E 盒結(jié)合鋅指蛋白2基因?qū)β殉舶┘?xì)胞侵襲及遷移影響的實(shí)驗(yàn)研究

張寧，左麗，肖謎，應(yīng)江山

復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院閔行分院（上海市閔行區(qū)腫瘤醫(yī)院）腫瘤內(nèi)科，上海2002400

卵巢癌的病死率在婦科腫瘤中位居首位，也是女性生殖系統(tǒng)中最為常見的惡性腫瘤[1]。據(jù)統(tǒng)計，超過70%的卵巢癌患者在確診時已經(jīng)處于晚期，并且大多數(shù)已經(jīng)發(fā)生了盆腹腔轉(zhuǎn)移[2]。易轉(zhuǎn)移是卵巢癌細(xì)胞的生物學(xué)特性之一，也是腫瘤致死的重要原因，而腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力決定著腫瘤的轉(zhuǎn)移能力[3]。E盒結(jié)合鋅指蛋白2（zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2）在人類胚胎神經(jīng)中樞系統(tǒng)發(fā)育中發(fā)揮調(diào)控作用，能夠通過調(diào)控上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化影響神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育[4]。很多體外實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，ZEB2能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[5]。已有研究報道稱，多種腫瘤組織中均發(fā)現(xiàn)ZEB2表達(dá)上調(diào)，并且與腫瘤的轉(zhuǎn)移、預(yù)后、惡性程度等有關(guān)[6]。關(guān)于ZEB2對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響尚不十分明確，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討沉默ZEB2對卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及材料

卵巢癌細(xì)胞株SKOV3由復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。ZEB2短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA）、shRNA陰性對照（shRNA-NC）均購自美國Thermo公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國GeneCopoeia公司；實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量檢測試劑盒購自德國QIAGEN公司；總RNA抽提試劑Trizol購自北京中生瑞泰科技有限公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒購自瑞士Roche公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chemiluminescence，ECL）顯色試劑盒購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；Transwell小室購自北京明陽科華生物科技有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基購自武漢普諾賽（Procell）生命科技有限公司；ZEB2、β肌動蛋白（βactin）引物均由南京金斯瑞公司合成；兔抗基質(zhì)金屬蛋白酶 2（matrix metalloprotease 2，MMP2）一抗、兔抗波形蛋白（vimentin）一抗、兔抗β-actin一抗均購自美國R&D Systems公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

SKOV3細(xì)胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2，飽和濕度培養(yǎng)箱。觀察細(xì)胞密度≥80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。將傳代培養(yǎng)后的SKOV3細(xì)胞分為Control組、ZEB2 shRNA組、shRNA-NC組3組。ZEB2 shRNA組、shRNA-NC組分別轉(zhuǎn)染ZEB2 shRNA和shRNA-NC，Control組不進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。

1.3 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染效果

取Control組以及轉(zhuǎn)染后的shRNA-NC組、ZEB2 shRNA組細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，加入Trizol（每106個細(xì)胞中加入1 ml Trizol），吹打混勻后，在室溫下靜置5 min，加入300 μl氯仿溶液，上下劇烈振蕩15 s后在室溫條件下靜置3 min，12 000 r/min，4℃離心15 min。吸取上層水相層溶液400 μl，加入500μl的異丙醇混合后，室溫孵育10min，12000r/min，4℃離心15 min，棄上清液。在RNA沉淀中加入75%乙醇 1 ml，混合后，12 000 r/min，4℃離心15 min，吸除上清液，晾干后，加入無RNA酶的滅菌水，保存于-80℃。每組取2 μl的RNA樣品，用無RNA酶的滅菌水稀釋為100 μl，用紫外分光光度計檢測RNA的濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。RT-PCR檢測分析ZEB2的表達(dá)，ZEB2上游引物為 5'-CAAGGAGCAGGTAATCGCAAGT-3'，下游引物為 5'-GGAACCAGAATGGGAGAAACG-3'。βactin上游引物為5'-TTCCAGCCTTCCTTCCTGGG-3'，下游引物為5'-TTGCGCTCAGGAGGAGCAAT-3'。反應(yīng)條件：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，31 s；共40個循環(huán)。以2-△△Ct法計算ZEB2 mRNA的相對表達(dá)量。

