人參皂苷Rg1對(duì)大鼠脊髓缺血再灌注損傷中survivin蛋白表達(dá)及細(xì)胞凋亡的影響

葉勁濤，宋煥瑾，李鋒濤，林 磊，薛建利，吳 昊，程 斌

(1. 西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院，陜西西安 710004；2. 漢中市中心醫(yī)院，陜西漢中 723000)

脊髓損傷的病理過程包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，脊髓的繼發(fā)性損傷在原發(fā)性損傷的基礎(chǔ)上發(fā)生，脊髓缺血再灌注損傷(spinal cord ischemia-reperfusion injury, SCII)和炎癥反應(yīng)所產(chǎn)生的細(xì)胞外毒素、自由基和炎癥介質(zhì)等引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞壞死和凋亡，是脊髓繼發(fā)性損傷的病理基礎(chǔ)[1]。

許多研究證實(shí)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡主要通過兩條途徑，外源性凋亡配體途徑的激活需要配體與所謂的細(xì)胞表面的死亡受體相結(jié)合，從而激活半胱天冬酶-8(cysteine aspartic acid specific protease-8, Caspase-8)；內(nèi)源性途徑可被代謝、基因等其他因素所激活，導(dǎo)致線粒體完整性被破壞及線粒體通透性改變，該過程導(dǎo)致細(xì)胞色素C(cytochrome C, Cyt C)釋放。Cyt C一旦釋放入胞質(zhì)，隨即組成一個(gè)大的超分子復(fù)合物apoptosome，從而激活起始因子Caspase-9。無(wú)論何種刺激，最終會(huì)激活起始caspases，使其下游的caspases活性增高，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[2]。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins, IAPs)是一組內(nèi)源性的抗凋亡因子，它能抑制FasL、Cyt C以及化療藥物引起的細(xì)胞凋亡。人類凋亡抑制蛋白家族是唯一的內(nèi)源性caspase抑制物，該蛋白家族已被發(fā)現(xiàn)8種蛋白，其中存活素(survivin)在缺血再灌注相關(guān)領(lǐng)域被廣泛研究[3-4]。

人參(ginseng)是五加科多年生草本植物，中醫(yī)應(yīng)用人參已有兩千多年，具有廣泛的藥理作用。人參的化學(xué)成分包括人參皂苷(ginsenosides)及人參多糖(ginseng polysaccharides)等，其中人參皂苷具有抗凋亡、抗氧化、促進(jìn)記憶、抗衰老、抗疲勞、促進(jìn)體能恢復(fù)、抗焦慮等作用[5-6]。也有相關(guān)研究指出，人參皂苷在腦缺血再灌注損傷中起到保護(hù)作用[7]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討人參皂苷Rg1對(duì)于SCII后survivin蛋白及細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑成年健康雄性SD大鼠120只，6～8周齡，體質(zhì)量200～230 g，購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物等級(jí)為清潔級(jí)(clean animal)。將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物按隨機(jī)數(shù)表法分為4組。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)操作獲西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理委員會(huì)的批準(zhǔn)并符合其動(dòng)物實(shí)驗(yàn)管理?xiàng)l例。人參皂苷Rg1粉劑：上海研生生物技術(shù)科技有限公司，有效成分>98%。SP免疫組化試劑盒、DAB試劑：北京博奧森生物技術(shù)有限公司。蘇木素伊紅染液：溫州康泰生物科技有限公司。survivin大鼠單克隆抗體、Caspase-9大鼠單克隆抗體：美國(guó)Santa Cruz公司。PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)：實(shí)驗(yàn)室自備。

