處理方式對西藏光核桃功能因子及其抗氧化活性的影響

左力旭 劉常金 畢金峰 呂 健 金 鑫 周 沫

(1. 天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，北京 100193)

光核桃[1](PrunusmiraKoehne)作為西藏地區(qū)的特色野生林果，每年產(chǎn)量在5 000 t以上[2]，大部分果實成熟后自然脫落，僅少部分用于鮮食，資源浪費嚴重。

超聲、壓差閃蒸和蒸汽熱燙作為果蔬加工的常用技術，可鈍化物料內(nèi)源酶活性，抑制酶促反應[3-4]，破壞細胞結(jié)構，改變物料組織狀態(tài)[5-6]，有效提高產(chǎn)品加工效率及食用品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，蒸汽熱燙處理能夠有效剝離獼猴桃[7]、番茄果皮[8]。豐水梨經(jīng)熱風預干燥，利用壓差閃蒸技術制得的脆片，多酚保留量最高，食用品質(zhì)最佳[9]。超聲處理能夠有效去除番茄皮[10]，加快荷蘭芹干燥速率，提高葉綠素、葉黃素等物質(zhì)的保留率[11]。桃果實味道香甜，營養(yǎng)豐富，富含多酚、黃酮、果膠等功能因子[12]，但在加工過程中功能因子極易被破壞，降低了桃產(chǎn)品的食用價值。目前，關于光核桃中多酚、黃酮、果膠等功能因子的含量以及超聲、壓差閃蒸和蒸汽熱燙處理對光核桃功能因子的影響均尚未見報道。

多酚、黃酮、多糖、果膠等功能因子，具有清除人體自由基，減緩細胞氧化，抗炎、抗癌等功效[13-14]。為進一步提升光核桃的價值空間，開發(fā)高附加值產(chǎn)品，提高其資源利用率，本研究擬采用超聲、壓差閃蒸、蒸汽熱燙3種處理方式對光核桃多酚、黃酮、多糖、果膠等功能因子含量及其抗氧化活性的影響，探究功能因子含量與抗氧活性之間的關系，旨在為光核桃的有效利用和新產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

光核桃：于2018年9月3日采自西藏林芝地區(qū)，冷鏈空運至北京，4 ℃冷庫貯藏備用；

無水碳酸鈉、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、九水合硝酸鋁、無水乙醇、濃硫酸、甲醇、鹽酸、過硫酸鉀、三氯化鐵：分析純，國藥集團化試劑有限公司；

沒食子酸、蘆丁、半乳糖醛酸等標品、福林酚試劑、水溶性維生素E(Trolox)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2，2′-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)：分析純，美國Sigma公司。

1.1.2 主要儀器設備

電子天平：CPA-125型，德國Sartortific公司；

數(shù)控超聲波反應器：DT400型，北京弘祥隆生物技術股份有限公司；

脈動壓差閃蒸干燥設備：QDPH10-1型，天津市勤德新材料科技有限公司；

高效液相色譜：Waters-1525型，美國Waters公司；

離心機：5804R型，德國Eppendorf公司；

水分活度儀：WA-99163型，美國Decagong公司；

紫外—可見分光光度計：UV1800型，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 處理方式

(1) 超聲處理：樣品置于超聲波反應器內(nèi)，設定操作參數(shù)為：頻率40 kHz、功率0.48 kW，時間分別為10，20，30 min。

(2) 壓差閃蒸處理：樣品置于脈動壓差閃蒸干燥設備的物料托盤中，設定操作參數(shù)為：閃蒸溫度 95 ℃，停滯時間10 min，閃蒸次數(shù)分別為 1，2，3。

(3) 蒸汽熱燙處理：樣品置于蒸鍋內(nèi)，蒸汽溫度設為100 ℃，處理時間分別為1，2，3 min。

1.2.2 水分含量的測定 參考GB 5009.3—2016的直接干燥法。

1.2.3 可溶性固形物的測定 參考NY/T 2637—2014的折射儀法。

1.2.4 水分活度的測定 將物料切成薄片，鋪滿檢測盒底部，放進水分活度測定儀進行測定。

1.2.5 功能因子含量的測定

(1) 多酚含量的測定：準確稱取樣品2.00 g，加入80%甲醇10 mL，超聲輔助提取1 h后于4 ℃、9 000 r/min離心15 min，取上清液。重復提取2次，合并上清液，定容至100 mL 即得多酚提取液。含量測定參照Folin-Ciocalteu法[15]，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，結(jié)果表示為每克干樣品中所含沒食子酸當量(mg GAE/g DB)。

