Sprouty調(diào)控轉(zhuǎn)化生長因子-β信號通路介導(dǎo)的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化抑制后囊膜混濁的研究進(jìn)展△

張利民 包秀麗

后囊膜混濁(posterior capsular opacification，PCO) 是白內(nèi)障手術(shù)的主要遠(yuǎn)期并發(fā)癥，是由于手術(shù)切除纖維塊后殘留在囊袋中的晶狀體上皮細(xì)胞(lens epithelial cell，LEC)的異常生長引起的。在成人術(shù)后2～5 a的發(fā)生率為20%～40%，兒童幾乎為100%。大量研究表明，LEC的上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial mesenchymal transition,EMT)及增殖過程是PCO發(fā)展的主要病理改變，轉(zhuǎn)化生長因子β(transform growth factor-β，TGF-β)信號通路參與了LEC的EMT過程。TGF-β信號通路包括經(jīng)典的Smad信號通路及非Smad信號通路。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路為主要的非Smad信號通路。Sprouty是RTK介導(dǎo)的Ras/ERK/MAPK 信號通路特異的抑制蛋白，并作為TGF-β誘導(dǎo)的EMT的負(fù)性調(diào)節(jié)因子抑制ERK信號通路，從而抑制EMT過程。對PCO的關(guān)鍵細(xì)胞過程和分子機(jī)制有更多的了解有助于降低PCO的發(fā)病率，研究Sprouty可能為將來預(yù)防EMT和白內(nèi)障的發(fā)生提供有用治療靶點(diǎn)。本文將對在PCO中，LEC的EMT過程以及Sprouty通過抑制TGF相關(guān)信號通路阻斷PCO過程進(jìn)行綜述。

1 PCO

白內(nèi)障是導(dǎo)致失明的主要原因，根據(jù)2010年評估得出白內(nèi)障導(dǎo)致失明人數(shù)占盲人總?cè)藬?shù)的51%，約2000萬人，占世界范圍內(nèi)視覺損傷人數(shù)的33%[1]。白內(nèi)障手術(shù)與人工晶狀體植入術(shù)能引起炎癥反應(yīng)應(yīng)答導(dǎo)致組織損傷，并最終形成PCO。PCO導(dǎo)致視覺軸心上的光散射產(chǎn)生視力障礙以及各種視覺功能的異常，包括對比敏感度下降、眩光、色覺與立體視的改變。PCO的發(fā)生率及嚴(yán)重程度與手術(shù)的方式及人工晶狀體光學(xué)邊緣設(shè)計和材質(zhì)相關(guān)，以及由術(shù)后殘留的人LEC發(fā)生增殖、遷移及EMT[2-3]。釔鋁石榴石(Nd:YAG)激光后囊切開術(shù)是目前治療PCO的主要有效方法[4]，其目的是清除纖維化組織并使視軸清晰，但是也可能導(dǎo)致一些并發(fā)癥，如人工晶狀體損壞、眼壓升高、黃斑囊樣水腫或視網(wǎng)膜脫離[4-5]。

2 EMT

2.1 EMT的概念EMT及其逆過程間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化(mesenchymal epithelial transition,MET)證明是癌癥發(fā)展的不可分割的一部分[6]，在生長發(fā)育、纖維化過程、腫瘤轉(zhuǎn)移和傷口愈合過程均有重要作用。EMT是上皮細(xì)胞失去它的分化表型轉(zhuǎn)變成間質(zhì)細(xì)胞表型的過程。EMT最初在胚胎發(fā)育過程中被確定是一個至關(guān)重要的分化和形態(tài)形成的過程，并且該病理過程是腫瘤早期擴(kuò)散的重要機(jī)制[7]。EMT是一種獨(dú)特的過程，上皮細(xì)胞經(jīng)歷顯著的形態(tài)學(xué)改變，其特征是從上皮“鵝卵石樣”表型向細(xì)長成纖維細(xì)胞表型(間充質(zhì)表型)的轉(zhuǎn)變，最終導(dǎo)致運(yùn)動和侵襲性增加。在獲得EMT特征時，細(xì)胞失去上皮細(xì)胞-細(xì)胞連接、肌動蛋白細(xì)胞骨架重組和促進(jìn)細(xì)胞間連接的蛋白表達(dá)，如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的下調(diào)和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)重新定位，并在間充質(zhì)標(biāo)記物如波形蛋白、纖維連接蛋白的表達(dá)中獲得。α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)、纖維膠原Ⅰ型和Ⅲ型(fibrillar collagen Ⅰ/Ⅲ)、成纖維細(xì)胞特異性蛋白-1 (fibroblast specific protein-1，F(xiàn)SP-1)、N- cadherin以及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)活性增加，如MMP-2、MMP-3和MMP-9[8-9]。