1.2 方法

1.2.1大鼠急性脊髓缺血再灌注損傷模型的建立及分組 所有動(dòng)物術(shù)前禁食12 h，不禁水。藥物組大鼠脊髓缺血前30 min腹腔注射人參皂苷Rg1 30 mg/kg[8-9]，藥物質(zhì)量濃度為10 mg/mL，術(shù)后立即注射1次相同劑量藥物。術(shù)前采用苯巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉。頸部備皮消毒后取頸正中切口顯露大鼠左側(cè)頸總動(dòng)脈，與監(jiān)護(hù)儀連接的置入PE50導(dǎo)管，監(jiān)測(cè)近、遠(yuǎn)端血壓(近端導(dǎo)管連接放血裝置)。消毒后取大鼠尾根部約1 cm處顯露尾動(dòng)脈，置入PE50導(dǎo)管并連接監(jiān)護(hù)儀，監(jiān)測(cè)遠(yuǎn)端血壓。消毒后沿左側(cè)腹股溝切開暴露左側(cè)股動(dòng)脈，將F2 Fogarty導(dǎo)管置入，置入10.8～11.4 cm，使得球囊位于左鎖骨下動(dòng)脈分支處。充盈球囊，阻斷胸主動(dòng)脈，同時(shí)立即通過放血裝置開始放血，將近端平均動(dòng)脈壓維持在45 mmHg。胸主動(dòng)脈阻斷10 min后，放松球囊，恢復(fù)胸主動(dòng)脈血流，將所放出的血液勻速回輸。術(shù)后皮下注射0.4 mL硫酸魚精蛋白4 mg。將動(dòng)物放置于25～30 ℃的保溫箱，等待動(dòng)物蘇醒后放回飼養(yǎng)籠中。分別設(shè)立4個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)(6、12、24、48 h)，即6、12、24、48 h 4個(gè)亞組。脊髓缺血組：麻醉滿意后采用經(jīng)股動(dòng)脈插入Fogarty導(dǎo)管阻斷胸主動(dòng)脈的方法構(gòu)建大鼠脊髓缺血模型。脊髓缺血再灌注組：在麻醉、脊髓缺血完成后拔除導(dǎo)管，開始再灌注。觀察時(shí)間點(diǎn)同藥物組，亦有4個(gè)亞組。假手術(shù)組：本組大鼠將接受同其他處理組相同的麻醉與手術(shù)，但不誘導(dǎo)脊髓缺血及進(jìn)行再灌注處理。假手術(shù)組、脊髓缺血組各有12只大鼠，脊髓缺血再灌注組及人參皂苷Rg1藥物組各有48只大鼠(每個(gè)亞組12只)。

1.2.2標(biāo)本采集 動(dòng)物按組分別于脊髓缺血完成，再灌注6、12、24、48 h時(shí)心臟采血、處死。麻醉后，打開動(dòng)物胸腔，心臟采血3 mL，室溫下放置2 h后1 000 r/min離心10 min取上清，-20 ℃冰箱保存待測(cè)。部分動(dòng)物立即取出腰段脊髓組織，長(zhǎng)度約1 cm，用于Western blot及RT-PCR檢測(cè)。其余動(dòng)物行左心室升主動(dòng)脈插管，同時(shí)剪開右心房，250 mL生理鹽水快速灌洗后，40 g/L多聚甲醛先快后慢繼續(xù)灌注約30 min左右，至右心房流出清亮多聚甲醛、動(dòng)物尸體僵硬即可。立即同法取出腰段脊髓組織，放入4 ℃、40 g/L多聚甲醛中后固定24 h，再放入自來水中浸洗24 h，中間換水2～3次，進(jìn)行石蠟包埋，于腰3節(jié)段2 mm范圍內(nèi)連續(xù)切片，厚度為10 μm。

1.2.3大鼠后肢神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分 分別在干預(yù)后各觀察時(shí)間點(diǎn)，采用大鼠后肢神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分(Basso Beattie and Bresnahan score, BBB score)方法[8]，對(duì)假手術(shù)組、脊髓缺血再灌注組及藥物組大鼠后肢神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)分。參加評(píng)分人員為熟悉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)而未參加本組實(shí)驗(yàn)人員。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色 各組脊髓組織石蠟切片脫蠟，梯度乙醇和蒸餾水復(fù)水，30 mL/L H2O2孵育30 min，0.01 mol枸櫞酸鹽緩沖液行抗原熱修復(fù)，滴加封閉液，室溫20 min，滴加survivin/凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor, AIF)一抗(1∶100)，濕盒內(nèi)4 ℃過夜；滴加生物素化二抗工作液，室溫20 min；滴加SABC，室溫15 min。DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染，自來水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明。采用高清晰彩色醫(yī)學(xué)圖文分析系統(tǒng)，每張切片取5個(gè)不同視野拍片，進(jìn)行圖像分析，計(jì)數(shù)脊髓前角survivin/AIF陽(yáng)性神經(jīng)元。

