FOXO 3抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)的體外實(shí)驗(yàn)研究

何笑凱，康鄭軍，柴蘊(yùn)珠鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院泌尿外科，鄭州455鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，鄭州45

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)的惡性腫瘤，其發(fā)病率在全部泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤中位居首位[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，膀胱癌的發(fā)病率和病死率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[2]。膀胱癌發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，是多種基因、多種因素共同作用的結(jié)果，手術(shù)治療和手術(shù)后的輔助治療是目前治療膀胱癌的主要手段，但是仍然存在膀胱癌患者手術(shù)后高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象[3]。研究膀胱癌的發(fā)病機(jī)制對(duì)于膀胱癌的治療具有重要意義。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3（forkhead box O3，F(xiàn)OXO3）是FOX家族的成員之一，能夠調(diào)控細(xì)胞核內(nèi)的靶基因轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞生物學(xué)功能的發(fā)揮[4]。FOXO3參與肝癌、乳腺癌、卵巢癌等多種腫瘤的生物學(xué)行為，與腫瘤患者的預(yù)后有關(guān)[5]。有研究表明，F(xiàn)OXO3能夠抑制胃癌、肝癌等腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[6-7]。為了探討FOXO3對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，本研究以膀胱癌細(xì)胞為研究對(duì)象，運(yùn)用噻唑藍(lán)（methyl thiazolyldiphenyl tetrazolium，MTT）和細(xì)胞克隆形式實(shí)驗(yàn)等生物學(xué)手段，探討FOXO3對(duì)膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，為靶向FOXO3治療膀胱癌提供理論參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱癌T24細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；兔抗FOXO3多克隆抗體、兔抗β-鏈蛋白（β-catenin）多克隆抗體、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）多克隆抗體、兔抗磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)STANT公司；RNA提取試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biomiga公司；FOXO3-pcDNA3.1和pcDNA3.1質(zhì)粒由鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存；FOXO3、GAPDH引物由美國(guó)Invitrogen公司合成；胎牛血清、青霉素、鏈霉素均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶、DMEM、MTT均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 膀胱癌細(xì)胞T24在10%胎牛血清、青霉素和鏈霉素濃度均為100 U/ml的DMEM中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2飽和濕度，細(xì)胞濃度保持（2～6）×105/ml。所有實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，培養(yǎng)至融合度為70%后，加入0.25%的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞以2×106/孔種植到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)到占滿培養(yǎng)皿底部面積70%時(shí)，將培養(yǎng)液吸去。將FOXO3-pcDNA3.1、pcDNA3.1與DMEM混合后靜置5 min，與LipofectamineTM2000混合，在室溫條件下孵育20 min。取400 μl的上述混合液加入到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，6 h后加入1 ml的細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h。將轉(zhuǎn)染FOXO3-pcDNA3.1和pcDNA3.1的T24細(xì)胞分別記為FOXO3組、Vector組，將沒有轉(zhuǎn)染的T24細(xì)胞記為對(duì)照組。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction ，RT-PCR）檢 測(cè)FOXO 3 mRNA表達(dá) 對(duì)照組、Vector組、FOXO3組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，RT-PCR檢測(cè)FOXO3 mRNA的表達(dá)。FOXO3正義序列：5'-AACCTTCTGATGTAAGTTAC-3'，反義序列：5'-GTGATTGCCTTCAGGATTAC-3'。GAPDH正義序列：5'-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'，反義序列：5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。以 2-△△Ct法計(jì)算FOXO3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）法檢測(cè)FOXO 3蛋白表達(dá) 對(duì)照組、Vector組、FOXO3組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，倒掉培養(yǎng)液，加入冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌后，進(jìn)行細(xì)胞裂解，4℃、12 000 r/min離心10 min，將上清液吸取至1.5 ml的EP管中。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。80 V電壓電泳4 h，觀察目的蛋白分子量的標(biāo)記進(jìn)入距離玻璃板底1 cm處。60 mA電流轉(zhuǎn)膜80 min。5%牛血清白蛋白室溫封閉2 h，加入1∶1000稀釋的一抗，4℃搖晃過夜，加入1∶2000稀釋的二抗，在室溫環(huán)境下孵育2 h。用ChemiDoc XRS+System曝光機(jī)曝光，用Image LabTM software掃描灰度值。以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值作為蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 對(duì)照組、Vector組、FOXO3組細(xì)胞用胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)，使每100 μl的培養(yǎng)液中含有4000個(gè)細(xì)胞，種植到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每組設(shè)置4個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，每孔加入10 μl的MTT溶液進(jìn)行處理，孵育4 h后，將培養(yǎng)板取出，棄上清，依次在每個(gè)孔中重新加入100 μl的二甲基亞砜溶液，振蕩反應(yīng)5 min。觀察藍(lán)紫色的結(jié)晶溶解以后，酶標(biāo)儀于570 nm的波長(zhǎng)處測(cè)量光密度（optical density，OD）值。同時(shí)用 Western blot法檢測(cè)培養(yǎng)24 h后各組細(xì)胞中β-catenin、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)水平，步驟同上。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.2.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞克隆形成能力 對(duì)照組、Vector組、FOXO3組細(xì)胞接種到6孔板中，密度為200/孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2培養(yǎng)14天后，待肉眼觀察形成細(xì)胞克隆后，停止培養(yǎng)，將培養(yǎng)液吸除后，加入PBS洗滌兩次，用10 g/L的戊二醛固定，用5 g/L的結(jié)晶紫染色，用水沖洗幾次后，干燥，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，置于顯微鏡下計(jì)數(shù)，含有10個(gè)以上的細(xì)胞記為1個(gè)克隆。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FOXO 3表達(dá)情況的比較

