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    2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的制備及抗菌活性研究

    2019-07-09 00:51:36袁曉嫻姜啟興劉曉麗陳琬雯夏文水
    食品與機(jī)械 2019年6期
    關(guān)鍵詞:二氯苯寡糖乙酸

    袁曉嫻 樂 琳 姜啟興 劉曉麗 陳琬雯 夏文水 平 原

    (1. 江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇 無錫 214122;2. 江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 無錫 214122;3. 蘇州豐倍生物科技有限公司,江蘇 蘇州 215000)

    殼寡糖(COS)是一種來源廣泛、無毒、溶解性好、具有抗菌性的多糖[1-2],將殼寡糖應(yīng)用于食品行業(yè)中,不僅可以抑制微生物的生長(zhǎng),延長(zhǎng)食品保質(zhì)期,還能夠改善食品的質(zhì)量[3-4],但是殼寡糖的抗菌性較弱[5],通過化學(xué)改性,將具有強(qiáng)抗菌性的物質(zhì)接入殼寡糖中,可以進(jìn)一步提高其抗菌性。有研究表明,將香葉醇[6]、曲酸[7-8]、富馬酸[4]、富馬酸單甲酯[9-10]等具有抗菌性的物質(zhì)接入殼寡糖(殼聚糖)中,均能有效提高抗菌性。

    殼寡糖上有3個(gè)改性位點(diǎn),分別為C-2位氨基[11-13]、C-3位羥基[14]、C-6羥基[15]。有研究[16]表明,因?yàn)榘被哂幸粚?duì)強(qiáng)親核性的孤對(duì)電子,其反應(yīng)活性較羥基的高;殼寡糖的抗菌性有可能是由于C-2氨基的存在[15],在酸性條件下,質(zhì)子化的氨基帶有正電荷,會(huì)與微生物細(xì)胞壁上的負(fù)電荷相互作用,從而影響微生物的生長(zhǎng)代謝[2];另由于C-3羥基存在空間位阻,C-6羥基的反應(yīng)活性較C-3羥基高,因此本試驗(yàn)選定C-6位羥基為改性位點(diǎn),保留其具有抗菌作用的氨基。2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是GB 2760—2014允許的一種食品用香料,在水果保鮮中應(yīng)用廣泛,同時(shí)也可作為防腐劑延長(zhǎng)食品保質(zhì)期[17]。但2,4-D的毒性殘留問題限制了其應(yīng)用范圍,對(duì)2,4-D衍生物、類似物進(jìn)行研究和篩選得到具有2,4-D生物活性的物質(zhì),必將提高其在果蔬保鮮和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍[18]。黃麗[19]以2,4-D為囊芯,以明膠/殼寡糖/葡甘聚糖為壁材制備的復(fù)合微球具有良好的緩釋性能,該復(fù)合微球可望在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等行業(yè)得到應(yīng)用。至今并未有研究涉及將2,4-D接入殼寡糖中并測(cè)定該種新物質(zhì)的理化性質(zhì)。本研究擬將2,4-二氯苯氧乙酸與殼寡糖反應(yīng),通過傅里葉紅外、紫外可見吸收、1H核磁共振對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征,所制備的新型食品添加劑2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯(Dcpo-O-COS),以期提高殼寡糖的抗菌性,擴(kuò)大殼寡糖在食品中的應(yīng)用范圍。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    1.1.1 材料與試劑

    殼寡糖:相對(duì)分子質(zhì)量1.5 kDa,脫乙酰度90%,浙江金科藥業(yè)有限公司;

    2,4-二氯苯氧乙酸:97%,阿拉丁試劑有限公司;

    甲烷磺酸、氯化亞砜、氨水、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙醇等:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

    大腸桿菌、金黃色葡萄球菌:江南大學(xué)食品學(xué)院生物技術(shù)中心微生物實(shí)驗(yàn)室。

    1.1.2 主要儀器設(shè)備

    水浴鍋:DK-8AXX型,上海一恒科技有限公司;

    旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:RE-52AA型,上海亞榮生化儀器廠;

    酸度計(jì):FE20K型,梅特勒—托利多儀器有限公司;

    高速冷凍離心機(jī):3K15型,德國(guó)Sigma公司;