1.2.5Western blot檢測(cè)大鼠脊髓組織survivin及Caspase-9蛋白的表達(dá) 配置單去污劑裂解液(PMSF)、電泳緩沖液、轉(zhuǎn)移緩沖液、10×麗春紅染液、TBS緩沖液、TBST緩沖液等實(shí)驗(yàn)所需主要試劑。用采集的脊髓標(biāo)本制備脊髓組織樣品蛋白，考馬斯亮蘭法測(cè)定脊髓組織蛋白含量后備用。經(jīng)灌膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)印后，將膜用TBS浸濕，移至平皿(內(nèi)有封閉液)中，使用搖床室溫下封閉1 h。將一抗用TBST稀釋(1∶200)加入密封袋，并裝入PVDF膜，封閉密封袋。室溫孵育2 h，再上搖床室溫下用TBST洗15 min，共洗3次。使膜與二抗(1∶2 000)稀釋液在室溫下孵育2 h，上搖床室溫下用TBST洗10 min，共洗2次。再用TBS洗10 min。使用ECL法顯色后，于Bio-Rad凝膠成像儀上選擇免疫印跡協(xié)議，進(jìn)行200 s(每隔2 s)拍照，保存圖片。

1.2.6RT-PCR檢測(cè)大鼠脊髓組織survivin及Caspase-9 mRNA的表達(dá) 抽提組織的總mRNA：取出部分凍存組織，將其置于玻璃勻漿器中，按3 mL/100 mg組織比例加入Trizol進(jìn)行提取。將提取RNA溶于20 μL去核酸酶水中，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。所提取的總RNA用紫外分光光度儀分析RNA含量和純度，測(cè)定其A260和A280的吸光度，并根據(jù)A260/A280的比值評(píng)估RNA的純度。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：總反應(yīng)體系20 μL，含2 μL樣品RNA，9 μL DEPC水，1 μL OLigodT，1 μL RNA酶抑制劑，2 μL dNTPs(10 mmol/L)，4 μL 5×M-ML Vbuffer，1 μL M-MLVRT。反應(yīng)條件為：70 ℃ 5 min→42 ℃ 60 min→70 ℃ 10 min，終止反應(yīng)。

PCR擴(kuò)增：參照GenBank中的survivin、Caspase-9和β-actin的cDNA序列，合成目的基因survivin、Caspase-9及β-actin的引物(survivin上游引物：5′-TGGACAAACAAAGAGCCAAGAA-3′，下游引物：5′-TAGAGCAAAGCCACAAAACCAA-3′；Caspase-9上游引物：5′-CCAGAGATTCGCAAACCA-3′，下游引物：5′-CCTGACAGCCGTGAGAG-3′；β-actin上游引物：5′-ATTGTAACCAACTGGGACG-3′，下游引物：5′-TCTCCAGGGAGGAAGA-

GG-3′)，總反應(yīng)體系20 μL，包括cDNA 3 μL，1 mmol/L dNTPs 10 μL，10×Taq聚合酶buffer 5 μL，目的基因和β-actin上下游引物各2 μL(10 mmol/L)，Mg2+3 μL，去離子水24 μL，Taq酶1 μL。反應(yīng)條件為：變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，反應(yīng)循環(huán)數(shù)為28。

