CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性對華法林劑量的影響研究

梁紅梅 鄔銀偉 王艷群

【摘要】 目的 探究細胞色素氧化酶2C9（CYP2C9）基因和維生素K環(huán)氧化物還原酶復合物1基因（VKORC1）-1639 G/A多態(tài)性對華法林初始抗凝劑量的影響。方法 200例使用華法林患者， 觀察患者使用華法林5～7 d后凝血酶原時間（PT）和國際標準化比值（INR）， 記錄患者服用華法林初次達標天數、總用量和平均每日用量， 同時測定患者CYP2C9位點基因型（*1、*2、*3）和VKORC1-1639位點基因型（AA、AG、GG）。結果 CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次達標天數分別為（14.47±1.52）、（9.77±0.91）d， 總用量分別為（115.13±11.47）、（56.31±5.49）mg， 平均每日用量分別為（5.22±0.53）、（4.36±0.44）mg， CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者初次達標天數分別為（9.24±0.94）、（5.37±0.52）d， 總用量分別為（52.37±5.14）、（15.56±1.42）mg， 平均每日用量分別為（3.02±0.35）、（3.21±0.36）mg;CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次達標天數均長于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 總用量及平均每日用量均大于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。結論 對于服用華法林的患者， 對CYP2C9、VKORC1-1639基因多態(tài)性的測定具有重要指導價值， 能幫助臨床實施個體化用藥， 值得臨床應用與推廣。

【關鍵詞】 華法林;細胞色素氧化酶2C9基因;維生素K環(huán)氧化物還原酶復合物1基因;基因多態(tài)性

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2019.19.110

【Abstract】 Objective? ?To investigate the effect of cytochrome oxidase 2C9 （CYP2C9） gene and vitamin K epoxide reductase complex 1 （VKORC1） - 1639 G/A polymorphism on the initial anticoagulant dose of warfarin. Methods? ?There were 200 patients treated with warfarin. Their prothrombin time （PT） and international normalized ratio （INR） were observed after 5～7 d of warfarin， and first standard-reaching day of warfarin administration， total dosage and daily dosage of warfarin were recorded. The genotypes of CYP2C9 （* 1， * 2， * 3） and VKORC1-1639 （AA， AG， GG） were also determined at the same time. Results? ?Patients with CYP2C9*1 and CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG genotypes had first standard-reaching day respectively as （14.47±1.52）， （9.77±0.91）d， total dosage respectively as （115.13±11.47）， （56.31±5.49）mg， and mean daily dosage respectively as （5.22±0.53）， （4.36±0.44）mg. Patients with CYP2C9*1 and CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA genotypes had first standard-reaching day respectively as （9.24±0.94）、（5.37±0.52）d，? total dosage respectively as （52.37±5.14）， （15.56±1.42）mg， and mean daily dosage respectively as （3.02±0.35）， （3.21±0.36）mg. Patients with CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG genotypes had longer first standard-reaching day than patients with CYP2C9*1 and CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA genotypes， and more total dosage and mean daily dosage than patients with CYP2C9*1 and CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA genotypes. Their difference was statistically significant （P<0.05）. . Conclusion? ?For the patients taking warfarin， it has important guiding value for the determination of CYP2C9 and VKORC1-1639 gene polymorphism， and can help to implement individualized drug use in clinic. It is worthy of clinical application and promotion.

【Key words】 Warfarin; Cytochrome oxidase 2C9 gene; Vitamin K epoxide reductase complex 1 gene; Gene polymorphisms

華法林作為一種香豆素衍生物， 在血栓性疾病的抗凝治療中發(fā)揮著重要作用， 是目前臨床上應用最廣泛的口服抗凝藥物。其主要用于肺栓塞、深靜脈血栓等栓塞性疾病治療以及人工心臟瓣膜置換術后、心房顫動等疾病的血栓栓塞的預防[1]。但華法林治療窗窄， 達到相同的抗凝效果時， 不同個體所需華法林劑量相差可達20倍以上， 用藥時發(fā)生出血或栓塞的風險較高， 其不良反應是困擾臨床醫(yī)生和患者的普遍問題[2， 3]。研究表明[4]， 患者華法林用藥劑量受遺傳和非遺傳等多個因素的影響， 其中遺傳因素是造成其劑量個體差異的主要原因之一， 在亞洲人群的遺傳因素的影響中， CYP2C9和VKORC1-1639位點基因型是影響華法林需求劑量個體差異的主要因素， 這兩個位點在國內的檢測更具備臨床意義。本研究測定患者CYP2C9、VKORC1-1639位點基因型， 并觀察其多態(tài)性對華法林初始抗凝劑量的影響， 現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2017年2月～2018年2月收治的華法林使用患者200例， 納入標準：①資料完善者;②依從性較好者;③患者疾病為心房顫動、肺栓塞及下肢深靜脈血栓。排除標準：①嚴重肝腎功能異常者;②不愿加入本次研究且不予合作者;③中途退出者;④既往有顱內出血、惡性腫瘤者。其中男127例， 女73例;年齡28～79歲， 平均年齡（51.27±5.14）歲;平均身高（170.17±6.54）cm;平均體重（67.27±6.51）kg。本研究已經過本院倫理委員會批準進行。