    傅里葉變換紅外光譜儀: Nicolet NexuS470型,美國(guó)Nicolet Instrument Thermo公司;

    紫外—可見分光光度計(jì):UV-1000型,上海天美科學(xué)儀器有限公司;

    全數(shù)字化核磁共振波譜儀:Brucker AV400 MHz型,德國(guó)布魯克AXS有限公司;

    X-射線衍射儀:D8Advanca型,德國(guó)布魯克AXS有限公司;

    熱重分析儀:TGA2型,梅特勒—托利多儀器有限公司;

    恒溫振蕩器:THZ-D型,太倉(cāng)市豪誠(chéng)實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司;

    立式壓力蒸汽滅菌器:LDZX-50KBS型,上海申安醫(yī)療器械廠;

    隔水式培養(yǎng)箱:GHP-9080N型,上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

    1.2 方法

    1.2.1 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯(Dcpo-O-COS)的合成路線 如圖1所示。具體操作:

    圖1 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯(Dcpo-O-COS)的合成路線圖

    (1) 殼寡糖氨基的保護(hù)。保護(hù)殼寡糖上反應(yīng)活性較高的氨基,以避免其參與反應(yīng)。常見的殼寡糖氨基的保護(hù)方法有:Schiff堿法[8]、鄰苯二甲酸酐保護(hù)法[20]、對(duì)甲基苯磺酸成鹽法、甲磺酸保護(hù)法[21]等。本試驗(yàn)采用甲磺酸保護(hù)氨基,優(yōu)點(diǎn)是在脫保護(hù)過程中不會(huì)對(duì)酯鍵造成影響。取0.02 mol的殼寡糖,在冰浴條件下溶解在30 mL甲烷磺酸中,反應(yīng)30~60 min,使甲烷磺酸與殼寡糖的氨基形成甲烷磺酸鹽,從而防止氨基參與后續(xù)反應(yīng)。

    (2) 2,4-二氯苯氧乙酸的羧基活化,以提高反應(yīng)活性。采用酰氯化的方法來活化羧基[21]。取0.02 mol的2,4-二氯苯氧乙酸于圓底燒瓶中,再加入17 mL的SOCl2,60 ℃反應(yīng)6 h,反應(yīng)過程應(yīng)注意嚴(yán)格控制干燥條件,防止水分進(jìn)入發(fā)生水解,冷卻至室溫后,旋蒸除去未反應(yīng)的SOCl2,得到的透明液體為2,4-二氯苯氧乙酰氯。

    (3) 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯磺酸鹽的制備。將殼寡糖甲烷磺酸鹽逐滴加入2,4-二氯苯氧乙酰氯中,室溫下反應(yīng)4 h,-18 ℃貯藏過夜,加入過量丙酮,沉淀,11 000 r/min 離心5 min使固液分離,用丙酮洗滌上清液至無色,乙醇洗滌2次,得到產(chǎn)物2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯磺酸鹽。

    (4) 氨基脫保護(hù)。將2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯磺酸鹽溶于一定量的去離子水中,用氨水調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0,析出褐色沉淀,11 000 r/min離心5 min使固液分離,將沉淀用丙酮洗滌至上清液無色,乙醇抽提48 h以去除醇溶性雜質(zhì),真空干燥后得最終產(chǎn)品2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯(Dcpo-O-COS)。

    1.2.2 結(jié)構(gòu)表征及性質(zhì)測(cè)定

    (1) 傅里葉紅外光譜:殼寡糖及2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的紅外光譜通過傅里葉變換紅外光譜儀測(cè)定,采用溴化鉀壓片法測(cè)定,以溴化鉀為背景,掃描范圍為4 000~500 cm-1,分辨率為4 cm-1。

    (2) 紫外可見吸收光譜:殼寡糖及2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的紫外吸收光譜通過紫外—可見分光光度計(jì)測(cè)定,紫外分光光度計(jì)的狹縫寬度為2 nm。以去離子水為空白,測(cè)定殼寡糖及2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的紫外全波長(zhǎng)光譜。

