大丁草2種提取物對(duì)二甲苯所致耳腫脹炎癥模型小鼠的抗炎作用※

高長久 張朝立* 李 潔 李文超 吳兆華

（1 牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2 牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院血液科，黑龍江 牡丹江 157011）

大丁草（Herb of Common Leibnitzia），又名燒金草、豹子藥、苦馬菜、米湯菜、雞毛蒿、白小米菜、踏地香、龍根草、翻白葉、小火草、臁草等，始載于《本草綱目》，為菊科大丁草屬多年生草本植物大丁草Leibnitzia anandria（L.）Nakai［Gerbera anandria（L.）Sch Bip.］的全草，其味苦，性寒，具有清熱解毒，消腫止痛等功效，主治濕熱瀉痢、熱淋、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、癰癤腫毒、臁瘡、蟲蛇咬傷、燒燙傷、外傷出血等病證［1］。本項(xiàng)目分別采用水和乙醇（75%）2種溶劑對(duì)大丁草藥材進(jìn)行提取，通過二甲苯耳腫脹法、腹腔通透性法對(duì)其水提物與醇取物的抗炎作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析確定大丁草的抗炎有效部位，為其臨床合理用藥提供理論依據(jù)，為拓展其臨床應(yīng)用范圍奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康昆明種（SPF）級(jí)小鼠，體質(zhì)量為18～22 g，雌雄兼用。由牡丹江醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)前在本實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，室溫19～25℃，相對(duì)濕度45%～68%。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑 大丁草采自黑龍江牡丹峰國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥資源與開發(fā)教研室王振月教授鑒定為菊科植物大丁草Leibnitzia anandria（L.）Nakai［Tussi-lago anandria L.；Gerbera anandria（L.）Sch.-Bip］；吲哚美辛腸溶片，批號(hào)171025，山西云鵬制藥有限公司提供；二甲苯，批號(hào)：171108，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供；伊文思藍(lán)，批號(hào)171019，上海懋康生物科技有限公司提供；75%乙醇，批號(hào)20170925，上海時(shí)代生物科技有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器 分析天平，型號(hào)AUX220，島津企業(yè)管理（中國）有限公司提供；電子天平，型號(hào)YP-6002，上海精密儀器儀表有限公司提供；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，型號(hào)RE-2010，上海濮安生物科技有限公司；離心機(jī)，型號(hào)TDL-5A，江蘇省金壇市宏華儀器廠提供；紫外-可見分光光度計(jì)，型號(hào)Cintra1010，北京東西分析儀器有限公司提供；電熱套（加熱套），型號(hào)EM2000/CE，北京諾植科技有限公司提供；循環(huán)水真空泵，型號(hào)SHB-111A，西安莫吉娜儀器制造有限公司提供。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 大丁草2種提取物的制備

1.4.1.1 大丁草水提物的制備 將大丁草藥材剪成5～8 mm放入燒杯中，加入純凈水浸泡60 min后，先大火煮沸，小火持續(xù)沸騰25 min后，用紗布過濾后得濾液，其濾渣再加5倍水量煎煮2次后棄去，將3次煎煮所得濾液混合，放入離心機(jī)中離心，所得上清液濃縮，即為水提物，調(diào)節(jié)pH值（7.2），滅菌后放入冰箱（3～5℃） 保存?zhèn)溆?。?jīng)檢測(cè)主要成分為香豆素類和黃酮類等，其中大丁苷、大丁纖維二糖苷、大丁龍膽二糖苷的含量分別為0.235%、0.089%和0.011 2%。

1.4.1.2 大丁草醇提物的制備 將大丁草藥材粉碎過篩，其粉末加乙醇（75%）浸泡60 min后，設(shè)置加熱套70℃下回流提取3次，靜置，用真空泵抽濾，合并3次濾液，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸回收乙醇后，即為醇提物，調(diào)節(jié)pH值（7.2），滅菌后冰箱（3～5℃）保存?zhèn)溆?。?jīng)檢測(cè)主要成分為香豆素類和黃酮類等，其中大丁苷、大丁纖維二糖苷、大丁龍膽二糖苷的含量分別為0.226%、0.074%和0.009 3%。