(2) 單酚含量的測定：參考Oliveira等[16]的方法并稍作修改。取1.2.5(1)中多酚提取液過0.45 μm有機系濾膜作為待測液。Agilent TC-C18 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，進樣量10 μL。洗脫程序為：A相為2%甲酸水，B相為丙酮(0 min，A∶B=95∶5；20 min，A∶B=75∶25；40 min，A∶B=60∶40；45min，A∶B=75∶25；50 min，A∶B=95∶5；55 min，A∶B=95∶5)。采用外標法計算樣品中單酚含量。

(3) 黃酮含量的測定：取1.2.5(1)中多酚提取液1 mL作為待測液，參照Mokrani等[17]的方法進行測定。以蘆丁為標準品繪制標準曲線，結(jié)果表示為每克干樣品中所含蘆丁當量(mg RE/g DB)。

(4) 多糖含量的測定：準確稱取樣品2.00 g，加入40 mL蒸餾水，90 ℃水浴浸提1 h，超聲輔助提取1 h，抽濾，濾液加入其體積4倍的無水乙醇，4 ℃醇沉24 h后抽濾，濾渣溶解定容至100 mL，3 500 D透析袋透析72 h得多糖待測液。采用苯酚—硫酸法[18]進行測定，以葡萄為標準品繪制標準曲線，結(jié)果表示為每克干樣品中所含葡萄糖當量(mg GE/g DB)。

(5) 果膠含量的測定：準確稱取樣品30.00 g，加入95%乙醇150 mL，醇沉14 h后過濾，濾渣用95%乙醇洗滌至無色后于40 ℃烘箱烘干，得到醇不溶性物質(zhì)(AIR)。準確稱取0.50 g AIR，加入90 mL蒸餾水，沸水浴5 min，冷卻后過濾，濾液定容至100 mL，3 500 D透析袋透析72 h 得果膠待測液。參考 Mccready等[19]的方法進行含量測定，以半乳糖醛酸為標準品繪制標準曲線，結(jié)果表示為每克醇不溶性物質(zhì)中半乳糖醛酸當量(mg GalA/g AIR)。

1.2.6 功能因子抗氧化活性的測定

(1) DPPH自由基清除能力：參考Si等[20]的方法并稍作修改。將2 mL樣品或Trolox標準液與4 mL 100 μmol/L DPPH混勻，暗處靜置30 min，517 nm處測吸光值，結(jié)果表示為每克干樣品中所含Trolox當量(μmol Trolox/g)。

(2) ABTS自由基清除能力：參Yeoh等[21]的方法并稍作修改。將0.4 mL樣品或Trolox標準液與3.6 mL 100 μmol/L ABTS混勻，734 nm處測吸光值，結(jié)果表示為μmol Trolox/g。

(3) FRAP鐵離子還原能力：參考Jayasekera等[22]的方法并稍作修改。將0.2 mL樣品或Trolox標準液與6 mL FRAP混勻，37 ℃條件下保溫30 min，593 nm處測吸光值，結(jié)果表示為μmol Trolox/g。

1.2.7 統(tǒng)計方法 采用Excel、SPSS 20對數(shù)據(jù)進行處理，Origin 8.5進行作圖。每組試驗重復3次，試驗結(jié)果以平均值±標準偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 處理方式對光核桃水分含量、可溶性固形物、水分活度的影響

由表1可知，超聲處理破壞了光核桃的細胞結(jié)構，部分內(nèi)容物流失[23]，可溶性固形物減少；自由水增加，水分含量和水分活度升高。壓差閃蒸處理使光核桃內(nèi)部水分瞬間蒸發(fā)，水分含量和水分活度降低；細胞在壓差作用下脹裂，物料孔隙度增加[24]，促進內(nèi)容物溶出，可溶性固形物增加。蒸汽熱燙處理在光核桃表面形成薄水層，水分含量增加，水分活度升高；部分細胞在熱力作用下坍塌[5]，內(nèi)容物流失，可溶性固形物略有降低。

表1 處理方式對光核桃水分含量、可溶性固形物、水分活度的影響?