電泳配制：20 g/L瓊脂糖凝膠，使用其對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 18.0軟件進(jìn)行軟件分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用Student-t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠BBB評(píng)分結(jié)果從表1可以看出，再灌注開始后大鼠的BBB評(píng)分即出現(xiàn)顯著下降，至12 h下降至最低，此后緩慢上升，到再灌注后48 h仍處于較低水平(P<0.05)。藥物組各亞組值雖都較假手術(shù)組降低，但與單純?nèi)毖俟嘧⒔M相比，各時(shí)間點(diǎn)值均上升(P<0.05)。

表1 不同組別大鼠各時(shí)間點(diǎn)的BBB評(píng)分結(jié)果

組別BBB評(píng)分假手術(shù)組20.50±0.53缺血再灌注組 6h2.75±1.28* 12h0.88±0.83* 24h2.75±1.04* 48h3.13±0.64*藥物組 6h4.25±1.16*# 12h2.38±0.92*# 24h4.63±1.19*# 48h4.88±1.64*#

與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血再灌注組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

2.2 各組大鼠脊髓survivin、AIF蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果從表2中可以看出，缺血前脊髓組織survivin基本不表達(dá)，胞質(zhì)內(nèi)AIF蛋白及凋亡神經(jīng)細(xì)胞基本沒有出現(xiàn)。缺血后survivin及AIF蛋白陽(yáng)性細(xì)胞開始增多(P<0.05)，survivin蛋白位于胞質(zhì)，AIF蛋白位于胞質(zhì)和(或)胞核。藥物組各亞組survivin蛋白陽(yáng)性細(xì)胞均較脊髓缺血再灌注組增多(P<0.05)，而AIF陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)值均較缺血再灌注組減少(P<0.05)。神經(jīng)元凋亡與人參皂苷Rg1誘導(dǎo)的survivin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與AIF蛋白水平呈正相關(guān)(圖1、圖2)。

圖1 大鼠脊髓survivin免疫組化染色結(jié)果

Fig.1 The immunohistochemical staining of survivin in the spinal cord

A：假手術(shù)組；B：脊髓缺血組；C：脊髓缺血再灌注組6 h；D：藥物組6 h；E：脊髓缺血再灌注組48 h；F：藥物組48 h(n=12，×400)。

圖2 大鼠脊髓AIF免疫組化染色結(jié)果

Fig.2 The immunohistochemical staining of AIF in the spinal cord

A：假手術(shù)組；B：脊髓缺血組；C：脊髓缺血再灌注組6 h；D：藥物組6 h；E：脊髓缺血再灌注組48 h；F：藥物組48 h(n=12，×400)。

2.3 各組大鼠脊髓survivin、Caspase-9的Western blot檢測(cè)結(jié)果從表3中可以看出，缺血前脊髓神經(jīng)元survivin及Caspase-9蛋白基本不表達(dá)，缺血后即見少量表達(dá)，至再灌注后表達(dá)繼續(xù)上升。survivin蛋白到再灌注后48 h仍有上升趨勢(shì)，Caspase-9蛋白自再灌注12 h表達(dá)至高峰后開始下降。藥物組各亞組值與單純?nèi)毖俟嘧⒔M相比，survivin含量各時(shí)間點(diǎn)值均上升，Caspase-9含量各時(shí)間點(diǎn)值均下降(P<0.05，圖3)。

2.4 各組大鼠脊髓survivin、Caspase-9的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果從表4中可以看出，缺血前脊髓神經(jīng)元survivin及Caspase-9基因基本不表達(dá)，缺血后即見少量表達(dá)，至再灌注后表達(dá)繼續(xù)上升。survivin基因到再灌注后48 h仍有上升趨勢(shì)，Caspase-9基因自再灌注12 h表達(dá)至高峰后開始下降，藥物組各亞組與單純?nèi)毖俟嘧⒔M相比，各時(shí)間點(diǎn)值均下降(P<0.05，圖4)。

表2 不同組別大鼠各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織survivin及AIF陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果