    (3)1H核磁共振圖譜:樣品的1H核磁共振圖譜是由全數(shù)字化核磁共振波譜儀測(cè)定,殼寡糖的測(cè)定條件為:溫度25 ℃,溶劑為重水;2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的測(cè)定條件為:溫度60 ℃,溶劑為氘代DMSO。

    (4) X射線衍射:樣品的X射線衍射圖譜的測(cè)定采用X射線衍射儀,掃描條件:X光管為陶瓷型,Cu靶,射線波長(zhǎng)為0.154 nm,光管功率為2.2 kW,X射線發(fā)生器輸出功率300 W,管壓40 kV,電流50 mA,掃描溫度25 ℃,掃描速度2°/min,掃描范圍5°~60°。

    (5) 熱穩(wěn)定性:由熱分析儀器測(cè)定。檢測(cè)條件為:N2流速20 mL/min,升溫速率為20 ℃/min,加熱溫度范圍為30~450 ℃。

    (6) 抑菌性:菌種活化:挑取單一菌落于LB液體培養(yǎng)基中,30 ℃,180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,吸取200 μL一代菌液于新的10 mL LB液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)至OD600=0.5。菌液制備:將二代菌液進(jìn)行梯度稀釋,進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)選定稀釋倍數(shù)。抑菌樣品:以去離子水為溶劑,配置濃度為2.0 mg/mL的樣品(殼寡糖、2,4-二氯苯氧乙酸及2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯)溶液。抑菌性測(cè)定:以滅菌后的去離子水為空白,測(cè)定殼寡糖、2,4-二氯苯氧乙酸及2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的抗菌性。吸取1.0 mL的抑菌樣品及100 μL菌液至平板中,倒入40 ℃左右的瓊脂培養(yǎng)基,混合均勻,冷卻至凝固后,于隔水式培養(yǎng)箱中,37 ℃倒置培養(yǎng)24~48 h,觀察平板中細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 傅里葉紅外光譜分析

    如圖2所示,殼寡糖的紅外光譜中,3 400 cm-1附近的寬峰屬于氨基及羥基;1 618,1 515,1 379 cm-1分別為殼寡糖的酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ吸收峰;1 069 cm-1為殼寡糖糖環(huán)骨架氧橋的伸縮振動(dòng)[22-23]。2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的紅外光譜中,出現(xiàn)了1 752,1 287,869,803 cm-1等新峰,其中1 752,1 287 cm-1為酯鍵的C═O吸收峰及C—O吸收峰;869,803 cm-1為苯環(huán)在1,2,4位有取代時(shí)的吸收峰;從紅外可以初步判斷目標(biāo)產(chǎn)物的合成。

    圖2 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯及殼寡糖的紅外光譜圖

    2.2 紫外可見吸收光譜分析

    如圖3所示,紫外光譜主要用于提供分子的芳香結(jié)構(gòu)和共軛體系信息。殼寡糖本身并沒有生色團(tuán),但殘留乙酰氨基中的C═O會(huì)顯示出吸收峰[24]。在殼寡糖的紫外光譜中,于190,280 nm左右有吸收峰。其中,190 nm 左右的吸收峰為殼寡糖氨基上的電子n→δ*躍遷的紫外吸收峰,而280 nm左右的吸收峰為C═O的R帶吸收峰[25]18-19。在終產(chǎn)物Dcpo-O-COS的紫外吸收中,229 nm處屬于芳香族化合物的B吸收帶的吸收峰,200,283 nm處的吸收峰可歸屬為羰基結(jié)構(gòu)的π→π*和n→δ*躍遷,此結(jié)果與紅外結(jié)果一致,說明2,4-二氯苯氧乙酸成功接入殼寡糖。

    圖3 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯及殼寡糖的紫外—可見吸收光譜

    2.3 1H核磁共振圖譜分析

    由圖4可知δ=2.07處的吸收峰屬于殼寡糖中未脫盡的乙?;稀狢H3的化學(xué)位移;δ=3.11處的吸收峰屬于氨基葡萄糖殘基上H的化學(xué)位移[26];δ=3.37~4.05為殼寡糖的特征組峰,屬于殼寡糖糖環(huán)上的氨基葡萄糖H和N-乙酰氨基葡萄糖殘基上H的化學(xué)位移[27];δ=4.70 處的吸收峰為溶劑峰。在2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的1H核磁圖譜中,δ=2.49處的吸收峰屬于溶劑峰;δ=4.95處的吸收峰屬于與羰基相連的—CH2上氫的吸收峰;δ=6.88~7.62 處屬于苯環(huán)上未被取代H的化學(xué)位移;核磁結(jié)果與紅外結(jié)果一致,表明2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的成功合成。