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.2 處理方式對光核桃功能因子含量的影響

2.2.1 多酚和單酚含量 酚類物質(zhì)主要分布在植物細胞的液泡中，處理方式對液泡破壞程度不同，對酚類物質(zhì)的影響也不同[25]。相比對照組，超聲和壓差閃蒸處理均不利于光核桃多酚的保留，蒸汽熱燙處理可顯著提高光核桃多酚的含量(圖1)，其中，光核桃經(jīng)蒸汽熱燙1 min，多酚含量增加了20%。由圖2可知，蒸汽熱燙處理能夠較好地保留光核桃的主要單酚(新綠原酸、兒茶素和綠原酸)物質(zhì)。與新綠原酸相比，綠原酸和兒茶素相對穩(wěn)定，保留率較高。相比較對照組，蒸汽熱燙對綠原酸、兒茶素含量基本無影響，而超聲處理和壓差閃蒸處理降低綠原酸和兒茶素含量；而3種處理方式對新綠原酸均有破壞作用。

研究發(fā)現(xiàn)超聲通過破壞植物細胞可高效輔助提取多酚[6]、多糖[26]、果膠[27]等功能性物質(zhì)。同樣，超聲處理可促進光核桃中酚類物質(zhì)溶出，但超聲引起的局部高溫(5 000 K)導致水分子分解，產(chǎn)生·OH，酚類物質(zhì)因猝滅自由基造成檢測量降低[28]。壓差閃蒸通過高溫和壓力差推動光核桃內(nèi)部水分快速蒸發(fā)，液泡和細胞膜破裂，形成多孔通道[29]，引起酚類物質(zhì)與氧氣發(fā)生氧化降解。蒸汽熱燙過程中，光核桃表面形成隔氧薄水層，高溫鈍化多酚氧化酶，二者有效阻止酚類物質(zhì)被氧化[30]，但過長時間的熱處理會導致多酚降解。

2.2.2 黃酮含量 黃酮是2個帶有酚羥基的苯環(huán)經(jīng)由中心三碳鏈相互連接而形成的一系列化合物[31]，屬于酚類物質(zhì)。由圖3可知，蒸汽熱燙處理對光核桃中黃酮的保留率顯著高于超聲和壓差閃蒸處理。其中，超聲處理30 min，黃酮含量僅為對照組的1/3。壓差閃蒸1次，黃酮含量約為對照組的70%。蒸汽熱燙3 min時，黃酮含量高出對照組5 mg RE/g DB左右。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖2 處理方式對光核桃單酚含量的影響

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.2.3 多糖含量 相比較對照組，光核桃經(jīng)超聲處理后多糖含量顯著降低，且隨處理時間延長不斷減少(圖4)。光核桃多糖含量隨壓差閃蒸次數(shù)的增加呈升高趨勢，壓差閃蒸3次時，多糖含量比對照組高出11.84%。蒸汽熱燙顯著提高光核桃多糖的含量，且隨處理時間的延長而增加，與張霽[32]的研究結(jié)果一致。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

多糖是結(jié)構復雜的大分子聚合物，在較強外力作用下易發(fā)生降解。研究[33-34]發(fā)現(xiàn)超聲可打斷C—O—C和C—O—H鍵，使多糖主鏈斷裂，降解為寡糖甚至單糖，導致多糖含量降低。壓差閃蒸產(chǎn)生的壓力差可破壞光核桃完整的細胞結(jié)構，高濕高熱水蒸氣帶動組織中高分子物質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)移，形成疏松的多孔通道，促進多糖物質(zhì)溶出[35]。在蒸汽熱燙處理過程中，纖維素、半纖維素、果膠等細胞壁物質(zhì)受熱發(fā)生解聚重排，引起光核桃組織松弛坍塌，促進可溶性多糖溶出[36]。

