HA-CD44st-TGF- β信號(hào)通路對(duì)乳腺癌MCF- 7細(xì)胞HER 2表達(dá)及侵襲能力的影響△

耿鶴，陸穎芝，陳謙，徐靜，嚴(yán)海翠，馬兆明，黃關(guān)宏#，房新建#1蚌埠醫(yī)學(xué)院研究生院，安徽 蚌埠33030

2蚌埠醫(yī)學(xué)院附屬連云港醫(yī)院/連云港市第二人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇 連云港 2220230

分化抗原簇44st（cluster of differentiation antigen 44st，CD44st）是透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）受體CD44家族成員之一，人類CD44基因位于人類11號(hào)染色體短臂上，完整基因組在染色體DNA上長約50 kb。CD44分子可以通過與細(xì)胞骨架蛋白的相互作用介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。CD44分子不僅是腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)志物，還直接參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[1]。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)20余種CD44亞型，最常見的CD44亞型為標(biāo)準(zhǔn)CD44（standard CD44，CD44s），由恒定區(qū)外顯子1-5、16-18及20編碼組成；其他常見的亞型為pMeta-1及pMeta-2[2]；從人乳腺癌MCF-7細(xì)胞多柔比星（adriamycin，ADR）耐藥株中克隆出一種新的短尾形式CD44st，包含外顯子1-4、16-17及18號(hào)外顯子的1-205號(hào)堿基（基因庫號(hào)：FJ216964）[3-4]。在轉(zhuǎn)染 CD44st的MCF-7細(xì)胞中，HA可以與CD44st相互作用，通過促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，引起基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和基質(zhì)金屬蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）分泌增加，進(jìn)而增加其侵襲能力[3-4]；進(jìn)一步研究顯示，HA可以通過CD44st表達(dá)的上調(diào)，激活核因子кB（nuclear factor-kappa B，NF-кB），誘導(dǎo)多藥耐藥細(xì)胞增加MMP2和MMP9的分泌，影響腫瘤細(xì)胞的侵襲能力[5]。

轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）在不同的細(xì)胞生長環(huán)境中可以表現(xiàn)為抑制或者促進(jìn)乳腺癌的進(jìn)展。在乳腺癌早期，TGF-β可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖；而在乳腺癌進(jìn)展期，由于腫瘤細(xì)胞對(duì)TGF-β抑制因子的抗拒，TGF-β促進(jìn)了腫瘤的轉(zhuǎn)移。目前尚不清楚TGF-β在腫瘤中的雙重作用機(jī)制，但研究表明TGF-β能否與TGF-β受體1（TGF-β receptor 1，TGF-βR1）、TGF-β受體2（TGF-β receptor 2，TGF-βR2）結(jié)合，在上述信號(hào)級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用[6-8]。TGF-β以前體的形式合成，裂解附近的羧基末端，釋放潛在型結(jié)合肽（latency associated peptide，LAP），LAP結(jié)合成熟型TGF-β同源二聚體，促進(jìn)潛在型TGF-β結(jié)合蛋白（latent TGF-β binding protein，LTBP）的黏附，這種潛在型TGF-β/LAP/LTBP復(fù)合物使TGF-β處于失活狀態(tài)，不能與TGF-βR結(jié)合[9]。

研究顯示，在HA-CD44介導(dǎo)的信號(hào)通路中，TGF-β是其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的靶蛋白之一，HA受體CD44介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖反應(yīng)，與HA表達(dá)上調(diào)共同促進(jìn)表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）與CD44耦合，并加強(qiáng)了MAPK通路中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）通路信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)[10]；應(yīng)用HA預(yù)處理CD44陽性表達(dá)的MCF-7-B5細(xì)胞株后，TGF-β2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，且TGF-β2蛋白表達(dá)的上調(diào)與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力密切相關(guān)[11]。