組別survivinAIF假手術(shù)組0.40±0.770.50±0.78缺血組5.23±2.22*4.50±2.30缺血再灌注組 6h11.57±3.43*10.13±3.95 12h17.47±3.88*16.07±4.29 24h22.43±3.94*9.47±3.08 48h24.20±4.34*9.10±3.24藥物組 6h14.97±4.62*#8.17±2.94 12h21.70±3.91*#11.97±3.34 24h27.50±3.76*#6.53±3.08 48h27.57±4.35*#7.10±3.10

與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血再灌注組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

圖3 大鼠脊髓Western blot檢測(cè)結(jié)果

Fig.3 Expressions of survivin and Caspase-9 in spinal cord tissues

圖4 大鼠脊髓RT-PCR電泳結(jié)果

Fig.4 Results of spinal cord RT-PCR electrophoresis

表3 不同組別大鼠各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織survivin及Caspase-9蛋白表達(dá)的比較

組別survivin/β-actinCaspase-9/β-actin假手術(shù)組0.02±0.010.08±0.01缺血組0.32±0.03*0.90±0.08*缺血再灌注組 6h0.40±0.02*1.75±0.06* 12h0.45±0.03*1.91±0.04* 24h0.49±0.02*1.54±0.06* 48h0.52±0.02*1.47±0.05*藥物組 6h0.46±0.04*#1.64±0.05*# 12h0.50±0.02*#1.81±0.04*# 24h0.59±0.04*#1.42±0.03*# 48h0.61±0.03*#1.38±0.05*#

與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血再灌注組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

表4 不同組別大鼠各時(shí)間點(diǎn)脊髓組織survivin及Caspase-9基因表達(dá)的比較

組別survivin/β-actinCaspase-9/β-actin假手術(shù)組0.14±0.020.23±0.02缺血組0.56±0.03*0.51±0.06*缺血再灌注組 6h0.64±0.04*0.62±0.04* 12h0.73±0.04*0.89±0.05* 24h0.81±0.03*0.53±0.03* 48h0.80±0.03*0.52±0.04*藥物組 6h0.70±0.05*#0.53±0.03*# 12h0.81±0.04*#0.75±0.03*# 24h0.87±0.00*#0.42±0.05*# 48h0.86±0.03*#0.44±0.04*#

與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血再灌注組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，#P<0.05。

3 討 論

SCII是由于脊髓損傷、外科手術(shù)等原因造成的，由于其損傷機(jī)制復(fù)雜，且其中存在很多不可逆的病理生理過程，至今仍被認(rèn)為是一種無(wú)特殊治療方法的疾病。多年來，人們對(duì)其機(jī)制進(jìn)行的大量的基礎(chǔ)研究和臨床觀察，認(rèn)識(shí)到其是造成脊髓神經(jīng)損傷的一個(gè)重要因素。SCII的機(jī)制包括興奮性中毒與酸中毒、氧化應(yīng)激及自由基造成的損傷、炎性浸潤(rùn)、高能磷酸化合物的缺乏、細(xì)胞凋亡等。各損傷機(jī)制相互聯(lián)系，構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)[9]。程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death, PCD)在正常細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡中具有很重要的作用。有研究認(rèn)為，凋亡是一種能量依賴、程序性的細(xì)胞死亡，并且從形態(tài)學(xué)特征上描述了細(xì)胞皺縮、膜起泡、染色質(zhì)濃縮、DNA碎裂。同時(shí)，該進(jìn)程的失調(diào)與許多疾病相關(guān)，如癌癥、自身免疫紊亂及神經(jīng)退變性疾病及缺血。實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物模型如階段性脊髓缺血顯示，細(xì)胞的存活/死亡信號(hào)通路參與了SCII的發(fā)病。凋亡的形態(tài)學(xué)及生化證據(jù)在實(shí)驗(yàn)性腦缺血損傷動(dòng)物模型中已被找到。本研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1干預(yù)后，大鼠后肢神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能藥物組較缺血再灌注組明顯改善，說明人參皂苷Rg1對(duì)于大鼠SCII后功能恢復(fù)確實(shí)有一定的作用。通過對(duì)AIF的檢測(cè)，可以得知人參皂苷Rg1對(duì)于由脊髓缺血再灌注損傷引起的凋亡具有干預(yù)作用，然而具體干預(yù)的途徑尚未可知。AIF的結(jié)果亦表現(xiàn)出凋亡在脊髓缺血再灌注的發(fā)生過程中起到了重要作用，抑制凋亡可以明顯減輕脊髓缺血再灌注后的損傷。