1.4 蛋白質(zhì)印跡（Westernblot）法檢測ZEB 2、MMP 2、vimentin蛋白相對表達(dá)量

取Control組以及轉(zhuǎn)染后的shRNA-NC組、ZEB2 shRNA組細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，按照蛋白提取試劑盒說明書提取蛋白，用BCA定量檢測試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液混合煮沸5 min。蛋白電泳：10%分離膠和5%濃縮膠，在濃縮膠中使用90 V電壓電泳，在分離膠中使用120 V電壓電泳；轉(zhuǎn)膜：90 V恒壓，4℃轉(zhuǎn)膜80 min。封閉：5%脫脂奶粉，室溫封閉60 min；一抗孵育：1∶1000倍稀釋，4℃過夜；二抗孵育：1∶2000倍稀釋，室溫結(jié)合60 min；ECL顯色，曝光，用凝膠成像分析系統(tǒng)對目的蛋白樣品進(jìn)行定量檢測，以目的蛋白/β-actin表示目的蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.5 Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲能力

在侵襲實(shí)驗(yàn)前用基質(zhì)膠濕化Transwell小室30 min。將Control組、shRNA-NC組、ZEB2 shRNA組細(xì)胞用不含有胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整為5×104/ml的細(xì)胞懸浮液。在小室的下室中加入1 ml的含有胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，在上室中加入2 ml的細(xì)胞懸浮液。24 h后，輕輕用棉簽把未穿膜的細(xì)胞擦凈，95%乙醇固定20 min，蘇木素染色后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野，觀察計數(shù)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.6 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

將Control組、shRNA-NC組、ZEB2 shRNA組細(xì)胞接種到24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，接種密度為2×105/孔，每組設(shè)置3個復(fù)孔。待細(xì)胞融合度超過90%時，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用移液槍槍頭在細(xì)胞上垂直劃出一條直線，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌3次。分別在0 h和24 h觀察劃痕的距離，遷移率=（距離0h-距離24h）÷距離0h×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZEB 2表達(dá)情況的比較

shRNA-NC組細(xì)胞中ZEB2 mRNA及蛋白相對表達(dá)量與Control組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。ZEB2 shRNA組細(xì)胞中ZEB2 mRNA和蛋白相對表達(dá)量均低于Control組和shRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（圖1、表1）

圖1 Western blot檢測各組細(xì)胞中ZEB 2蛋白表達(dá)情況

表1 各組細(xì)胞中ZEB 2 mRNA與蛋白相對表達(dá)量的比較± s）

表1 各組細(xì)胞中ZEB 2 mRNA與蛋白相對表達(dá)量的比較± s）

注：a與Control組比較，P＜0.05；b與shRNA-NC組比較，P＜0.05

ZEB2 mRNA 1.00±0.09 0.98±0.13 0.28±0.04a b 56.887 0.000 ZEB2蛋白0.85±0.07 0.87±0.06 0.17±0.03a b 152.043 0.000組別Control組shRNA-NC組ZEB2 shRNA組F值P值

2.2 細(xì)胞侵襲、遷移能力的比較

shRNA-NC組細(xì)胞遷移率、侵襲細(xì)胞數(shù)目與Control組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。ZEB2 shRNA組細(xì)胞遷移率均低于Control組和shRNA-NC組，侵襲細(xì)胞數(shù)目均少于Control組和shRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（表2）

表2 各組細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)目的比較（± s）

表2 各組細(xì)胞遷移率和侵襲細(xì)胞數(shù)目的比較（± s）

注：a與Control組比較，P＜0.05；b與shRNA-NC組比較，P＜0.05

細(xì)胞遷移率（%）40.64±2.54 42.91±3.28 18.69±1.59a b 81.586 0.000侵襲細(xì)胞數(shù)目92.36±12.56 93.73±11.84 42.94±6.21a b 22.394 0.002組別Control組shRNA-NC組ZEB2 shRNA組F值P值

2.3 MMP 2、vimentin蛋白相對表達(dá)量的比較

shRNA-NC組細(xì)胞中MMP2、vimentin蛋白相對表達(dá)量與Control組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。ZEB2 shRNA組細(xì)胞中MMP2、vimentin蛋白相對表達(dá)量均低于Control組和shRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2、表3）

