局部晚期乳腺癌患者新輔助化療前后 p53、Ki-67、NM23、EGFR的表達(dá)變化及臨床意義△

石國(guó)建，顧蓓，郭斌，榮鳴，張潔，于桑桑

昆山市第二人民醫(yī)院甲乳外科，江蘇 昆山2153000

乳腺癌屬于臨床常見的惡性腫瘤，目前臨床常采用新輔助化療治療局部晚期乳腺癌，效果較好，可明顯提高患者的遠(yuǎn)期生存率[1]。目前臨床主要通過(guò)影像學(xué)檢查評(píng)估新輔助化療的治療效果，但費(fèi)用昂貴，加重了患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，因此尋找預(yù)測(cè)局部乳腺癌新輔助化療療效的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)預(yù)后評(píng)估十分重要。研究顯示，Ki-67、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）及抑癌基因p53和NM23的表達(dá)情況與乳腺癌患者的預(yù)后有關(guān)，但其與新輔助化療的療效是否有關(guān)目前尚不明確[2-4]。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)局部晚期乳腺癌患者新輔助化療前后p53、Ki-67、NM23、EGFR的表達(dá)水平，旨在探討其與患者療效及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2014年11月至2015年5月昆山市第二人民醫(yī)院收治的局部晚期乳腺癌患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)為乳腺癌；②臨床分期為Ⅱ～Ⅲ期，符合美國(guó)國(guó)家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；③接受新輔助化療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤；②合并肺、肝、膽、腎等重要器官受損；③臨床資料不完整。根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入112例乳腺癌患者。112例患者的年齡為27～68歲，平均（43.68±6.29）歲；腫瘤直徑為1.32～7.66 cm，平均（3.89±0.47）cm；TNM分期：ⅡA期36例，ⅡB期28例，ⅢA期25例，ⅢB期23例。

1.2 化療方案

新輔助化療方案主要包括氟尿嘧啶+表柔比星+環(huán)磷酰胺序貫多西他賽（FEC-T）方案和多西他賽+表柔比星+環(huán)磷酰胺（TEC）方案。FEC-T方案：靜脈滴注500 mg/m2氟尿嘧啶，第1天；靜脈滴注90 mg/m2表柔比星，第1天；靜脈滴注500 mg/m2環(huán)磷酰胺，第1天；21天為1個(gè)周期。3個(gè)周期后給予100 mg/m2多西他賽，第1天，21天為1個(gè)周期。TEC方案：靜脈滴注75 mg/m2多西他賽，第1天；靜脈滴注90 mg/m2表柔比星，第1天；靜脈滴注500 mg/m2環(huán)磷酰胺，第1天；21天為1個(gè)周期。治療3個(gè)周期后評(píng)定療效。

1.3 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

依據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）制定的實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[6]對(duì)患者進(jìn)行療效評(píng)價(jià)：完全緩解（complete response，CR），所有病灶均消失，至少維持4周；部分緩解（partial response，PR），病灶最大直徑及最大垂直直徑的乘積減少50%以上，至少維持4周；疾病穩(wěn)定（stable disease，SD），病灶最大直徑及最大垂直直徑的乘積縮小不超過(guò)50%或增加不超過(guò)25%，至少維持4周；疾病進(jìn)展（progressive disease，PD），病灶最大直徑及最大垂直直徑的乘積增加超過(guò)25%，或出現(xiàn)新病灶。CR+PR為有效，SD+PD為無(wú)效?？傆行?（CR+PR）例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.4 免疫組織化學(xué)染色法

所有患者均進(jìn)行空芯針活檢穿刺獲得病理標(biāo)本，經(jīng)4%甲醛固定后制備石蠟組織切片（4 μm），置于二甲苯中脫蠟，梯度乙醇脫水。將切片置于檸檬酸鈉溶液中孵育20 min，3%過(guò)氧化氫中孵育10 min，10%正常山羊血清中孵育30 min，添加前B細(xì)胞白血病同源盒基因3（pre-B-cell leukemia transcription factor 3，PBX3）一抗，4℃孵育過(guò)夜，添加生物素化的二抗，孵育30 min，隨后添加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素，孵育15 min。磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后，添加100 μl二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）溶液，顯微鏡下觀察直至顯色，水洗后添加蘇木精進(jìn)行復(fù)染，氨水返藍(lán)后用自來(lái)水沖洗。最后，將切片在乙醇中脫水，并在二甲苯中透明。

1.5 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

p53、Ki-67均定位于細(xì)胞核，NM23定位于細(xì)胞質(zhì)，EGFR定位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞膜。由2名資深病理科醫(yī)師以半定量法[7]進(jìn)行評(píng)分。陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分：＜5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。最終得分為陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比評(píng)分和染色強(qiáng)度評(píng)分乘積，≥6分為陽(yáng)性，＜6分為陰性。