2.2.4 果膠含量 光核桃經(jīng)不同處理后的果膠含量如圖5 所示，其變化趨勢與多糖含量的變化趨勢一致，推測果膠可能是光核桃多糖的主要成分。此外，除超聲處理30 min外，其他處理組果膠含量均高于對照組，其中蒸汽熱燙3 min時果膠含量高達(57.00±2.74) mg GalA/g AIR。由此可見，3種處理方式均能促進光核桃果膠的溶出。研究發(fā)現(xiàn)超聲可通過破壞細胞壁促進果膠的溶出[37]，壓差閃蒸使大分子物質(zhì)發(fā)生分離重排，促使纖維素表面結(jié)合不緊密的果膠脫離，引起果膠含量增加[38]，蒸汽熱燙使細胞壁果膠發(fā)生脫甲酯化和β-解聚，降低果膠與纖維素等物質(zhì)的結(jié)合，促進果膠溶出[39]。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.3 處理方式對光核桃功能因子抗氧化活性的影響

DPPH自由基清除能力、FRAP鐵離子還原能力和ABTS自由基清除能力是功能因子體外抗氧化活性最常用的評價方法。其中，DPPH自由基通過單電子氧化酚羥基和中間產(chǎn)物歧化反應2個過程將酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì)，自身還原為DPPH2[40]。FRAP鐵原子還原試驗是在低pH條件下，酚類、維生素C等抗氧化活性物質(zhì)通過提供氫原子終止自由基鏈反應，將Fe3+-TPTZ還原為Fe2+[41]。不同試樣與ABTS自由基反應機制不同，電子轉(zhuǎn)移和氫質(zhì)子轉(zhuǎn)移2種途徑均可清除ABTS自由基，優(yōu)勢途徑與試樣的組成、結(jié)構相關[42]。

2.3.1 多酚和黃酮的抗氧化活性 由表2可知，相比較對照組，光核桃經(jīng)蒸汽熱燙處理后，多酚和黃酮含量顯著升高，羥基數(shù)目隨之增加，多酚和黃酮DPPH自由基清除能力、FRAP鐵離子還原能力和ABTS自由基清除能力均顯著提高。光核桃多酚和黃酮的含量及其抗氧化活性隨超聲、壓差閃蒸處理呈顯著降低趨勢。光核桃多酚和黃酮的DPPH自由基清除能力和FRAP鐵原子還原能力隨超聲處理時間延長、閃蒸次數(shù)增加、蒸汽熱燙時間延長呈增加或減少趨勢，而ABTS自由基清除能力無明顯趨勢，這是由于ABTS自由基的清除因試樣結(jié)構及組成不同達到的反應終點不同造成的[43]。

2.3.2 多糖的抗氧化活性 相比較超聲處理，壓差閃蒸和蒸汽熱燙處理可顯著提高光核桃多糖的抗氧化活性(表3)。相比較對照組，只有蒸汽熱燙處理能顯著提高光核桃多糖的DPPH自由基清除能力和FRAP鐵原子還原能力。光核桃受熱后多糖鏈斷裂，分子量降低，構象改變，大量羥基基團暴露，抗氧化活性升高[26,44]。

2.3.3 果膠的抗氧化活性 超聲、壓差閃蒸和蒸汽熱燙處理均可顯著提高光核桃果膠的抗氧化活性(表4)，其中，壓差閃蒸處理對果膠抗氧化活性的提高最為顯著。由圖5可知，光核桃經(jīng)蒸汽熱燙處理后果膠含量高于壓差閃蒸處理，但其抗氧化活性顯著低于壓差閃蒸處理(表4)，可能是壓差閃蒸處理使果膠鏈斷裂，抗氧化基團暴露，構象發(fā)生改變，抗氧化活性加強[44]。

表2處理方式對光核桃多酚和黃酮抗氧化活性的影響?

Table2EffectofdifferenttreatmentsonantioxidantcapacityofpolyphenolandflavoneofPrunusmiraKoehne μmolTrolox/g

處理方式DPPHFRAPABTS對照組185.35±2.61c207.50±0.29d67.85±0.70a超聲處理10min104.46±1.72g128.16±0.72h30.19±1.17f超聲處理20min80.46±0.30h117.92±1.98i21.11±1.80g超聲處理30min76.98±1.54h102.20±0.45j38.35±0.86e壓差閃蒸1次147.45±2.88f161.66±1.73g45.90±0.46d壓差閃蒸2次151.95±1.11e183.23±1.06f46.22±0.66d壓差閃蒸3次157.36±2.41d187.44±2.64e49.92±1.02c蒸汽熱燙1min203.87±1.33b261.39±0.45c68.04±2.37a蒸汽熱燙2min205.46±0.75b264.29±0.63b60.37±1.21b蒸汽熱燙3min210.47±2.41a273.93±0.32a66.90±1.43a

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表3處理方式對光核桃多糖抗氧化活性的影響?

