孵育完成后PBS洗滌3次，最后加入含4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（4’，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）的抗淬滅劑，室溫靜置5 min后直接在顯微鏡下觀察。依據(jù)細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)的顏色判斷CTC的分型，細(xì)胞內(nèi)熒光信號(hào)顏色為綠色判定為間質(zhì)型，紅色判定為上皮型，若同時(shí)存在綠色和紅色熒光信號(hào)，則判定為混合型。

1.3 資料收集和隨訪方法

收集所有患者的基本臨床特征，包括性別、年齡、吸煙史、腫塊數(shù)目、腫瘤直徑、腫瘤位置、病理分級(jí)、TNM分期和合并腎積水情況等。所有患者術(shù)前采用CanPatrolTM法檢測(cè)了外周血CTC，接受膀胱癌根治術(shù)治療，根據(jù)腫瘤浸潤情況和手術(shù)切除結(jié)果等具體情況決定術(shù)后是否進(jìn)行化療及化療。采用門診復(fù)查的方式對(duì)患者進(jìn)行了隨訪，術(shù)后第1年每3～6個(gè)月進(jìn)行1次膀胱鏡復(fù)查，然后每6～12個(gè)月復(fù)查1次，期間若出現(xiàn)血尿等癥狀則及時(shí)復(fù)查膀胱鏡，以腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、死亡或失訪為隨訪終點(diǎn)，隨訪截至2017年6月30日。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)表示，多組間比較采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)；膀胱癌患者術(shù)后1年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的影響因素采用Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生存情況的比較

68例膀胱癌患者中檢出單純間質(zhì)型17例，單純上皮型21例，混合型23例，7例患者未檢出CTC。依據(jù)血清CTC檢測(cè)結(jié)果，將其分為單純間質(zhì)型組（n=17）、單純上皮型組（n=21）、混合型組（n=23）和未檢出組（n=7）。單純間質(zhì)型組、單純上皮型組、混合型組和未檢出組膀胱癌患者術(shù)后中位無進(jìn)展生存期（progress free survive，PFS）分別為12.6、15.7、14.6和17.8個(gè)月，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=23.791，P＜0.01）。本研究主要探討外周血CTC與膀胱癌患者臨床特征，以及術(shù)后1年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，故在后續(xù)研究中剔除未檢出CTC的7例患者。

2.2 基本臨床特征的比較

單純間質(zhì)型組、單純上皮型組和混合型組膀胱癌患者性別、年齡、吸煙史、腫塊數(shù)目、腫瘤直徑、腫瘤位置、合并腎積水情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；但3組膀胱癌患者病理分級(jí)、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=12.163、11.935、5.717，P＜0.05）。（表1）

2.3 膀胱癌患者術(shù)后1年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移影響因素的單因素分析

單因素分析結(jié)果顯示，不同性別、年齡、吸煙史、腫塊數(shù)目、腫瘤直徑、腫瘤位置、合并腎積水情況膀胱癌患者術(shù)后1年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；不同病理分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、CTC分型、術(shù)后輔助化療情況膀胱癌患者術(shù)后1年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

2.4 膀胱癌患者術(shù)后1年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移影響因素的多因素分析

將單因素分析中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素（包括病理分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、CTC分型和術(shù)后輔助化療情況）作為自變量，膀胱癌患者術(shù)后1年出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移作為因變量，納入Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，單純間質(zhì)型CTC、TNM分期為Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未接受術(shù)后輔助化療和病理分級(jí)為Ⅲ級(jí)是膀胱癌患者術(shù)后1年發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。（表3）

表1 3組不同CTC分型膀胱癌患者的基本臨床特征[ n（%）]

表2 61例膀胱癌患者術(shù)后 1年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移影響因素的單因素分析

表2 （續(xù)）

表3 61例膀胱癌患者術(shù)后 1年復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移影響因素的Logistic回歸分析

3 討論

CTC由惡性腫瘤的原發(fā)部位或轉(zhuǎn)移部位釋放并進(jìn)入外周循環(huán)，一般情況下，CTC可被吞噬清除或凋亡，但也有少數(shù)CTC能存活，且由于其與原發(fā)腫瘤具有類似的抗原和遺傳性，可能定植于機(jī)體的某個(gè)部位，形成新的轉(zhuǎn)移灶。目前CTC被認(rèn)為是惡性腫瘤血行轉(zhuǎn)移的重要基礎(chǔ)，一直受到臨床的重視，但外周血中CTC的數(shù)量較少，僅占外周血白細(xì)胞的1/千萬～1/百萬[6]，檢測(cè)有一定困難，對(duì)操作要求較高。白云金等[7]研究表明，78例膀胱癌患者的CTC陽性率為34.6%，而非腫瘤患者均未檢出CTC，且多因素Logistic回歸分析顯示，腫瘤直徑≥3 cm、有肌層浸潤、病理分級(jí)較低的膀胱癌患者CTC陽性率更高。Rink等[8]研究表明，局限性膀胱癌患者外周血CTC陽性率為30%，其總生存率、無進(jìn)展生存率、腫瘤特異性生存率均明顯低于CTC陰性膀胱癌患者，預(yù)后差。本研究采用CanPatrolTM法檢測(cè)CTC的分型情況，采用標(biāo)記有DAPI的探針與擴(kuò)增探針進(jìn)行雜交來產(chǎn)生熒光信號(hào)，以信號(hào)的顏色來判斷CTC是否存在及其分型，是目前較為先進(jìn)的CTC檢測(cè)技術(shù)，其優(yōu)點(diǎn)是不依賴腫瘤特異性抗體，白細(xì)胞去除率和腫瘤細(xì)胞回收率均較高，已逐漸應(yīng)用于臨床[9-12]。

由于惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲性與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，即上皮細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細(xì)胞，因此，CTC主要分為上皮型、間質(zhì)型和混合型。張瑞赟等[12]研究表明，肌層浸潤型膀胱癌患者間質(zhì)型CTC與混合型CTC的陽性率均明顯高于非肌層浸潤型膀胱癌患者，但上皮型CTC的陽性率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明間質(zhì)型CTC可能與腫瘤肌層浸潤相關(guān)。本研究結(jié)果表明，檢出CTC單純間質(zhì)型17例，單純上皮型21例，混合型23例，7例患者未檢出CTC；進(jìn)一步分析表明，單純間質(zhì)型組、單純上皮型組和混合型組膀胱癌患者病理分級(jí)、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；單純間質(zhì)型組膀胱癌患者的中位PFS最短，僅為12.6個(gè)月；多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，單純間質(zhì)型CTC是膀胱癌患者術(shù)后1年出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，與Rink等[13]研究結(jié)果類似。這可能是因?yàn)殚g質(zhì)型CTC是腫瘤細(xì)胞通過修飾自身形態(tài)、骨架結(jié)構(gòu)與黏附分子后轉(zhuǎn)化而成，與上皮型CTC比較，其黏附能力更低，可塑性更強(qiáng)，容易脫落[14]，發(fā)生定植轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)更高，預(yù)后更差，間質(zhì)型CTC對(duì)評(píng)估膀胱癌患者的預(yù)后價(jià)值可能更高。

綜上所述，不同外周血CTC分型可能與膀胱癌患者的病理分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，單純間質(zhì)型的CTC、TNM分期為Ⅲ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后未接受輔助化療和病理分級(jí)為Ⅲ級(jí)為膀胱癌患者術(shù)后1年發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。