2.2 EMT與LEC的關(guān)系大量的研究表明，LEC的EMT及增殖是PCO發(fā)展的主要病理改變。PCO是由赤道部及晶狀體前囊殘留的LEC發(fā)生傷口愈合反應(yīng)導(dǎo)致了PCO的病理改變。LEC來源于表面外胚層，但它們也表達(dá)波形蛋白和上皮表面標(biāo)記物(N-cadherin)，LEC增殖及經(jīng)過EMT 導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的形成及大量細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)蛋白的表達(dá)，例如纖維膠原Ⅰ/Ⅳ、纖維連接蛋白以及α- SMA[10]。雖然在整個手術(shù)中整個晶狀體的內(nèi)容物被去除，但最后LEC經(jīng)過細(xì)胞骨架的重排和上皮表型的丟失并遷移至后囊膜處最終導(dǎo)致PCO的形成[4]。有實(shí)驗研究證實(shí)Wnt3a能夠活化Wnt/β-catenin信號通路促進(jìn)LEC發(fā)生EMT、遷移及增殖作用[11]，以及Wnt/β-catenin信號通路抑制劑Dickkopf-1抑制 Wnt3a介導(dǎo)的LEC的EMT及增殖過程[12]。

3 TGF-β信號通路

3.1 TGF-β家族TGF-β超家族超過了30種配體，包括TGF-β、活化素、骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)、結(jié)蛋白、生長分化因子(growth differentiation factor,GDF)及Müller抑制物(Müllerrian inhibitory substance,MIS)[13]。大量研究對TGF-β的分泌及活化進(jìn)行了研究，TGF-β作為一種生物活性的二聚體復(fù)合物來進(jìn)行合成和分泌。TGF-β受體家族包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型受體，屬單個跨膜α螺旋受體。在體內(nèi)TGF-β的激活對調(diào)節(jié)多種生物機(jī)制極其重要[14]。TGF-β在皮膚瘢痕、肝和肺等纖維化性疾病的發(fā)病機(jī)制中是一個重要的配體，TGF-β能夠上調(diào)參與組織纖維化過程的致纖維化細(xì)胞因子和分子，同時也能夠調(diào)節(jié)炎癥及免疫過程，纖維化病變過程的特點(diǎn)是肌成纖維細(xì)胞大量表達(dá)，并且TGF-β介導(dǎo)的ECM過量積累使組織收縮及功能受損[15]。晶狀體中能夠表達(dá)TGF-β1和TGF-β2，也表達(dá)TGF-β超家族的多種受體成員，然而TGF-β對LEC及晶狀體纖維細(xì)胞的影響完全不同，TGF-β可能促進(jìn)正常的晶狀體纖維細(xì)胞分化，大量的體內(nèi)及體外實(shí)驗表明，TGF-β在LEC激活了異常的分化通路導(dǎo)致白內(nèi)障的形成[14]。

3.2 TGF-β信號通路TGF-β 信號通路主要有經(jīng)典的 Smad 信號通路及非 Smad 信號通路。Smad 信號通路是TGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的中心，TGF-β也能夠通過激活相關(guān)受體活化非 Smad 信號通路，TGF-β-Smad 信號通路與非 Smad 信號通路間存在著“cross-talking”，可產(chǎn)生TGF-β的多種生物學(xué)反應(yīng)，如細(xì)胞增殖、分化、生長停滯、凋亡和EMT等[16-17]。典型的TGF信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)需要Smad2和Smad3的磷酸化，然后Smad2和Smad3轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中，并啟動靶基因的表達(dá)，如α-SMA、纖維連接蛋白、波形蛋白、纖維膠原Ⅰ/Ⅳ[18]。