人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）陽性的乳腺癌患者占全部乳腺癌患者的15%～20%，由于HER2陽性乳腺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)，因此患者預(yù)后較差[12]；臨床上應(yīng)用具有抗HER2作用的曲妥珠單抗可以降低術(shù)后或晚期患者的復(fù)發(fā)率，延長生存時(shí)間[13-14]。研究顯示，在MCF-7細(xì)胞中HA-CD44介導(dǎo)了CD44與人表皮生長因子受體（human epidermal growth factor receptor，HER）家族成員的相互作用，引起透明質(zhì)酸合成酶-2或者基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）過表達(dá)，導(dǎo)致HER2蛋白的磷酸化水平升高[15]。此外，由HA引起的CD44-HER2復(fù)合物激活，可以導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞惡性程度增加，加上HA在細(xì)胞膜表面的作用，最終引起腫瘤細(xì)胞對(duì)曲妥珠單抗的耐藥[16-17]。

鑒于以上研究結(jié)果，為了明確腫瘤耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR中CD44st基因?qū)δ[瘤侵襲能力及耐藥的作用，有必要研究HA-CD44st信號(hào)通路對(duì)TGF-β表達(dá)的影響，以及上述通路對(duì)下游磷脂酰肌醇-3-羥激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）信號(hào)通路分子活性及HER2基因表達(dá)的影響，并探討上述通路對(duì)腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響，旨在為針對(duì)CD44st、TGF-β的靶向治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑

乳腺癌細(xì)胞株MCF-7、乳腺癌耐ADR細(xì)胞株MCF-7ADR均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒、總RNA抽提試劑（Trizol）、Opti-MEMⅠ減血清培養(yǎng)基（Opti-minimal essential medium-Ⅰ reduced serum medium，OPTI-MEMⅠ）、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、KpnⅠ均購自美國NEB公司。石蠟包埋組織RNA提取試劑盒（k1560-2）及逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒（K1622）均購自美國NEB公司。HA、T4連接酶、高保真Taq酶、1640培養(yǎng)基、pMD19-T載體（6013）、Taq DNA 聚合酶（RR066B）、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（RR066B）均購自日本TaKaRa生物有限公司。TGF-β抗體（3711）、HER2抗體（2242）、PI3K抑制劑LY-294002（9901）、PI3激酶Ⅱ類兔單克隆抗體、Phospho-NDRG1（Ser330）（D3A12）兔源單克隆抗體、兔抗人蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）抗體及磷酸化蛋白激酶B（phosphorylated protein kinase B，p-PKB/p-AKT）抗體均購自美國CST公司。Transwell購自美國Corning公司。Matrigel購自美國BD公司。鼠抗人CD44單克隆抗體（14-0441）購自美國Affymetrix公司。明膠酶譜試劑盒購自北京普利萊基因技術(shù)公司。真核表達(dá)載體pcDNA3.1由江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院許文榮教授惠贈(zèng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 CD44基因轉(zhuǎn)染及其表達(dá)的檢測 轉(zhuǎn)染前1天接種MCF-7細(xì)胞于6孔板（3.5×105/孔）中。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組（MCF-7）、轉(zhuǎn)染空載體組（MCF-7/neo）和轉(zhuǎn)染CD44st組（MCF-7/CD44st），參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行操作。轉(zhuǎn)染48～72 h后，收集細(xì)胞，采用RT-PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測CD44 mRNA和CD44蛋白的表達(dá)[3-4]。

1.2.2 HA處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)共設(shè)MCF-7組、MCF-7+HA組、MCF-7/neo組、MCF-7/CD44st組、CD44封閉性單抗預(yù)處理組、MCF-7/CD44st+HA組6組。將對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒載體 pcDNA3.1-CD44st和 pcDNA3.1，24 h后移去轉(zhuǎn)染混合液，加入含10%熱滅活胎牛血清1640培養(yǎng)基。于轉(zhuǎn)染45 h后，消化、離心并收集各組細(xì)胞。分別計(jì)數(shù)1.5×106個(gè)細(xì)胞，將其接種于各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，在培養(yǎng)瓶中加入1.5 ml無血清1640培養(yǎng)基。CD44封閉性單抗預(yù)處理組加入CD44封閉性單抗20 μg/ml預(yù)處理3 h。在轉(zhuǎn)染48 h后，MCF-7+HA組、MCF-7/CD44st+HA組和CD44封閉性單抗預(yù)處理組分別加入HA 100 μg/ml孵育24 h。為了排除其他生長因子的干擾，HA于使用前在100℃水浴中煮沸5 min[4]。HA孵育24 h后，收集各組細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測。

