CALR基因突變與骨髓增殖性腫瘤發(fā)病的關(guān)系△

秦玉婷，尼羅帕爾·吐爾遜，郝建萍

新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病中心，烏魯木齊8300540

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferative neoplasm，MPN）是一類造血干細(xì)胞克隆性疾病，主要病理特征為分化相對(duì)成熟的一系或多系髓細(xì)胞過剩，骨髓內(nèi)有核細(xì)胞明顯增多并向終末分化成熟；其臨床表現(xiàn)主要為出血和血栓癥狀，常伴外周器官浸潤和肝脾腫大[1]。經(jīng)典的MPN包括真性紅細(xì)胞增多癥（polycythemia vera，PV）、原發(fā)性骨髓纖維化癥（primary myelofibrosis，PMF）、原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocythemia，ET）3種[2]。近年來國外研究報(bào)道，JAK2V617F突變?cè)赑V患者中約占95%，在ET或PMF患者中占50%～60%[3]。JAK激酶2（Janus kinase 2，JAK2）和血小板生成素受體（thrombopoietin receptor，MPL）基因突變的發(fā)現(xiàn)為疾病的臨床診斷帶來了極大的便利[4]，然而對(duì)于部分JAK2野生型的PMF或ET患者，目前仍缺乏特異性的診斷標(biāo)志物，因此尋找特異性的分子標(biāo)志物對(duì)疾病的診斷和治療具有重要意義。鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CALR）基因突變是目前MPN領(lǐng)域研究的重點(diǎn)，但國內(nèi)關(guān)于CALR基因突變與MPN發(fā)病相關(guān)性的研究甚少，且尚未有研究明確指出CALR基因突變?cè)贛PN發(fā)病中的作用機(jī)制。本研究通過對(duì)237例MPN患者的臨床資料進(jìn)行分析，探討CALR基因與MPN發(fā)病的關(guān)系，并分析其可能的作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2011年5月至2017年5月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院血液病中心收治的MPN患者的臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①全部患者均符合MPN的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；②年齡18～80歲；③均有完整的基因、骨髓活檢結(jié)果。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他血液腫瘤患者；②合并繼發(fā)性骨髓纖維化癥、繼發(fā)性血小板增多癥、繼發(fā)性紅細(xì)胞增多癥者；③臨床資料缺失者。根據(jù)納入排除標(biāo)準(zhǔn)共納入237例MPN患者，其中男121例，女116例；年齡18～79歲，平均（56.0±3.2）歲；PV患者84例，PMF患者20例，ET患者133例。

1.2 資料收集

對(duì)全部入組患者的年齡、初診時(shí)外周血象水平、發(fā)現(xiàn)病因、癥狀體征等臨床特征進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行相關(guān)記錄和分析。

1.3 CALR基因（9號(hào)外顯子）突變檢測(cè)

1.3.1 儀器與試劑5200型臺(tái)式低速離心機(jī)購自日本久保田公司；恒溫水浴鍋購自蘇州珀西瓦爾實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀購自美國ABI公司；凝膠自動(dòng)成像儀購自英國Cleaver公司；基因測(cè)序儀購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；全血基因組DNA提取試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；PCR擴(kuò)增引物由上海Ivotrogen公司合成。

1.3.2 標(biāo)本采集 全部患者均于入院后清晨抽取骨髓標(biāo)本3 ml，置于已加入乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）的真空管中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 標(biāo)本處理 ①取患者的骨髓液約300 μl放于EP管中，加入900 μl細(xì)胞裂解液，充分混勻后，室溫下靜置10 min，搖晃混勻，置于高速離心機(jī)，13 000 r/min高速離心20 s，棄上清，取細(xì)胞沉淀，劇烈振蕩混勻；②在細(xì)胞沉淀中繼續(xù)加入細(xì)胞裂解液300 μl，充分混勻，置于37℃的水浴鍋中恒溫加熱1 h，若無團(tuán)塊則直接冷卻至室溫，若有團(tuán)塊需再次加入細(xì)胞裂解液100 μl，繼續(xù)于37℃的水浴鍋中恒溫加熱1 h，細(xì)胞沉淀完全溶解后，冷卻至室溫；③取 100 μl溶解后的沉淀液加入 300 μl細(xì)胞裂解液，充分振蕩15 s，13 000 r/min高速離心3 min；④棄上清，在細(xì)胞沉淀物中加入300 μl異丙醇，搖晃混勻，再次13 000 r/min高速離心1 min；⑤棄上清，在細(xì)胞沉淀物中加入300 μl 70%乙醇，搖晃混勻，13 000 r/min高速離心3 min；⑥棄上清，沉淀殘?jiān)稍?5 min；⑦干燥后的沉渣中再次加入100 μl DNA水化液，置于65℃水浴鍋中恒溫加熱1 h，所得DNA溶液置于-20℃條件下保存。