1.4.2 劑量設(shè)計(jì) 大丁草給藥劑量參考《中華本草》成人每日用量，按動(dòng)物與人體的每千克體質(zhì)量等效劑量折算系數(shù)換算成小鼠的劑量，水和醇2種提取物的給藥劑量按提取量相當(dāng)于生藥量的比例進(jìn)行換算。通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定大丁草水和醇2種提取物抗炎實(shí)驗(yàn)的最低有效劑量均為3.2 g/kg，并設(shè)定大丁草水和醇2種提取物高劑量組給藥劑量均為6.4 g/kg。

1.4.3 小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn) 取72只雌雄各半小鼠，隨機(jī)分成6組：大丁草水提物高、低劑量組，大丁草醇提物高、低劑量組，生理鹽水組（20 mL/kg），吲哚美辛組（9.4 mg/kg），每組12只小鼠。大丁草水提物和醇提物高、低劑量組的給藥劑量分別為6.4，3.2 g/kg（生藥/體質(zhì)量）。每天按照0.2 mL/10 g，灌胃給藥，1次/d，連續(xù)7 d。于末次給藥1 h后，將0.05 mL二甲苯均勻涂抹于各組小鼠右耳的兩面致炎，小鼠的左耳不涂作為對(duì)照，30 min后脫頸椎處死，沿著小鼠耳廓剪下小鼠的兩耳，用直徑6 mm的打孔器在左右耳相同位置沖下圓形耳片，分別稱重，以兩耳片的質(zhì)量差作為耳腫脹度，計(jì)算腫脹抑制率［2-5］。腫脹度=右耳重（腫脹耳）-左耳重（對(duì)照耳）。腫脹抑制率（%）=（對(duì)照組平均腫脹度-給藥組平均腫脹度）/對(duì)照組平均腫脹度×100%。

1.4.4 小鼠腹腔通透性實(shí)驗(yàn) 分組及給藥方法同“1.4.3”項(xiàng)，于末次給藥后1 h，經(jīng)小鼠尾靜脈注射0.25%伊文思藍(lán)（10 mL/kg），腹腔注射 0.6% 醋酸 （10 mL/kg），15 min后將小鼠處死，腹腔注入0.9%氯化鈉溶液（生理鹽水）6 mL沖洗，腹腔洗出液2000 r/min離心10 min（r=8 cm），取上清液用紫外-可見分光光度計(jì)于590 nm波長處測(cè)定吸光度（A） 值［6-10］。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠一般特征的影響 各實(shí)驗(yàn)組小鼠生活狀態(tài)與實(shí)驗(yàn)前均無明顯差別，無精神萎靡或死亡，飲食量與飲水量基本穩(wěn)定，各組體質(zhì)量增長速度無明顯差異。

2.2 對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 與生理鹽水組比較，大丁草水和醇提物高、低劑量組（生藥6.4、3.2 g/kg）及吲哚美辛組（9.4×10-3g/kg） 小鼠耳廓腫脹度均被抑制，有隨著藥物濃度的增高而腫脹度降低的趨勢(shì)，其中大丁草水和醇高劑量組、吲哚美辛組差異有極顯著意義（P＜0.01），低劑量組差異有顯著意義（P＜0.05）。提示大丁草水和醇提物對(duì)二甲苯致小鼠耳廓腫脹有抑制作用，水提物的抑制效果略強(qiáng)于醇提物。見表1。

表1 大丁草2種提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 （）

表1 大丁草2種提取物對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響 （）

注：與生理鹽水組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

組別 鼠數(shù)生理鹽水組吲哚美辛組水提物高劑量組水提物低劑量組醇提物高劑量組醇提物低劑量組13.7±1.5 7.1±1.4**9.2±1.2**10.9±1.0*9.5±1.3**11.0±1.7*12 12 12 12 12 12劑量（g/kg） 腫脹度（mg）20.0 9.4×10-3 6.4 3.2 6.4 3.2抑制率（%）-55.5 32.8 20.4 30.7 19.7

