Ⅲ期-Ⅳ期預(yù)后不佳DN患者血清蛋白標(biāo)志物分析*

劉垠浩，陳麗貞

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬漳州市中醫(yī)院，福建漳州 363000）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是一種由糖尿病引發(fā)、以腎臟微小血管病變?yōu)橹饕憩F(xiàn)的一種慢性疾病。DN時顯微鏡下可見腎小球硬化、基底膜增厚、系膜基質(zhì)增多，臨床上多表現(xiàn)為不同程度蛋白尿，可伴高血壓和浮腫，腎功能將隨著疾病發(fā)展逐漸惡化。目前，醫(yī)學(xué)界仍未能完全闡明DN的具體發(fā)病機制，故難以找到有效的根治方法。尿微量白蛋白（urinary microalbumin，MALB）在很長一段時間里，被認(rèn)為是診斷DN的無創(chuàng)傷性生物學(xué)標(biāo)記物[1]，但眾多研究發(fā)現(xiàn)其診斷的特異性及準(zhǔn)確性并不理想。周紅梅[2]對60例DN患者的MALB進行檢測，結(jié)果顯示陽性率僅為53.3%；朱曉英等[3]研究顯示，MALB對早期DN檢驗的靈敏度為67.5%，特異度為89.6%。因此，迫切需要找到更有效的辦法來診斷DN。

“蛋白質(zhì)組學(xué)”的概念于上世紀(jì)90年代被首次提出[4]，它將基因所表達的蛋白質(zhì)作為一個整體進行研究。隨著科技的高速發(fā)展，目前該技術(shù)逐漸成熟，眾多學(xué)者紛紛將其運用于DN領(lǐng)域的研究，試圖尋找出診斷DN更加敏感及特異性的標(biāo)志物[5-6]。本研究運用表面增強激光解吸/電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（surface enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，SELDI技術(shù)）檢測了Ⅲ期-Ⅳ期DN患者及健康者血清，通過篩選組間差異蛋白，從蛋白質(zhì)水平探討了DN預(yù)后不佳的血清標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 入選標(biāo)準(zhǔn) ⑴診斷標(biāo)準(zhǔn)：DN的診斷采用《中國糖尿病防治指南》中“糖尿病腎病的表現(xiàn)及分期”標(biāo)準(zhǔn)[7]。⑵納入標(biāo)準(zhǔn)：符合診斷標(biāo)準(zhǔn)；年齡≥18歲或≤70歲；運動+飲食+西藥降糖治療1周后，空腹血糖≤7.8mmol/L和餐后2h血糖＜10mmol/L者，或糖化血紅蛋白≤7.5%；腎小球濾過率60～130ml/min或24h尿蛋白定量≤3.5g；血壓控制在＜180/110mmHg；接受并簽署知情同意書。⑶排除標(biāo)準(zhǔn)：其它原因所致的尿蛋白增多者(如泌尿系感染、高血壓、免疫疾患、心力衰竭等)；合并乙肝、結(jié)核等傳染性疾病，肝功能異常者；糖尿病酮癥酸中毒者；被醫(yī)生判定不宜納入研究者。

1.2 一般資料 2017年1月-2018年6月符合入選標(biāo)準(zhǔn)的50例住院Ⅲ期-Ⅳ期DN患者的血清標(biāo)本，分為預(yù)后不佳組和預(yù)后良好組。預(yù)后不佳組滿足以下≥3個條件[8-9]：尿白蛋白排泄率＞30mg/d，腎小球濾過率＜90ml/min，顯微鏡下見K2W結(jié)節(jié)，臨床出現(xiàn)血壓輕至中度升高，伴不同程度的水腫。

采集同期25例健康體檢者血清標(biāo)本作為對照組。三組在性別、年齡等方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1：

表1 三組受試者一般資料比較(±s )

表1 三組受試者一般資料比較(±s )

組別 n 男 女 年齡/歲 病程（年）預(yù)后不佳組 27 14 13 45.00±18.76 8.53±5.49預(yù)后良好組 23 11 12 38.60±14.87 6.28±3.11正常對照組 25 10 15 47.14±17.05 ——

1.3 標(biāo)本、芯片的處理及數(shù)據(jù)的處理 將制備好的血清加入含適量裂解液的EP管中，4℃下靜置30分鐘后加入緩沖液，吹打血清樣品；芯片每孔加入緩沖液震蕩處理后每孔加入制備好的血清樣品100μl，4℃震蕩1小時、甩出樣品；將200μl的結(jié)合緩沖液加入芯片，室溫震蕩5分鐘，甩出液體，共操作2次；每孔加入200μl去離子水后甩出；將基質(zhì)物質(zhì)(SPA，芥子酸)同富集的蛋白液混合，而后將其加到蛋白芯片上風(fēng)干，直至達到共結(jié)晶狀態(tài)；最后使用SELDI-TOFMS質(zhì)譜儀（美國Ciphergen Biosystems Inc公司）檢測。

采用Ciphergen ProteinChip、Biomarker WizardTM和Biomarker PatternsTM Software等軟件進行數(shù)據(jù)的收集和分析，最終由BPS軟件處理后生成結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。各組檢測數(shù)據(jù)用（±s）表示，組間比較用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DN預(yù)后不佳組與正常對照組比較 27例DN預(yù)后不佳組與25例正常對照組質(zhì)荷比（M/Z）數(shù)據(jù)對比后顯示，M/Z為2687.14、3125.76、5904.29、7928.55和11401.03的這5個蛋白質(zhì)的荷比峰比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1、表2：