非Smad信號通路如MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路各個分支、 磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸蘇氨酸激酶信號通路(the phosphatidylinositol-3-kinase/Akt pathway，PI3K-AKT)、Rho 樣GTP酶信號通路[19-20]。MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinase，ERK)、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)和 p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase，p38 MAPK)。這些非 Smad 信號通路能夠作為獨(dú)立的信號路徑或與Smads相聯(lián)系介導(dǎo)信號反應(yīng)，也可以控制Smad信號通路的活動；TGF-β 激活 ERK MAP酶呈現(xiàn)低水平狀態(tài)，盡管其激活水平通常遠(yuǎn)低于酪氨酸激酶受體，但是ERK的激活對于TGF-β 通路是非常重要的，ERK的激活和 Smad 信號通路參與了TGF-β介導(dǎo)的EMT過程，是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵點(diǎn)[21]；其次，ERK MAP激酶磷酸化受體激活了Smads信號來調(diào)節(jié)其核轉(zhuǎn)移，并且ERK底物與Smads相互作用調(diào)節(jié)基因的表達(dá)[22]。

Lee等[22]研究表明，TGF-β直接磷酸化ShcA激活ERK MAPK信號通路，ShcA與酪氨酸結(jié)合并通過TbRI被磷酸化，從而為Grb2和So的募集提供對接位點(diǎn)，并且允許Shc/Grb2/Sos復(fù)合物在激酶級聯(lián)上游啟動Ras活化[21]。MAPK(尤其是ERK1/2)能夠磷酸化Smad1/5的連接子，幾乎總是阻斷Smad1/5核易位[23]。TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在EMT誘導(dǎo)中的作用增加Ras-ERK MAP激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，由于ERK 1/2MAP激酶靶向多種轉(zhuǎn)錄因子，這種與TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的合作可能發(fā)生在基因表達(dá)水平上，這與Smads在激活EMT過程中的關(guān)鍵作用是一致的。因此，MEK/ ERK MAP激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的激活增強(qiáng)TGF-β誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，導(dǎo)致E-cadherin下調(diào)、N-cadherin上調(diào)和MMPs表達(dá)上調(diào)[21]。

3.3 TGF-β在LEC介導(dǎo)的EMT過程TGF-β/TβR/Smad信號通路、Wnt信號通路、Notch信號通路及PI3K/Akt信號通路被證實(shí)能夠引起EMT的發(fā)生。TGF是EMT最有效的誘導(dǎo)劑。大量研究表明，TGF-β2使LEC從立方形到紡錘體樣表型改變，并且增加了上皮標(biāo)識的表達(dá)，如E-cadherin、閉合小帶蛋白-1(zonula occludens-1，ZO-1)以及間充質(zhì)標(biāo)記物α-SMA和fibronectin的表達(dá)、連接復(fù)合體被抑制，這些均導(dǎo)致了上皮細(xì)胞間黏附功能的失調(diào)[24-25]。Chen等[26]發(fā)現(xiàn) TGF-β在LECs中激活的ERK1/2信號通路與經(jīng)典的 TGF-β2/Smad信號通路是獨(dú)立的過程，用U0126抑制ERK1/2信號通路顯著阻止了TGF-β2介導(dǎo)的EMT，而且也抑制了經(jīng)典的Smad信號通路和Jagged/Notch信號通路。

4 Sprouty

4.1 Sprouty的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)Sprouty(Spry)首先在果蠅中由成纖維細(xì)胞生長因子(fibroblast growth factor，F(xiàn)GF)誘導(dǎo)的氣管支化過程中作為負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白被發(fā)現(xiàn)。果蠅Spry是第一個被發(fā)現(xiàn)的Spry蛋白家族成員，Spry的同源性在小鼠和人類中得到鑒定。Spry蛋白家族是由生長因子激活MAPK通路的活化介導(dǎo)負(fù)反饋環(huán)路調(diào)制器的高度保守成員，其表達(dá)被高度限制與已知的FGF信號位點(diǎn)的表達(dá)有關(guān)，小鼠和人的基因組均包括4種Spry基因(Spry1～4)[20-27]，它們具有高度保守的COOH末端和Spry結(jié)構(gòu)域，以及可變的NH2-末端結(jié)構(gòu)域[28]。spry3表達(dá)在成人的大腦和睪丸中表達(dá)，但在胚胎中并不表達(dá)。在小鼠中丟失的功能研究表明，Spry1和Spry2在多種器官發(fā)育的萌芽初期，包括腎臟、內(nèi)耳、牙齒及腦皮質(zhì)圖形化的早期發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[29]。研究表明，Spry2是小鼠成熟晶狀體纖維細(xì)胞表達(dá)的主要亞型，而且在晶狀體發(fā)育期間，Spry2負(fù)性調(diào)控ERKs使晶狀體囊泡分離，小鼠晶狀體中基因敲除Spry2基因后增加了TGF-β誘導(dǎo)的EMT過程，spry2的過表達(dá)抑制了LECs的增殖及分化過程[18]。