1.6 隨訪方法

所有患者均隨訪3年，主要采用電話、復(fù)診、信件聯(lián)系的方式進(jìn)行隨訪，記錄患者從開始治療到死亡的時(shí)間。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；采用Logistic回歸分析進(jìn)行多因素分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化療前后p53、Ki-67、NM23、EGFR陽(yáng)性表達(dá)情況的比較

化療后乳腺癌患者p53、Ki-67、EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率均低于化療前，NM23陽(yáng)性表達(dá)率高于化療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表1）

表1 112例乳腺癌患者化療前后 p53、Ki-67、NM23、EGFR陽(yáng)性表達(dá)情況的比較[ n（%）]

2.2 化療前 p53、Ki-67、NM23、EGFR表達(dá)情況與化療療效的關(guān)系

化療后，PR患者12例，CR患者63例，SD患者33例，PD患者4例。有效患者75例，無(wú)效患者37例，總有效率為66.96%（75/112）?；熐皃53、Ki-67、EGFR陰性患者的化療有效率高于p53、Ki-67、EGFR陽(yáng)性患者，而NM23陰性患者的化療有效率低于NM23陽(yáng)性患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 化療前 p53、Ki-67、NM23、EGFR表達(dá)情況與乳腺癌患者化療療效的關(guān)系（n=112）

2.3 不同臨床特征乳腺癌患者化療療效的比較

不同年齡、病理類型、臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的乳腺癌患者的化療療效比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同組織學(xué)分級(jí)的乳腺癌患者的化療療效比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

2.4 乳腺癌患者化療療效影響因素的多因素分析

以化療前p53、Ki-67、NM23、EGFR表達(dá)情況和組織學(xué)分級(jí)為自變量，患者化療是否有效為因變量進(jìn)行Logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示，組織學(xué)分級(jí)為Ⅲ級(jí)及p53、Ki-67、EGFR陽(yáng)性表達(dá)是影響乳腺癌患者化療療效的危險(xiǎn)因素，NM23陽(yáng)性表達(dá)是影響患者化療療效的保護(hù)因素（P＜0.05）。（表4）

表3 不同臨床特征乳腺癌患者化療療效的比較（n=112）

表4 112例乳腺癌患者化療療效影響因素的Logistic多因素回歸分析

2.5 化療前p53、Ki-67、NM23、EGFR表達(dá)情況與預(yù)后的關(guān)系

隨訪3年，無(wú)失訪者，39例患者死亡，生存率為65.18%（73/112）。化療前p53、Ki-67、EGFR陽(yáng)性患者的3年生存率均低于p53、Ki-67、EGFR陰性患者，NM23陽(yáng)性患者的3年生存率高于NM23陰性患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表5）

表5 化療前 p53、Ki-67、NM23、EGFR表達(dá)情況與乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)系（n=112）

3 討論

新輔助化療在局部晚期乳腺癌治療中應(yīng)用廣泛，可降低患者的臨床分期，保留乳房，提高患者生存率，并可根據(jù)治療效果指導(dǎo)后續(xù)治療方案的制訂。大部分乳腺癌患者進(jìn)行新輔助化療后腫瘤顯著縮小，患者術(shù)后生存率提高，在治療過(guò)程中部分生物學(xué)指標(biāo)發(fā)生變化，這些生物學(xué)指標(biāo)在評(píng)估患者化療效果及預(yù)后方面具有重要的臨床意義。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖類抗原153（carbohydrate antigen 153，CA153）在乳腺癌患者血清中均呈高表達(dá),且與患者化療及組織學(xué)分級(jí)有關(guān)[8]。李文華和張瑩[9]的研究顯示，新輔助化療療效較差的乳腺癌患者雌激素受體（estrogen receptor，ER）和孕激素受體（progestogen receptor，PR）的表達(dá)水平有升高趨勢(shì)，ER和PR可作為新輔助化療療效的預(yù)測(cè)指標(biāo)。因此，分析乳腺癌患者新輔助化療前后生物學(xué)指標(biāo)的變化，對(duì)于療效判定、預(yù)后評(píng)估及治療方案的調(diào)整具有十分重要的意義。