1.2.3 RT-PCR檢測CD44 st mRNA、HER 2 mRNA及TGF- β mRNA的表達(dá) 分別取MCF-7組、MCF-7+HA組、MCF-7/neo組、MCF-7/CD44st組、CD44封閉性單抗預(yù)處理組、MCF-7/CD44st+HA組細(xì)胞各1×106個(gè)，提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，進(jìn)行PCR檢測。采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)人CD44s（t基因庫號(hào)：FJ216964）、TGF-β（基因庫號(hào)：NM000660）及HER2（又稱Cerb-B-2，基因庫號(hào)：X03363.1）片段引物（表1）。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，采用凝膠成像儀對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行掃描，以β-actin為內(nèi)參對(duì)照基因進(jìn)行質(zhì)控和標(biāo)化。

表1 PCR引物序列

1.2.4 Westernblot檢測TGF- β蛋白、HER 2、AKT和p-AKT表達(dá) 取上述MCF-7組、MCF-7+HA組、MCF-7/neo組、MCF-7/CD44st組、CD44封閉性單抗預(yù)處理組、MCF-7/CD44st+HA組細(xì)胞各1×106個(gè)。用煮沸的2×上樣緩沖液60 μl收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，100℃煮沸5 min變性，12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳，1 mA/cm2恒流半干轉(zhuǎn)膜，5%的脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1 h，以GAPDH（1∶3000）作為內(nèi)參，鼠抗人TGF-β、HER2、AKT和p-AKT抗體（1∶500）孵育，4℃過夜，用含1‰吐溫-20的三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽水（tris buffered saline tween，TBST）洗膜3次，每次10 min，山羊抗鼠二抗（1∶2000）室溫孵育1 h，TBST緩沖液充分漂洗，將膜蛋白面向上，加入電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）試劑，2 min后于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。