參與哺乳動(dòng)物凋亡的一系列caspases的特征性改變已被觀測(cè)到。到目前為止，14種哺乳動(dòng)物caspases已被確認(rèn)，至少有8種在凋亡過程中起重要作用。凋亡caspases有2種：起始因子(如Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10)及執(zhí)行因子(如Caspase-3、Caspase-7)。起始caspases作為單體存在，并通過可以導(dǎo)致它們激活的凋亡蛋白酶聯(lián)合募集結(jié)構(gòu)域(caspase-associated recmitment domains, CARDs)或死亡效應(yīng)域(death effector domain, DED)與其他蛋白相互作用。被激活的起始因子裂解并激活了執(zhí)行因子的前體。激活的執(zhí)行caspases依次裂解細(xì)胞中其他的與凋亡進(jìn)程有關(guān)的蛋白底物。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，caspases參與SCII過程。在神經(jīng)元死亡過程中，caspases的重要性已被認(rèn)識(shí)。Caspase-3、Caspase-9是參與凋亡的主要的2種caspases，而一些caspases如Caspase-11及Caspase-12僅在病理?xiàng)l件下激活[10-12]。有很多證據(jù)可證明神經(jīng)缺血能引起caspases激活。在局灶及全腦缺血的動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元死亡之前有Caspase-3的活性上調(diào)。在動(dòng)脈粥樣硬化導(dǎo)致的中風(fēng)發(fā)生數(shù)小時(shí)內(nèi)，可見Caspase-3前體水平升高[13]。Caspase-2是一種啟動(dòng)酶，位于線粒體凋亡途徑的上游，當(dāng)Bax從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位于線粒體時(shí)激活該酶，從而誘導(dǎo)CytC和第2種線粒體源性caspase激活蛋白的釋放，而后激活Caspase-9[14]。Caspase-9是凋亡的線粒體途徑中的關(guān)鍵分子，可通過裂解Caspase-3酶原等效應(yīng)caspases，切割多二磷酸腺苷聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase, PARP]和多種其他細(xì)胞內(nèi)的底物,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[15]。多種人參皂苷的信號(hào)傳遞途徑均與凋亡有關(guān)。亦有研究證實(shí)，人參皂苷的干預(yù)確有促進(jìn)/抑制細(xì)胞凋亡活動(dòng)的作用。Caspase-9基因表達(dá)及蛋白含量在正常脊髓中處于低水平，自脊髓缺血后開始上升，至再灌注12 h至高峰后開始下降。藥物組各亞組值與單純?nèi)毖俟嘧⒔M相比，各時(shí)間點(diǎn)Caspase-9的表達(dá)及含量均下降(P<0.05)，說明在人參皂苷Rg1干預(yù)下Caspase-9表達(dá)下降。而脊髓缺血再灌注中凋亡是由Caspase-9作為主要的起始因子，而人參皂苷Rg1對(duì)于Caspase-9的抑制作用，亦考慮與其抑制線粒體途徑的凋亡有關(guān)。線粒體參與了壞死及凋亡途徑，這依賴于凋亡信號(hào)的強(qiáng)度。神經(jīng)組織缺血的嚴(yán)重打擊使得線粒體生成ATP功能障礙。盡管caspase依賴的凋亡需要ATP，但是ATP的突然下降仍能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[16]?；铙w實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在死亡刺激下，線粒體通透性升高，使得CytC、procaspase-9及Apaf-1釋放。在ATP或dATP存在時(shí)，Apaf-1與Cyt C形成多聚復(fù)合體。procaspase-9募集Apaf-1及Cyt C復(fù)合體，并自我裂解，這個(gè)全酶被稱作apoptosome，啟動(dòng)了下游凋亡級(jí)聯(lián)[17]。在一過性及永久性神經(jīng)缺血中，caspase-9激活Caspase-3，這一切均強(qiáng)烈提示在腦缺血后，線粒體介導(dǎo)的凋亡通路機(jī)制有caspases參與。人參皂苷Rg1通過穩(wěn)定線粒體外膜，減少了Cyt C釋放入胞質(zhì)的量。而在人參皂苷Rg1干預(yù)下，caspase-9的mRNA含量減少，可能與procaspase-9無(wú)法與Cyt C及Apaf-1結(jié)合形成apoptosome而在細(xì)胞內(nèi)堆積有關(guān)，推測(cè)這其中有一個(gè)負(fù)反饋機(jī)制，但這并未得到證實(shí)。從以上研究結(jié)果可確定，人參皂苷能夠抑制某些在凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有重要作用的分子，進(jìn)而達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的。