Vector組細(xì)胞中FOXO3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；FOXO3組細(xì)胞中FOXO3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（圖1、表1）

圖1 Western blot法檢測(cè)對(duì)照組、Vector組、FOXO 3組細(xì)胞中FOXO 3蛋白表達(dá)情況

表1 對(duì)照組、Vector組、FOXO3組細(xì)胞中FOXO3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較±s）

表1 對(duì)照組、Vector組、FOXO3組細(xì)胞中FOXO3 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較±s）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

FOXO3 mRNA 1.00±0.12 0.99±0.13 2.04±0.23*233.466 0.000 0.12±0.03 0.13±0.04 0.35±0.06*74.803 0.000對(duì)照組Vector組FOXO3組F值P值FOXO3蛋白組別

2.2 細(xì)胞增殖情況的比較

Vector組細(xì)胞OD值與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；FOXO3組細(xì)胞OD值低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 對(duì)照組、Vector組、FOXO 3組細(xì)胞中OD值的比較± s）

表2 對(duì)照組、Vector組、FOXO 3組細(xì)胞中OD值的比較± s）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

OD值0.89±0.04 0.88±0.07 0.56±0.05*211.400 0.000對(duì)照組Vector組FOXO3組F值P值組別

2.3 細(xì)胞克隆形成能力的比較

Vector組細(xì)胞克隆數(shù)目與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；FOXO3組細(xì)胞克隆數(shù)目低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

表3 對(duì)照組、Vector組、FOXO 3組細(xì)胞克隆數(shù)目的比較±s）

表3 對(duì)照組、Vector組、FOXO 3組細(xì)胞克隆數(shù)目的比較±s）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

細(xì)胞克隆數(shù)目46.78±5.63 44.26±4.69 25.36±2.34*125.090 0.000對(duì)照組Vector組FOXO3組F值P值組別

2.4 β-catenin、AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較

Vector組細(xì)胞中β-catenin、p-AKT、AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；FOXO3組細(xì)胞中AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；FOXO3組細(xì)胞中β-catenin、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2、表4）

圖2 Western blot法檢測(cè)對(duì)照組、Vector組、FOXO 3組細(xì)胞中 β-catenin、AKT、p-AKT蛋白表達(dá)情況