1.2.5 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的侵襲能力采用無血清1640培養(yǎng)基將Matrigel稀釋（稀釋濃度1∶1），每個(gè)Transwell小室加入150 μl上述混合物，37℃放置1 h。Matrigel充分聚合后，Transwell下室加入1000 μl含10%新生牛血清1640培養(yǎng)基，平衡1 h。實(shí)驗(yàn)共設(shè)MCF-7組、MCF-7/CD44st組、MCF-7/CD44st+HA組、CD44封閉性單抗預(yù)處理組、LY-294002預(yù)處理組5個(gè)實(shí)驗(yàn)組。0.25%胰蛋白酶消化并收集以上各組細(xì)胞，制備成1×105/ml細(xì)胞懸液，取200 μl細(xì)胞懸液，接種至Transwell上室，常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出Transwell小室，用棉簽拭去聚碳酸酯膜表面的Matrigel，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）輕輕沖洗聚碳酸酯膜的上、下面，晾干，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，去除多余結(jié)晶紫染液，普通光學(xué)顯微鏡下觀察，每個(gè)濾膜隨機(jī)選取5個(gè)200倍視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)量（聚碳酸酯膜下表面細(xì)胞數(shù)量），以穿膜細(xì)胞的數(shù)量表示腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 EMSA檢測AP- 1表達(dá)采用電泳遷移率變動(dòng)分析（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）檢測激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）在HACD44st-TGF-β-PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的作用，實(shí)驗(yàn)分組同1.2.5。計(jì)數(shù)3×106個(gè)MCF-7細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染前24 h接種于培養(yǎng)瓶中。轉(zhuǎn)染24 h后移去轉(zhuǎn)染混合液，加入含10%熱滅活胎牛血清1640培養(yǎng)基，孵育12 h。轉(zhuǎn)染36 h后，CD44封閉性單抗預(yù)處理組、LY-294002預(yù)處理組細(xì)胞分別用CD44單抗（20μg/ml）、LY-294002（50 μmol/L）預(yù)處理 3 h。于轉(zhuǎn)染 39 h后，MCF-7/CD44st+HA組、CD44封閉性單抗預(yù)處理組、LY-294002預(yù)處理組細(xì)胞分別加入HA（100 μg/ml）處理6 h，設(shè) MCF-7/CD44st組為陰性對(duì)照組。于轉(zhuǎn)染45 h后，收集以上各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞6×106個(gè)，加入300 μl細(xì)胞質(zhì)蛋白提取液Buffer A，冰上靜置15 min；4℃，以2000 r/min離心10 min；棄上清，以Buffer A 100 μl洗滌沉淀；4℃，以5000 r/min離心10 min；棄上清，加入 Buffer B 100 μl，充分混勻后，冰浴靜置10 min；再次混勻，冰浴靜置10 min，如此反復(fù)2次；4℃，以15 000 r/min離心20 min；收集上清，此即為核蛋白提取液，取2 μl核蛋白，采用Bradford法測定核蛋白濃度，分裝后-70℃保存。AP-1探針序列：5'-CGCTTGATGACTCAGCCG-GAA-3'，3'-GCGAACTACTGAGTCGGCCTT-5'。參見說明書依次進(jìn)行探針的標(biāo)記、結(jié)合反應(yīng)、配膠、電泳、轉(zhuǎn)膜，采用ECL法檢測生物素標(biāo)記的DNA，將膜置于膠卷盒中，于X線下顯影。調(diào)整曝光時(shí)間，以獲得合適的結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；采用單因素方差分析轉(zhuǎn)染組與陰性對(duì)照組的差異；多組間比較采用F檢驗(yàn)；組間兩兩比較采用q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA 3.1-CD44 st重組質(zhì)粒CD44 st的轉(zhuǎn)染情況

RT-PCR檢測結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞和MCF-7/neo細(xì)胞中均未見CD44st mRNA表達(dá)，而MCF-7/CD44st細(xì)胞中CD44st mRNA表達(dá)水平較高（圖1）。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，MCF-7細(xì)胞和MCF-7/neo細(xì)胞中僅有少量CD44陽性細(xì)胞，而MCF-7/CD44st細(xì)胞中CD44陽性細(xì)胞較多（圖2）；另外，在MCF-7細(xì)胞、MCF-7/neo細(xì)胞和MCF-7/CD44st細(xì)胞中CD44陽性表達(dá)率分別為（7.9±1.5）%、（7.0±1.1）%和（73.1±2.9）%；MCF-7/neo細(xì)胞與MCF-7細(xì)胞的CD44陽性表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而MCF-7/CD44st細(xì)胞的CD44陽性表達(dá)率與MCF-7細(xì)胞、MCF-7/neo細(xì)胞比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 RT-PCR檢測各組細(xì)胞CD44 st的表達(dá)情況

2.2 CD44 st表達(dá)上調(diào)的MCF- 7細(xì)胞中HER 2、TGF- β表達(dá)情況

HA處理24 h后，MCF-7/CD44st+HA組細(xì)胞的HER2 mRNA、TGF-β mRNA及HER2、TGF-β蛋白較其他各組表達(dá)明顯上調(diào)；與MCF-7組、MCF-7+HA 組、MCF-7/neo組比較，MCF-7/CD44st組及CD44封閉性單抗預(yù)處理組細(xì)胞的HER2 mRNA、TGF-β mRNA 及 HER2、TGF-β蛋白表達(dá)無變化。（圖3）