Table3EffectofdifferenttreatmentsonantioxidantcapacityofpolysaccharidesofPrunusmiraKoehne μmolTrolox/g

處理方式DPPHFRAPABTS對照組3.97±0.01c6.67±0.18a6.15±0.18c超聲處理10min1.31±0.18d2.13±0.09g1.53±0.13h超聲處理20min1.35±0.28d1.65±0.30h1.57±0.11gh超聲處理30min1.36±0.12d1.24±0.23i1.76±0.11g壓差閃蒸1次4.35±0.05b4.17±0.18d6.50±0.04b壓差閃蒸2次4.01±0.02c6.27±0.16b6.44±0.10b壓差閃蒸3次4.09±0.09c5.84±0.11c5.56±0.08e蒸汽熱燙1min5.16±0.11a6.72±0.18a6.98±0.11a蒸汽熱燙2min4.20±0.14bc3.67±0.11e5.89±0.12d蒸汽熱燙3min4.14±0.17bc3.33±0.07f5.16±0.02f

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 不同處理條件下光核桃功能因子含量與其抗氧化活性的關系

光核桃多酚含量與DPPH自由基清除能力、FRAP鐵原子還原能力、ABTS自由基清除能力的線性相關系數(shù)分別為0.794，0.756，0.573[圖6(a)]，黃酮分別為0.991，0.885，0.945[圖6(b)]，多糖分別為0.857，0.802，0.572[圖6(c)]，果膠分別為0.057，0.069，0.047[圖6(d)]。綜合而言，DPPH自由基清除能力與多酚、黃酮、多糖含量均呈顯著線性相關，量效關系明顯，因此可用DPPH自由基清除能力表征光核桃中功能性物質(zhì)含量與其抗氧化活性之間的關系。

表4處理方式對光核桃果膠抗氧化活性的影響?

Table4EffectofdifferenttreatmentsonantioxidantcapacityofpectinofPrunusmiraKoehneμmolTrolox/gAIR

處理方式DPPHFRAPABTS對照組132.67±1.09e125.03±4.07g169.15±4.66e超聲處理10min163.84±4.83bcd156.05±2.10f197.67±2.42cd超聲處理20min165.71±4.92bc155.71±5.18de198.41±2.10cd超聲處理30min170.62±2.78b171.78±3.10d203.96±2.85c壓差閃蒸1次209.58±4.36a225.37±3.98ab243.41±7.58b壓差閃蒸2次216.36±6.38a231.01±3.74a269.15±7.14a壓差閃蒸3次217.09±8.13a220.67±5.77b246.93±9.33b蒸汽熱燙1min165.86±5.16bc192.97±1.68c196.00±7.88cd蒸汽熱燙2min157.78±7.12cd161.95±4.89ef193.41±0.64d蒸汽熱燙3min163.26±7.33d156.74±4.27f191.37±0.64d

? 同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3 結(jié)論

① 超聲處理和壓差閃蒸處理均不利于光核桃多酚、黃酮、多糖含量及抗氧化活性的保留，但超聲處理可提高果膠的抗氧化活性，壓差閃蒸處理可提高多糖、果膠的抗氧化活性；② 蒸汽熱燙能夠顯著提高光核桃多酚、黃酮、多糖、果膠的含量及其抗氧化活力；③ 光核桃經(jīng)不同處理后，其多酚、黃酮、多糖含量與DPPH自由基清除能力呈正相關，量效關系顯著，因此DPPH法能穩(wěn)定表征功能因子含量與抗氧化活性之間的關系。綜上所述，蒸汽熱燙處理可作為保留光核桃功效因子的有效預處理技術，后續(xù)研究將圍繞蒸汽熱燙處理對光核桃系列產(chǎn)品品質(zhì)的影響展開。

圖6 光核桃功能因子含量與其抗氧化活性之間的擬合關系