2.3 對(duì)小鼠腹腔通透性的影響 與生理鹽水組比較，大丁草水和醇提物高、低劑量組（生藥6.4、3.2 g/kg）及吲哚美辛組（9.4×10-3g/kg）腹腔沖洗液A值明顯減小，有隨著藥物濃度的增高而使腹腔通透性降低的趨勢(shì)，其中高劑量組差異有顯著意義（P＜0.05），低劑量組差異無顯著意義（P＞0.05）。提示大丁草水和醇提物對(duì)0.6% 醋酸致小鼠腹腔通透性增加有抑制作用，水提物與醇提物的抑制效果無差異。見表2。

表2 大丁草2種提取物對(duì)小鼠腹腔通透性的影響 （）

表2 大丁草2種提取物對(duì)小鼠腹腔通透性的影響 （）

注：與生理鹽水組比較，**P＜0.01，*P＜0.05

0.15±0.04 0.08±0.02**0.10±0.03*0.13±0.07 0.10±0.02*0.13±0.03組別 鼠數(shù)生理鹽水組吲哚美辛組水提物高劑量組水提物低劑量組醇提物高劑量組醇提物低劑量組12 12 12 12 12 12劑量（g/kg） A值20.0 9.4×10-3 6.4 3.2 6.4 3.2

3 討論

中草藥大丁草原植物在我國南北各地均有分布，生于山坡路旁、林邊、草地、溝邊等陰濕處，蘊(yùn)藏量巨大，為大丁草在中醫(yī)藥領(lǐng)域的研發(fā)與應(yīng)用提供了深厚的資源基礎(chǔ)。大丁草具有清熱解毒、消腫止痛等功效，推測(cè)其具有抗炎方面的相關(guān)藥理作用，并尚未發(fā)現(xiàn)相關(guān)報(bào)道，且毒性較低［11-12］，有著較好的藥用開發(fā)與利用價(jià)值。故本項(xiàng)目采用水和75%乙醇2種溶劑分別對(duì)大丁草進(jìn)行提取，所得水提物和醇提物通過二甲苯致小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)、小鼠腹腔通透性實(shí)驗(yàn)對(duì)其抗炎效果進(jìn)行評(píng)價(jià)。

小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示大丁草水和醇2種提取物高、低劑量組（生藥6.4、3.2 g/kg）均可抑制由二甲苯致炎劑引起的某些炎癥介質(zhì)（如組胺、激肽、纖維蛋白溶解酶等）的釋放，降低局部毛細(xì)血管擴(kuò)張和通透性增加及炎癥細(xì)胞浸潤，從而減輕耳部急性滲出性炎性水腫；小鼠腹腔滲透實(shí)驗(yàn)提示大丁草2種提取物高、低劑量均可降低因腹腔注射冰醋酸溶液中H+作用下引起的腹腔毛細(xì)血管通透性增高，減少血液液體成分（如伊文思藍(lán)與血漿蛋白結(jié)合物等）從血管內(nèi)向腹腔滲出，從而對(duì)急性炎癥產(chǎn)生抑制作用。

本項(xiàng)目從藥效學(xué)角度研究表明，大丁草水和醇2種提物高、低劑量組（生藥6.4、3.2 g/kg）在抗炎作用方面均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05），且存在著一定的量效關(guān)系，為大丁草民間治療濕熱瀉痢、熱淋、風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛、癰癤腫毒等病證提供了藥效學(xué)理論基礎(chǔ)。同劑量水提物的效果優(yōu)于醇提物，推測(cè)其與發(fā)揮抗炎作用的有效成分水溶性較好有關(guān)，這與民間應(yīng)用大丁草水煎液治療病證的方法一致。同時(shí)，本課題組對(duì)大丁草中發(fā)揮抗炎作用具體有效成分及其作用機(jī)制正在進(jìn)一步研究中。