p53定位于染色體17p13.1，在肺癌、胃癌、肝癌等惡性腫瘤中，超過(guò)50%的p53基因會(huì)發(fā)生突變，因此經(jīng)免疫印跡檢測(cè)的p53蛋白一般為突變后的p53蛋白[10]。汪小霞等[11]報(bào)道，乳腺癌中p53的陽(yáng)性表達(dá)率為40%；Liu等[12]報(bào)道，乳腺癌中p53的陽(yáng)性表達(dá)率為30%。本研究結(jié)果顯示，新輔助化療后乳腺癌患者的p53陽(yáng)性表達(dá)率為25.89%，低于新輔助化療前的38.39%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。研究顯示，p53與乳腺癌化療療效有關(guān)，是化療療效的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[13]。另有研究顯示，上調(diào)p53的表達(dá)能夠在乳腺癌治療中發(fā)揮較好的抗腫瘤作用[12]。本研究結(jié)果顯示，化療前p53陽(yáng)性患者的有效率低于p53陰性患者（P＜0.05）。Logistic分析結(jié)果顯示，p53是乳腺癌新輔助化療患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。生存分析顯示，化療前p53表達(dá)情況與患者的遠(yuǎn)期預(yù)后有關(guān)。

Ki-67為細(xì)胞核蛋白，與細(xì)胞分裂、增殖有關(guān)，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展及細(xì)胞增殖、分化、凋亡中發(fā)揮重要作用。研究顯示，乳腺癌組織中Ki-67的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于良性乳腺組織，且隨著腫瘤分期的升高及腫瘤直徑的增加，其陽(yáng)性表達(dá)率逐漸升高[14]。另有研究顯示，Ki-67與乳腺癌患者新輔助化療療效有關(guān)，其在化療后表達(dá)水平降低[15]。劉現(xiàn)義等[16]研究顯示，385例乳腺癌患者接受新輔助化療后的Ki-67陽(yáng)性表達(dá)情況發(fā)生明顯變化，Ki-67是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素。本研究結(jié)果顯示，新輔助化療后乳腺癌患者的Ki-67陽(yáng)性表達(dá)率低于新輔助化療前，化療前Ki-67陽(yáng)性患者的有效率低于Ki-67陰性患者（P＜0.05）。Logistic分析結(jié)果顯示，Ki-67是乳腺癌新輔助化療患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。生存分析顯示，化療前Ki-67表達(dá)情況與患者的遠(yuǎn)期預(yù)后有關(guān)。

NM23為腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，位于染色體17號(hào)長(zhǎng)臂。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組織中NM23的陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于良性乳腺組織，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的NM23陽(yáng)性表達(dá)率明顯低于淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的患者，提示NM23與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切[17]。另有研究顯示，NM23與乳腺癌患者的預(yù)后有關(guān)，其表達(dá)水平降低導(dǎo)致對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移的抑制能力減弱，因此患者預(yù)后較差[18]。本研究結(jié)果顯示，新輔助化療后乳腺癌患者的NM23陽(yáng)性表達(dá)率高于新輔助化療前，化療前NM23陽(yáng)性患者的有效率高于NM23陰性患者（P＜0.05）。Logistic分析結(jié)果顯示，NM23是乳腺癌新輔助化療患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。生存分析顯示，化療前NM23表達(dá)情況與患者的遠(yuǎn)期預(yù)后有關(guān)。

EGFR定位于染色體7p11上，在調(diào)控細(xì)胞有絲分裂、細(xì)胞周期等方面發(fā)揮重要作用。EGFR能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移，已成為腫瘤治療的靶點(diǎn)。李雅婷等[19]研究顯示，EGFR過(guò)表達(dá)的腫瘤細(xì)胞分化程度較低，患者易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差。臨床研究顯示，乳腺癌患者中EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于良性乳腺疾病患者，隨訪結(jié)果顯示，復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移患者中EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率高于未復(fù)發(fā)及未轉(zhuǎn)移的患者，提示EGFR可作為預(yù)測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的指標(biāo)[20]。本研究結(jié)果顯示，新輔助化療后乳腺癌患者的EGFR陽(yáng)性表達(dá)率低于新輔助化療前，化療前EGFR陽(yáng)性患者的有效率低于EGFR陰性患者（P＜0.05）。Logistic分析結(jié)果顯示，EGFR是乳腺癌新輔助化療患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。生存分析顯示，化療前EGFR表達(dá)情況與患者的遠(yuǎn)期預(yù)后有關(guān)。

綜上所述，新輔助化療后 p53、Ki-67、NM23、EGFR的陽(yáng)性表達(dá)率均有變化，化療前上述指標(biāo)的表達(dá)情況與化療后療效及遠(yuǎn)期預(yù)后有關(guān)，可作為預(yù)測(cè)新輔助化療療效的指標(biāo)。本研究存在一定的局限性，病例數(shù)較少，后續(xù)還需納入更多病例，以期為乳腺癌的預(yù)防、治療提供更有力的依據(jù)。