2.3 HA處理后各組細(xì)胞中p-AKT的表達(dá)情況

經(jīng)HA100μg/ml處理30 min后，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-CD44st的MCF-7細(xì)胞中p-AKT表達(dá)增強(qiáng)；CD44封閉性單抗預(yù)處理組細(xì)胞的p-AKT表達(dá)明顯弱于MCF-7/CD44st+HA組；與MCF-7組比較，MCF-7+HA組、MCF-7/neo組、MCF-7/CD44st組細(xì)胞p-AKT表達(dá)未見明顯增強(qiáng)。（圖4）

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞CD44的表達(dá)情況

圖3 RT-PCR與Western blot分別檢測各組細(xì)胞中CD44 st mRNA、TGF- β mRNA、HER 2 mRNA與CD44 st、TGF- β、HER 2蛋白的表達(dá)情況

圖4 Western blot檢測各組細(xì)胞中p-AKT的表達(dá)情況

2.4 轉(zhuǎn)錄因子AP- 1在HA-CD44st-TGF- β-PI 3 K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的表達(dá)情況

EMSA法檢測轉(zhuǎn)錄因子AP-1與DNA的結(jié)合活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCF-7組、MCF-7/CD44st組、CD44封閉性單抗預(yù)處理組、LY-294002預(yù)處理組、MCF-7/CD44st+HA組細(xì)胞的AP-1與DNA結(jié)合的熒光強(qiáng)度分別為750.7、1152.6、2261.8、3539.8、4967.3。MCF-7/CD44st+HA組細(xì)胞的AP-1與DNA結(jié)合的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于其他各組，CD44封閉性單抗預(yù)處理組及LY-294002預(yù)處理組的AP-1與DNA結(jié)合的熒光強(qiáng)度強(qiáng)于MCF-7/CD44st組。（圖5）

圖5 EMSA檢測轉(zhuǎn)錄因子AP- 1與DNA的結(jié)合活力

2.5 各組細(xì)胞的侵襲能力比較

Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測各組細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MCF-7組、MCF-7/CD44st組、CD44單抗預(yù)處理組、LY-294002預(yù)處理組和MCF-7/CD44st+HA處理組5個(gè)實(shí)驗(yàn)組侵襲細(xì)胞數(shù)量分別為（161±21）、（190±26）、（205±30）、（210±25）、（273±28）個(gè)/200倍視野。MCF-7/CD44st+HA組侵襲細(xì)胞數(shù)量多于其他各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而MCF-7/CD44st組、CD44封閉性單抗預(yù)處理組及LY-294002預(yù)處理組侵襲細(xì)胞數(shù)量多于MCF-7組，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖6）

圖6 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測HA-CD44 st引起MCF- 7/CD44 st細(xì)胞侵襲力變化

3 討論

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是一個(gè)復(fù)雜嚴(yán)密的調(diào)節(jié)過程，這種過程賦予上皮細(xì)胞以間葉細(xì)胞的活性[18]。在EMT過程中，這種細(xì)胞行為及特性的轉(zhuǎn)換過程通常由EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如nail/Slug和ZEB1/2協(xié)助完成，這些EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的功能可促進(jìn)上皮成分如錨蛋白的丟失，以及間葉蛋白如波形蛋白的產(chǎn)生，這些EMT轉(zhuǎn)錄因子可以被許多細(xì)胞因子或生長因子所激活，包括TGF-β等[19]。除EMT外，TGF-β信號(hào)通過經(jīng)典的信號(hào)級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)（如Smad蛋白家族中的Smad2、3），或者是非經(jīng)典的信號(hào)級(jí)聯(lián)轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括非Smad蛋白（如PI3K-AKT，細(xì)胞外信號(hào)相關(guān)蛋白激酶1、2）[20-21]控制細(xì)胞的生長分化、存活、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)降解、血管生成、免疫系統(tǒng)等。