    圖4 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯及殼寡糖的1H核磁共振圖譜

    2.4 X射線衍射圖譜分析

    由圖5可知,殼寡糖有2個(gè)主要的衍射吸收峰,在2θ=13°和2θ=22°處,分別歸屬于殼寡糖分子的Ⅰ型和Ⅱ型晶型的特征吸收峰,X-射線衍射強(qiáng)度不大,說明結(jié)晶性能不強(qiáng)[25]21-22。經(jīng)改性后的2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯出峰位置稍向左偏移,且峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng),說明將2,4-二氯苯氧乙酸引入殼寡糖之后,改變了殼寡糖內(nèi)部的結(jié)構(gòu),使其結(jié)構(gòu)更加規(guī)整有序,結(jié)晶性能變強(qiáng)[28]。

    圖5 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯及殼寡糖的X-射線衍射圖

    2.5 熱穩(wěn)定性

    圖6(a)為熱失重率曲線圖(TG),圖6(b)為熱失重率曲線圖的一階導(dǎo)數(shù)曲線圖(DTG)。由圖6可知,殼寡糖在30~450 ℃時(shí)存在2個(gè)失重階段。一階失重發(fā)生于70~150 ℃,失重率為7.5%,這一階段的失重主要是由于分子中自由水和結(jié)晶水的蒸發(fā)導(dǎo)致;二階失重發(fā)生于170~350 ℃,失重率為53.5%,最快降解速率的溫度Tmax=224 ℃,這一階段的熱失重相對(duì)比較復(fù)雜,包含糖環(huán)類的脫水、解聚和烷基化單元的聚合物的分解等[25]22-23。

    圖6 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯及殼寡糖的熱重分析圖

    改性后的2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯在30~450 ℃時(shí)也存在2個(gè)失重階段。其中一階失重在60~132 ℃,失重率為4.4%;二階失重在134~408 ℃,失重率為62.1%,最快降解速率的溫度Tmax=279 ℃。由此可見,2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的熱穩(wěn)定性較殼寡糖有所提高,可能是引入2,4-二氯苯氧乙酸乙酸后,使衍生物較殼寡糖的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象更為規(guī)整有序,從而使得2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的熱穩(wěn)定性提高。此結(jié)果與上述X射線衍射分析結(jié)果一致。

    2.6 抑菌性

    由表1可知,殼寡糖、2,4-二氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出抗菌性,其中2,4-二氯苯氧乙酸>2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯>殼寡糖。2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性較殼寡糖均有所提高,可能是保留了殼寡糖具有抗菌作用的氨基,同時(shí)引入具有強(qiáng)抗菌作用的2,4-二氯苯氧乙酸。通過計(jì)算平均菌落總數(shù)可以得出,相對(duì)于殼寡糖,2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯對(duì)大腸桿菌的抗菌性提高了54.72%,對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌性提高了60.98%。

    表1 樣品對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用

    3 結(jié)論

    本試驗(yàn)提供了一種潛在的新型食品抗菌劑——2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的合成路線,經(jīng)過紅外、紫外以及1H NMR對(duì)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定,證明2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯合成成功,其結(jié)晶性、熱穩(wěn)定性及抗菌性較殼寡糖均有所提高,與對(duì)大腸桿菌抗菌作用相比,對(duì)金黃色葡萄球的抗菌作用提高得更為顯著,2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯有望成為一種新型抗菌劑應(yīng)用于食品行業(yè)中。

    本研究中主要就新型物質(zhì)的合成和表征進(jìn)行了研究,但2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯針對(duì)細(xì)菌的抑制機(jī)理還未知,新型物質(zhì)是否能夠應(yīng)用于食品中還需要進(jìn)行相關(guān)的毒理性試驗(yàn)研究。

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