1.3.4 PCR引物CALR正向引物：5'-AGGCATACGCTGAGGAGT-3'，CALR反向引物：5'-GGGACAGAGGCAAGAAAA-3'。

1.3.5 PCR擴(kuò)增條件94℃預(yù)熱5 min；94℃變性30 s，57℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，循環(huán)35次；72℃延伸10 min。

1.3.6 基因測(cè)序 對(duì)經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后有條帶顯示樣本的PCR產(chǎn)物剩余部分進(jìn)行純化，采用基因測(cè)序儀對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并采用Mutation Surveyor軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，確定基因突變的類型。

1.4 骨髓細(xì)胞學(xué)涂片與骨髓活檢病理切片檢測(cè)

全部標(biāo)本均行骨髓細(xì)胞學(xué)涂片和骨髓活檢病理切片檢測(cè)，觀察骨髓切片中CALR基因野生型[CALR（-）]和 CALR基因突變型[CALR（+）]巨核細(xì)胞的形態(tài)差異。將骨髓巨核細(xì)胞形態(tài)分為Ⅰ型（單個(gè)核型）、Ⅱ型（多個(gè)核型）、Ⅲ型（多分葉核型）、Ⅳ型（分葉不好型）、Ⅴ型（大核小核型）、Ⅵ型（巨核細(xì)胞簇）、Ⅶ型（骨小梁旁型）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)及率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)、Fisher確切概率法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CALR基因突變類型和頻率

本研究中PV患者無CALR突變，ET患者CALR突變陽性率為30.8%，PMF患者CALR突變陽性率為30.0%。ET患者和PMF患者中CALR突變主要以Ⅰ型和Ⅱ型居多（表1）。ET患者和PMF患者的CALR基因突變情況相近，因PMF患者較少，后續(xù)研究均只對(duì)ET患者進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.2 ET患者CALR基因突變巨核細(xì)胞形態(tài)

CALR（+）與CALR（-）ET患者的巨核細(xì)胞形態(tài)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.099，P＞0.05）。（表2）

2.3 CALR（+）與CALR（-）ET患者臨床特征的比較

CALR（+）與CALR（-）ET 患者年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平及發(fā)現(xiàn)病因、癥狀體征情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CALR（-）ET患者的血小板計(jì)數(shù)水平明顯低于CALR（+）患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.232，P＜0.01）。（表3）

表1 PV、ET、PMF患者中CALR基因突變類型和頻率[ n（%）]*

表2 CALR（+）與CALR（-）ET患者的巨核細(xì)胞形態(tài)[ n（%）]*

表3 CALR（+）與CALR（-）ET患者臨床特征的比較

3 討論

MPN是一種常見的血液系統(tǒng)疾病，該病的發(fā)病率逐年升高且趨于年輕化，因此提高M(jìn)PN的診斷和個(gè)體化治療水平具有重要的臨床意義。近年來，相比其他血液腫瘤的研究進(jìn)展，MPN的研究進(jìn)展緩慢，目前僅JAK2和MPL可作為診斷MPN的特異性分子標(biāo)志物，雖然JAK2和MPL突變的發(fā)現(xiàn)提高了對(duì)部分MPN的診斷水平，但依然有近半數(shù)的PMF和ET患者缺乏特異性的診斷標(biāo)志物[6]。2013年的一項(xiàng)研究證實(shí)，部分JAK2V617F、MPL突變雙陰性的ET和PMF患者存在CALR基因第9外顯子體細(xì)胞突變[7]。國內(nèi)也有相關(guān)研究指出，CALR基因在野生型JAK2的PMF和ET患者中表現(xiàn)出重現(xiàn)性的插入和缺失[4]。