圖2 Western blot檢測各組細(xì)胞中MMP 2、vimentin蛋白表達(dá)情況

表3 各組細(xì)胞中MMP2、vimentin蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

表3 各組細(xì)胞中MMP2、vimentin蛋白相對表達(dá)量的比較（±s）

注：a與Control組比較，P＜0.05；b與shRNA-NC組比較，P＜0.05

MMP2 1.26±0.14 1.24±0.15 0.42±0.05a b 46.359 0.000 1.22±0.16 1.21±0.12 0.53±0.06a b 32.291 0.001 Control組shRNA-NC組ZEB2 shRNA組F值P值vimentin組別

3 討論

ZEB2基因定位于人類第2條染色體上，含有9個內(nèi)含子和10個外顯子，其編碼的蛋白質(zhì)兩側(cè)含有獨(dú)立的鋅指結(jié)構(gòu)，這兩個鋅指結(jié)構(gòu)能夠與5'-CACCT結(jié)合，調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子與啟動子結(jié)合，進(jìn)而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄[7]。ZEB2與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)，可以通過調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞的遷移能力參與先天性巨結(jié)腸癥、先天性面部畸形等疾病的發(fā)生過程，并且能夠使腫瘤細(xì)胞逐漸從上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，從而促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[8]。ZEB2在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)[9]。王慶海等[10]的研究表明，ZEB2蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，在卵巢癌組織中的陽性表達(dá)率為69.0%，而在正常卵巢組織中的陽性表達(dá)率僅為7.7%，并且與卵巢癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)。

腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個極為復(fù)雜的過程，大致可以概括為以下過程：腫瘤細(xì)胞從原發(fā)病灶中脫落，黏附到基質(zhì)上，釋放大量的水解酶破壞細(xì)胞外基質(zhì)，從而進(jìn)入到血管以及淋巴管中，最終到達(dá)轉(zhuǎn)移的部位進(jìn)行增殖[11]?；|(zhì)金屬蛋白酶家族幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分，在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮促進(jìn)作用，其含有至少26個家族成員，根據(jù)其作用底物可以分為膠原酶、基質(zhì)溶素、明膠酶等6大類，MMP2是一種Ⅳ型膠原酶，可以穿透細(xì)胞外基質(zhì)的突出部分，起到類似鉆頭的作用[12]。vimentin參與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程，與腫瘤細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變有關(guān)，在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)[13]。戴瑛歡[14]的研究表明，下調(diào)ZEB2基因表達(dá)后的胃癌細(xì)胞HGC-27的遷移和侵襲能力下降。

本研究以卵巢癌細(xì)胞為研究對象，將細(xì)胞轉(zhuǎn)染ZEB2 shRNA，通過RT-PCR和Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，ZEB2 shRNA能夠成功下調(diào)卵巢癌細(xì)胞中ZEB2 mRNA和蛋白的相對表達(dá)量，說明本研究成功構(gòu)建了沉默ZEB2表達(dá)的卵巢癌細(xì)胞株。進(jìn)一步用Transwell小室和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)，沉默ZEB2表達(dá)后的卵巢癌細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)目減少，遷移率下降，這提示下調(diào)ZEB2基因表達(dá)可以抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力。本研究結(jié)果與之前的研究報道相符，均說明ZEB2是一種致癌基因，抑制其表達(dá)后能夠抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力。通過Western blot法檢測細(xì)胞中MMP2和vimentin蛋白相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，ZEB2表達(dá)下調(diào)后能夠抑制MMP2和vimentin蛋白表達(dá)，這可能說明ZEB2對卵巢癌細(xì)胞侵襲、遷移能力的影響與MMP2和vimentin表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，沉默ZEB2可能通過抑制MMP2和vimentin表達(dá)降低卵巢癌細(xì)胞侵襲和遷移能力。ZEB2有望成為治療卵巢癌的靶點(diǎn)，但對于ZEB2影響腫瘤轉(zhuǎn)移的具體作用機(jī)制尚不十分清楚，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會進(jìn)一步檢測ZEB2在腫瘤轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制。