1. 2 方法

1. 2. 1 藥品與設備 華法林鈉片（齊魯制藥有限公司， 國藥準字H37021314）， DNA提取試劑盒由Promega（北京）生物技術有限公司提供， 聚合酶鏈式反應（PCR）試劑由大連寶生物技術有限公司提供， DNA測序儀為QIAGEN PymMark Q24焦磷酸測序儀， PCR反應在EPFmdmf5331型熱循環(huán)儀上進行。

1. 2. 2 血樣采集與DNA提取 采集研究對象5 ml外周血， 采用全血基因組提取試劑盒的抽提， 操作按試劑盒說明書進行。提取DNA需要用紫外分光光度計測定濃度， 樣品無蛋白或RNA污染， OD260/OD280=1.8～2.0， OD260/OD230≥2.0;DNA含量要求：提取的標本必須≥50 ng/μl;提取完的DNA應立即進行檢測， 否則請于（-20±5）℃保存。PCR反應體系（20 μl）：無菌去離子H2O 15.6 μl， 10×buffer 2.0 μl， 4×dNTPs（10 mmol/L）0.4 μl， 非限制引物2F（10 μmol/L）0.5 μl， 限制引物2R（10 μmol/L）0.1 μl， Taq酶1 U;DNA模板：0.5 μl;分子信標2beaconC（T）（10 μmol/L）：0.5 μl。PCR反應采用兩步法45個循環(huán)擴增， 預變性95℃ 3 min， CYP2C9*2和CYP2C9*3：95℃ 5 s， 62℃ 15 s;CYP4F2 V433M、VKORC1 1173C/T和EPHX1：95℃ 5 s， 60℃ 15 s， 最后進行72℃ 2 min延伸。

1. 3 觀察指標 比較研究對象服用華法林初次達標天數、總用量用量和平均每日用量。

1. 4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次達標天數分別為（14.47±1.52）、（9.77±0.91）d，?總用量分別為（115.13±11.47）、（56.31±5.49）mg， 平均每日用量分別為（5.22±0.53）、（4.36±0.44）mg， CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者初次達標天數分別為（9.24±0.94）、（5.37±0.52）d， 總用量分別為（52.37±5.14）、（15.56±1.42）mg， 平均每日用量分別為（3.02±0.35）、（3.21±0.36）mg;CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次達標天數均長于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 總用量及平均每日用量均大于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

3 討論

華法林為臨床最常用的防治血栓栓塞的香豆素類口服抗凝藥， 于20世紀40年代由美國威斯康星大學合成， 因其價格低廉、服用方便、藥效作用持續(xù)時間長， 且兼有抗凝和溶栓的雙重作用， 長期作為心臟人工瓣膜置換術后、非瓣膜性心房纖顫或心房撲動、肺栓塞以及深靜脈血栓抗凝治療等一線預防與治療藥物[5， 6]。

臨床上常以PT及INR作為華法林抗凝效果的監(jiān)測指標。傳統(tǒng)給藥方案需醫(yī)生根據多次監(jiān)測INR值的情況增減華法林劑量直至INR達標， 這種方式導致抗凝療法調整周期長， 期間出血及梗死風險高[7， 8]。近年來的研究顯示[9]， 華法林維持劑量個體差異與基因變異相關。本研究結果顯示， CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次達標天數分別為（14.47±1.52）、（9.77±0.91）d，?總用量分別為（115.13±11.47）、（56.31±5.49）mg， 平均每日用量分別為（5.22±0.53）、（4.36±0.44）mg， CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者初次達標天數分別為（9.24±0.94）、（5.37±0.52）d， 總用量分別為（52.37±5.14）、（15.56±1.42）mg， 平均每日用量分別為（3.02±0.35）、（3.21±0.36）mg;CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AG/GG基因型患者初次達標天數均長于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 總用量及平均每日用量均大于CYP2C9*1、CYP2C9*2/*3 VKORC1-1639 AA基因型患者， 差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