表2 DN預(yù)后不佳組與正常對照組質(zhì)荷比數(shù)據(jù)比較（±s ）

M/Z(Da) DN預(yù)后不佳組（n=27） 正常對照組（n=25） P 2687.14 2.94±2.65 0.91±0.42 0.030 3125.76 5.24±3.06 0.87±1.11 0.042 5904.29 2.23±1.96 0.71±0.58 0.035 7928.55 3.71±2.06 1.38±1.19 0.040 11401.03 4.49±2.74 1.55±0.88 0.020

2.2 DN預(yù)后良好組與正常對照組比較 23例DN預(yù)后良好組與25例正常對照組M/Z數(shù)據(jù)對比后顯示，M/Z為3729.41、7928.55的這2個蛋白質(zhì)的荷比峰比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3：

表3 DN預(yù)后良好組與正常對照組質(zhì)荷比數(shù)據(jù)比較（±s ）

表3 DN預(yù)后良好組與正常對照組質(zhì)荷比數(shù)據(jù)比較（±s ）

M/Z(Da) DN預(yù)后良好組（n=23） 正常對照組（n=25） P 3729.41 3.77±2.42 0.87±1.16 0.040 7928.55 6.53±7.07 3.05±2.34 0.030

2.3 DN預(yù)后不佳組與預(yù)后良好組比較 27例DN預(yù)后不佳組與23例預(yù)后良好組M/Z數(shù)據(jù)對比后顯示，M/Z為3125.76、4237.91、6678.24和13754.80的這4個蛋白質(zhì)的荷比峰比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2、表4：

表4 DN預(yù)后不佳組與預(yù)后良好組質(zhì)荷比數(shù)據(jù)比較（±s ）

表4 DN預(yù)后不佳組與預(yù)后良好組質(zhì)荷比數(shù)據(jù)比較（±s ）

M/Z(Da) 預(yù)后不佳組（n=27） 預(yù)后良好組（n=23） P 3125.76 2.48±4.51 1.19±1.07 0.030 4237.91 3.01±2.54 1.42±0.63 0.020 6678.24 4.45±3.98 0.78±1.12 0.040 13754.80 1.31±0.92 0.57±0.34 0.035

圖2 DN預(yù)后不佳組與預(yù)后良好組蛋白質(zhì)指紋圖譜

3 討論

蛋白質(zhì)是構(gòu)成人體組織的重要成分，發(fā)生疾病時必然伴隨著蛋白質(zhì)的變化，因此，蛋白質(zhì)的變化可能為闡明疾病的發(fā)生機制和疾病的治療提供新途徑。蛋白組學(xué)的研究方法通過整體層面觀察蛋白質(zhì)的特性、表達和相互作用，能全面實現(xiàn)對細(xì)胞、器官甚至生命體的研究[10]。眾多疾病均可導(dǎo)致血液中的蛋白質(zhì)發(fā)生變化，且血液標(biāo)本采集方便，容易被患者接受，利用血液標(biāo)本結(jié)合SELDI技術(shù)實現(xiàn)疾病的早期診療，已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的研究熱點。

DN是導(dǎo)致終末期腎臟病的主要原因之一，蛋白尿、高血壓是公認(rèn)的影響DN預(yù)后的危險因素[11-12]，且腎小球濾過率及病理分型在一定層面上可預(yù)測DN病情的進展速度和預(yù)后。安玉等[8]研究顯示，DN患者隨著腎小球病變的加重，蛋白尿逐漸增加，腎小球濾過率逐漸下降；MISE等[9]對205例DN患者的研究顯示，腎小球病變分級與腎臟預(yù)后有關(guān)，隨著腎小球病變加重，腎臟預(yù)后逐漸變差。因此，本研究利用尿白蛋白排泄率、腎小球濾過率、腎臟病理分級、血壓升高程度、是否浮腫等作為主要參考指標(biāo)與判定入選病人的標(biāo)準(zhǔn)，再對入選病人進行分組，試圖尋找Ⅲ期-Ⅳ期DN患者預(yù)后不佳的差異蛋白。本研究結(jié)果顯示，DN預(yù)后良好組與正常對照組比較，存在2個呈現(xiàn)高表達狀態(tài)的差異蛋白；DN預(yù)后良好組與預(yù)后不佳組比較，存在4個呈現(xiàn)高表達狀態(tài)的差異蛋白；DN預(yù)后不佳組與正常對照組比較，存在5個呈現(xiàn)高表達狀態(tài)的差異蛋白。在排除了“背景噪音”、儀器最佳分辨度等方面存在誤差的影響后，M/Z為3125.76Da的蛋白在Ⅲ期-Ⅳ期DN預(yù)后不佳組呈現(xiàn)特異高表達，且明顯高于正常對照組與預(yù)后良好組。

雖然蛋白組學(xué)技術(shù)為探索疾病的發(fā)生機制和診療方法提供了新的平臺，但仍有不足之處。首先，國際上應(yīng)盡快制定統(tǒng)一評價標(biāo)準(zhǔn)來規(guī)范樣本的制備；其次，蛋白組學(xué)的檢測技術(shù)在操作過程中易被核酸干擾，而且測定混合有機成分時較不準(zhǔn)確[13]；第三，數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理方式仍有提高空間；第四，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫目前規(guī)模有限，難以提供較為完整準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)查詢。但是蛋白組學(xué)廣闊的研究方向及應(yīng)用前景，值得繼續(xù)深入探索。