人survivin基因位于第17號(hào)染色體的q25帶上，基因長(zhǎng)度14.7 kb，相對(duì)分子質(zhì)量16 500，含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，其轉(zhuǎn)錄編碼產(chǎn)生一個(gè)由142個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)[18]。survivin的組織分布具有明顯的細(xì)胞選擇性，主要在胚胎組織及胸腺、胎盤等成熟組織中表達(dá)。除了抗凋亡外，survivin參與細(xì)胞有絲分裂的調(diào)控，其mRNA在G1期表達(dá)極低，S期為G1期的6倍，G2/M期則增高至40倍；survivin還參與血管生成的誘導(dǎo)，survivin還可通過促進(jìn)腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活而起到放療抵抗的作用[19]。目前多數(shù)研究著眼于肝癌、肺癌、宮頸癌等腫瘤的研究，也有部分研究涉及腦及腎缺血再灌注損傷，而對(duì)于SCII未曾涉及。從實(shí)驗(yàn)中可見，正常大鼠脊髓神經(jīng)元基本不表達(dá)survivin蛋白，從脊髓缺血后即見survivin基因少量表達(dá)，蛋白含量增高，至再灌注后基因表達(dá)及蛋白含量繼續(xù)上升，至再灌注后48 h仍有上升趨勢(shì)。其含量變化與caspase-9及AIF表達(dá)相反，提示survivin蛋白可能通過抑制caspase-9表達(dá)而達(dá)到抑制凋亡的目的。AIF位于線粒體內(nèi)膜，是位于線粒體的核基因編碼的黃素蛋白，分子質(zhì)量為67 ku，具有NADH氧化活性。SCII過程中，線粒體膜受損，AIF通過線粒體膜被釋放入細(xì)胞質(zhì)，移位進(jìn)入細(xì)胞核，激活核酸內(nèi)切酶G，將DNA分子切割為50 kb左右的片段，誘導(dǎo)非caspase依賴的凋亡[20]。在神經(jīng)系統(tǒng)，AIF移位發(fā)生在各種不同的毒性攻擊之后，包括NMDA介導(dǎo)的興奮性中毒、全腦缺血、局灶性腦缺血等過程中[21]。本課題組前期的研究也表明，在兔SCII模型中，可以見到血清及脊髓組織中AIF明顯升高，而燈盞細(xì)辛預(yù)處理可以抑制這種變化[22]。同理，在本實(shí)驗(yàn)中可見缺血再灌注組中AIF明顯升高，而在人參皂苷干預(yù)組AIF值則明顯低于缺血再灌注組，說明人參皂苷也具有相同的功能。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，在大鼠SCII過程中，人參皂苷Rg1可通過促進(jìn)survivin表達(dá)從而抑制caspase-9的表達(dá)，起到抑制凋亡的目的，發(fā)揮保護(hù)作用。這為人參皂苷Rg1在臨床上的應(yīng)用提供了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)依據(jù)。