華法林為混旋體， 全部由肝臟代謝， S-華法林的抗凝活性是R-華法林的3～5倍[10]。華法林的個體化用藥一直是人們關注的焦點。CYP2C9、VKORC1-1639直接影響患者對華法林的敏感性， 導致患者對華法林療效、出血風險產生差異[11]。CYP2C9 *2或*3基因突變可以使得華法林的代謝降低， 其在患者體內蓄積后抗凝作用顯著增強， 可能導致出血等嚴重不良反應。VKORC1是華法林抗凝作用的靶點， 是維生素K依賴性凝血因子生成過程中的限速酶， 其阻礙維生素K由環(huán)氧化物形式轉化成氫醌形式， 從而阻斷凝血因子的活化， 產生抗凝作用。VKORC1基因突變患者對華法林敏感性增加， 可能導致華法林抗凝作用增強， 并出現出血等嚴重不良反應。

綜上所述， CYP2C9、VKORC1-1639基因多態(tài)性是影響華法林劑量個體和種族差異的重要影響因素， 因此臨床對于需要服用華法林的患者應將INR與CYP2C9、VKORC1基因多態(tài)性的檢測相結合， 估測華法林的維持劑量、確保用藥安全。

參考文獻

[1] 陳曉英， 彭齊， 胡大清， 等. CYP2C9及VKORC1基因多態(tài)性對華法林穩(wěn)態(tài)劑量和模型預測劑量的相關性研究. 華中科技大學學報（醫(yī)學版）， 2015， 44（1）：92-95.

[2] 寇惠娟， 鄧捷， 朱參戰(zhàn)， 等. CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性對華法林穩(wěn)態(tài)治療劑量及個體化抗凝療效的影響. 山西醫(yī)科大學學報， 2017， 48（11）：20-25.

[3] 趙曉麗， 史瓊華， 黃宏偉， 等. 云南地區(qū)漢族人群CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性研究. 重慶醫(yī)學， 2018， 47（8）：1052-1054.

[4] 安琳娜， 曹紅， 林筱琦. 新疆維吾爾族患者CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性分布及不同種族間的比較. 中國藥房， 2015， 36（24）：3332-3334.

[5] 肖成， 胡瑩， 王玉明， 等. 昆明漢族人群VKORC1、CYP2C9基因多態(tài)性對華法林穩(wěn)態(tài)劑量的影響及預測劑量模型的建立. 山東醫(yī)藥， 2018， 58（10）：21-24.

[6] Zhuang W， Wen W， Xuan B， et al. Effect of CYP2C9， CYP4F2 and VKORC1 genetic polymorphisms on pharmacokinetics and pharmacodynamics of mean daily maintenance dose of warfarin in Chinese patients. Blood Coagulation & Fibrinolysis， 2015， 26（2）：167-174.

[7] 趙紅麗， 李潞， 張曉丹， 等. 非瓣膜病心房顫動患者VKORC1及CYP2C9基因多態(tài)性與華法林臨床應用的關系. 實用醫(yī)學雜志， 2016， 32（11）：1777-1779.

[8] Villegas-Torres B， Sánchez-Girón F， Jaramillo-Villafuerte K， et al. Genotype frequencies of VKORC1 and CYP2C9 in native and Mestizo populations from Mexico， potential impact for coumarin dosing. Gene， 2015， 558（2）：235-240.

[9] 柴樹紅， 陳麗， 谷苞， 等. 熒光PCR-熔解曲線法檢測新疆回族人群CYP2C9和VKORC1基因多態(tài)性研究. 國際檢驗醫(yī)學雜志， 2016， 37（17）：2371-2373.

[10] Lin G， Yi L， Zhang K， et al. Improvements in CYP2C9 Genotyping Accuracy Are Needed：A Report of the First Proficiency Testing for Warfarin-related CYP2C9 and VKORC1 Genotyping in China. Journal of Cardiovascular Pharmacology， 2015， 66（2）：129-134.

[11] 張曉丹， 趙紅麗， 李潞， 等. 非瓣膜病房顫患者VKORC1與CYP2C9基因多態(tài)性華法林抗凝劑量模型臨床療效評價. 中國心血管病研究， 2016， 14（7）：639-642.

[收稿日期：2019-02-21]