表4 對(duì)照組、Vector組、FOXO 3組細(xì)胞中 β-catenin、AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（± s）

表4 對(duì)照組、Vector組、FOXO 3組細(xì)胞中 β-catenin、AKT、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較（± s）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

β-catenin 0.26±0.03 0.24±0.04 0.16±0.03*22.235 0.000 0.18±0.02 0.17±0.04 0.03±0.02*79.125 0.000 0.96±0.09 0.94±0.10 0.95±0.08 0.110 0.896對(duì)照組Vector組FOXO3組F值P值p-AKT AKT組別

3 討論

FOXO3是存在于細(xì)胞內(nèi)的重要信號(hào)轉(zhuǎn)錄因子，參與調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、代謝等過程[8]。FOXO3無(wú)論是在正常細(xì)胞還是在腫瘤細(xì)胞中均參與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞生長(zhǎng)等生物學(xué)過程，是細(xì)胞存活的長(zhǎng)壽基因[9]。近年來(lái)的研究顯示，F(xiàn)OXO3在腫瘤發(fā)生、腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞耐受、腫瘤代謝等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用[10]。FOXO3含有FOX結(jié)構(gòu)域，是目前研究最為完善的FOX家族成員[11]。FOXO3不僅可以通過與靶基因的結(jié)構(gòu)域結(jié)合調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，還可以通過影響細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。FOXO3在多種腫瘤中異常表達(dá)，并且與腫瘤的分期等有關(guān)[13]。梁超[14]的研究表明，F(xiàn)OXO3與肝細(xì)胞肝癌的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等有關(guān)。Lu等[15]的研究顯示，S型雌馬酚可以通過作用于FOXO3影響前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡等生物學(xué)行為。

有研究表明，F(xiàn)OXO3能夠與細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路的關(guān)鍵因子如β-catenin、AKT相互作用，形成多線條、立體的調(diào)控系統(tǒng)[16]。WNT信號(hào)通路是一個(gè)較為保守的信號(hào)通路，在線蟲或人體等多種動(dòng)物體內(nèi)均有表達(dá)，在細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、遷移、凋亡等過程中具有十分重要的作用[17]。WNT異常與結(jié)腸癌、胃癌、膀胱癌等腫瘤的發(fā)生有關(guān)。β-catenin是WNT信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白，激活后其表達(dá)水平升高[18]。AKT信號(hào)通路參與細(xì)胞的生長(zhǎng)，在人體內(nèi)的多個(gè)組織和器官內(nèi)發(fā)揮調(diào)控作用。AKT信號(hào)通路在腫瘤中過度活化，其磷酸化水平異常升高[19]。Luo等[20]的研究顯示，亞硒酸鈉可以通過作用于AKT/β-catenin/FOXO3誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的凋亡。

本研究對(duì)體外膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染了FOXO3過表達(dá)載體，RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示FOXO3過表達(dá)載體能夠促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞中FOXO3 mRNA和蛋白的表達(dá)，成功構(gòu)建了高表達(dá)FOXO3的膀胱癌細(xì)胞。MTT和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高表達(dá)FOXO3的膀胱癌細(xì)胞OD值下降，細(xì)胞克隆數(shù)目也減少，說(shuō)明FOXO3抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)。進(jìn)一步通過Western blot法檢測(cè)β-catenin、p-AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO3還能抑制膀胱癌細(xì)胞中β-catenin、p-AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)量。這提示，F(xiàn)OXO3可能通過抑制β-catenin、p-AKT表達(dá)阻礙膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

綜上所述，F(xiàn)OXO3能夠在體外抑制膀胱癌細(xì)胞生長(zhǎng)，這可能與FOXO3阻斷WNT信號(hào)通路和AKT信號(hào)通路有關(guān)，其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。本研究具有一定的局限性，對(duì)于FOXO3在其他多種膀胱癌細(xì)胞中的作用還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為靶向FOXO3治療膀胱癌提供了依據(jù)，為研究FOXO3在腫瘤中的作用奠定了基礎(chǔ)。