TGF-β家族成員表達(dá)（TGF-β1、TGF-β2）與HA-CD44信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在乳腺癌及肺癌細(xì)胞中，TGF-β1通過HACD44反向激活EGF信號(hào)，誘導(dǎo)EMT表達(dá)，這一過程與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)，并影響腫瘤細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[22-23]。TGF-β2是潛在的CD44下游轉(zhuǎn)錄基因，在CD44陽性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞MCF-7（B5克?。┲校琀A預(yù)處理后TGF-β2的前體蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，而應(yīng)用CD44 RNAi后TGF-β2表達(dá)明顯下調(diào)，該研究表明TGF-β2是HA-CD44信號(hào)通路的下游靶基因，該信號(hào)通路與乳腺癌細(xì)胞的侵襲及耐藥密切相關(guān)[11,24]。許多研究證實(shí)TGF-β2過表達(dá)促進(jìn)了多種腫瘤的侵襲作用，如卵巢癌[25]、黑色素瘤[26]、胰腺癌[27]及皮膚癌[28]。本研究顯示，HA與CD44st受體結(jié)合后，可以通過CD44st→TGF-β→PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)MCF-7細(xì)胞的侵襲能力，與此同時(shí)伴有TGF-β、HER2表達(dá)的上調(diào)，提示TGF-β可能是HACD44st通路的下游信號(hào)蛋白之一，而這種信號(hào)之間相互作用對(duì)于HER2的表達(dá)及乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞的侵襲能力產(chǎn)生了重要的影響。

有關(guān)CD44分子在乳腺癌中表達(dá)及意義的研究顯示，在腫瘤進(jìn)展過程中HA與廣泛分布于細(xì)胞表面的CD44亞型結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞骨架蛋白、錨蛋白、小G蛋白R(shí)ho及PI3K-AKT通路的活化，導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞的黏附、生長、增殖、遷移及侵襲能力的增加[29]，引起HER2陽性乳腺癌細(xì)胞株對(duì)曲妥株單抗的耐藥[30]，并與腫瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)[31-34]。HA與CD44的結(jié)合可以調(diào)節(jié)EGFR家族成員的活性[15]，HER2陽性的乳腺癌患者，血清CD44表達(dá)明顯上調(diào)，該研究結(jié)果提示，CD44作為腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物的作用值得進(jìn)一步研究，CD44可以作為曲妥珠單抗耐藥患者的耐藥逆轉(zhuǎn)靶基因[35]。Bellerby等[36]的研究證實(shí)，CD44的過表達(dá)與雌激素耐藥有關(guān)，促進(jìn)了耐藥細(xì)胞的侵襲能力；在雌激素敏感的MCF-7細(xì)胞中，CD44v6過表達(dá)可以通過EGFR信號(hào)通路的反向激活，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲能力，減少對(duì)雌激素藥物的反應(yīng)性；針對(duì)CD44v6及EGFR的靶向治療可以延緩或阻止乳腺癌的耐藥。一項(xiàng)278例乳腺癌術(shù)后患者的研究顯示，與HER2陰性組患者比較，HER2陽性組患者的乳腺癌細(xì)胞中HA表達(dá)及腫瘤間質(zhì)細(xì)胞中CD44的表達(dá)明顯上調(diào)，并且在基質(zhì)細(xì)胞中CD44陽性、乳腺癌細(xì)胞中HER2陽性與受體陰性、腫瘤低分化密切相關(guān)，并影響乳腺癌術(shù)后患者的預(yù)后。該研究提示，腫瘤細(xì)胞中HER2的表達(dá)與HA、CD44的表達(dá)有密切的關(guān)系[37]。

綜述所述，在乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中，HA-CD44st的結(jié)合對(duì)TGF-β、HER2的表達(dá)及PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、AP-1轉(zhuǎn)錄因子的激活有重要的作用；信號(hào)通路HA-CD44st→TGF-β→PI3K的激活以及與TGF-β介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子的相互作用，影響乳腺癌細(xì)胞的生成、增殖及惡性表型的改變。本研究為針對(duì)CD44st、TGF-β以及上述通路的靶向治療奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)為深入研究該信號(hào)通路對(duì)腫瘤的形成、多藥耐藥的作用、侵襲行為的改變指出了方向，進(jìn)一步為CD44st基因單抗的研發(fā)及該基因在乳腺癌術(shù)后患者中表達(dá)意義的研究提供了可靠保證。