CALR是一種多功能蛋白質(zhì)，普遍存在于細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，由N-結(jié)構(gòu)域、P-結(jié)構(gòu)域、C-結(jié)構(gòu)域以及9個(gè)外顯子組成，其主要作用是調(diào)節(jié)體內(nèi)鈣動(dòng)態(tài)平衡，可參與細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞吞噬、纖維化等一系列過程[8]。人類CALR基因位于第19號(hào)染色體，由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成，CALR基因突變主要為第9號(hào)外顯子插入或缺失，CALR基因突變?cè)斐闪藟A基對(duì)讀碼框移位，從而產(chǎn)生一種缺乏內(nèi)質(zhì)網(wǎng)保留序列的新型C-羧基末端蛋白。CALR基因突變類型多種多樣，目前臨床上已經(jīng)證實(shí)存在55種以上的CALR基因突變，臨床上對(duì)CALR基因的研究尚未深入。Vannucchi等[9]對(duì)攜有CALR基因突變的骨髓標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)免疫染色主要定位于巨核細(xì)胞，該研究提示巨核細(xì)胞在CALR突變的MPN發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮了重要作用，但具體的發(fā)病機(jī)制并不清楚，仍有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)，PV患者無CALR突變，ET患者CALR突變陽性率為30.8%，PMF患者CALR突變陽性率為30.0%。Tefferi等[10]對(duì)1107例MPN患者進(jìn)行CALR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ET和PMF患者中的CALR突變陽性率分別為25%和35%。上述研究與本研究結(jié)果相一致，提示CALR基因突變檢測(cè)有望成為ET、PMF等疾病的特異性分子標(biāo)志物，為提高M(jìn)PN的檢出率做出貢獻(xiàn)。本研究還發(fā)現(xiàn)，ET和PMF患者中CALR突變主要以Ⅰ型和Ⅱ型居多，與臨床共識(shí)相一致。CALR（+）與CALR（-）ET患者的巨核細(xì)胞形態(tài)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示CALR基因突變對(duì)巨核細(xì)胞形態(tài)無明顯影響。通過比較CALR（+）與CALR（-）ET患者的臨床特征發(fā)現(xiàn)，CALR（+）與CALR（-）患者年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白水平及發(fā)現(xiàn)病因、癥狀體征情況比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；CALR（-）患者的血小板計(jì)數(shù)水平明顯低于CALR（+）患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。上述結(jié)果顯示，CALR突變陽性與ET患者的癥狀體征、發(fā)現(xiàn)病因、年齡、部分外周血象均無關(guān)，但與血小板計(jì)數(shù)有關(guān)，與全鉍[4]和丁莉[11]的研究結(jié)果相近。但有關(guān)研究顯示，CALR基因突變患者相對(duì)于其他基因突變患者的血小板計(jì)數(shù)更高，且較少出現(xiàn)血栓和出血[12]。因此，結(jié)合本研究中CALR基因突變的ET患者血小板計(jì)數(shù)更高，提示CALR基因9號(hào)外顯子突變對(duì)血小板計(jì)數(shù)有一定影響，CALR基因突變與血栓低風(fēng)險(xiǎn)可能有關(guān)，患者可能具有較長的生存期。同時(shí)提示CALR可能在ET和PMF中特異性表達(dá)，對(duì)于預(yù)測(cè)部分MPN的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等方面具有至關(guān)重要的作用。

多年來，盡管臨床上對(duì)MPN的研究不斷深入，但CALR基因突變對(duì)MPN發(fā)病的影響機(jī)制至今尚不明確。Nangalia等[7]認(rèn)為CALR突變會(huì)造成C端酸性結(jié)構(gòu)域、部分鈣結(jié)合位點(diǎn)及KDEI結(jié)構(gòu)域缺失，引起CALR的功能發(fā)生變化，CALR突變后或許可通過巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫逃逸、干擾折疊蛋白反應(yīng)、激活鈣通道信號(hào)等一系列反應(yīng)對(duì)MPN的發(fā)生、發(fā)展起到促進(jìn)作用。另有學(xué)者認(rèn)為，CALR可與腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor，TNF）家族成員FASL結(jié)合形成復(fù)合體，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，一旦CALR基因突變，可能會(huì)影響細(xì)胞促凋亡系統(tǒng)[13]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，CALR突變可誘導(dǎo)JAK2下游的一個(gè)靶調(diào)控點(diǎn)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5（signal transducers and activators of transduction 5，STAT5）活化，激活白細(xì)胞介素-3（interleukin-3，IL-3）依賴細(xì)胞株BA/F3自主增殖[14]。上述因素均可能會(huì)影響MPN的發(fā)生和發(fā)展。本研究存在一定的局限性，由于PMF患者例數(shù)的限制，本研究僅對(duì)ET患者進(jìn)行了相關(guān)研究，CALR基因突變與PMF發(fā)生的關(guān)系將在后續(xù)臨床研究中不斷完善和補(bǔ)充。綜上所述，CALR突變是繼JAK2、MPL突變后的又一重大發(fā)現(xiàn)，其在JAK2、MPL突變雙陰性的ET和PMF患者中存在，不僅可能成為MPN的分子標(biāo)志物，同時(shí)也為疾病的發(fā)病機(jī)制和治療提供了新思路，CALR有望成為新的MPN分子靶向目標(biāo)。