4.2 Sprouty對Ras/MAPK 信號通路的抑制作用多種生長因子與后囊膜混濁有密切的聯(lián)系，包括FGF、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)、內(nèi)皮生長因子 (endothelial growth factor，EGF)和 TGF，生長因子信號通路主要由受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)激活[18]。在哺乳動物中，Spry蛋白是RTK等信號通路的抑制因子，然而在一些細(xì)胞中Spry能夠增強(qiáng)RTKs，如EGF受體(EGFR)信號通路[20]。大多數(shù)生長因子通過與細(xì)胞表面的RTKs有著高度親和力來介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答，這導(dǎo)致了幾個相關(guān)的細(xì)胞內(nèi)信號通路的激活，包括PI3-K、PLC-γ和 Ras/ERK信號通路[30];Ras誘導(dǎo)的ERK通路(Raf-MEK-ERK)通常是生長因子通過RTKs激活并動員適應(yīng)蛋白，如Shc和Grb2，以及Sos。激活的Ras與Raf家族蛋白關(guān)聯(lián)通過三級酶促級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致MEK和ERK的激活，TβRIs與RTKs相類似，活化TβRIs的募集并直接在酪氨酸激酶以及絲氨酸激酶上磷酸化ShcA，形成ShcA/Grb2/Sos復(fù)合物激活ERK/MAPK 信號通路，雖然TβRIs的酪氨酸激酶活性遠(yuǎn)低于RTKs，但是觸發(fā)ShcA的磷酸化與Grb2和Sos相關(guān)，從而激活Ras/ERK通路[13,17,22]。

Spry是RTK介導(dǎo)的Ras/ERK/MAPK 信號通路特異的抑制蛋白，參與多種系統(tǒng)中抑制細(xì)胞的增殖、遷移和分化，然而對PI3K及其他的MAPK信號通路沒有影響[31-32]。Spry抑制Ras/MAPK 信號通路的各級水平，有12個交互蛋白，包括微囊蛋白1(Caveolin-1)、c-Cbl、Grb2、FRS2、Raf-1 和Shp2 等，阻止與MEK結(jié)合從而抑制ERK通路[17,20]。其中 ERK信號分子是 MAPKs 家族的主要成員之一，ERK/MAPKs 在晶狀體中是最豐富的 MAPKs，并且此通路的激活對胚胎的發(fā)育、細(xì)胞周期進(jìn)程及細(xì)胞的分化有重要意義[30]。

最近研究表明，Spry蛋白在體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞中能夠逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的 EMT表型，Spry的下調(diào)與TGF-β介導(dǎo)的EMT 和纖維化過程有重要的聯(lián)系。特別是在EMT過程相關(guān)導(dǎo)致的惡性腫瘤轉(zhuǎn)移期內(nèi)，Spry1、 Spry2和Spry4在乳腺癌、前列腺癌、肝癌及肺癌中表達(dá)下調(diào)[33]。Zhao等[31]研究了選擇性MAPK/ERK1/2拮抗劑Spry、Sef和Sprind對TGF-β誘導(dǎo)的EMT有阻斷作用，結(jié)果提示所有被檢測的拮抗劑均具有阻斷TGF-β誘導(dǎo)EMT的能力，特別發(fā)現(xiàn)Spry1是最有效的拮抗劑，這可能歸因于Spry1N-末端 EVH1(Enabled/VASP homology 1)的結(jié)構(gòu)域。Spry蛋白對MAPK/ERK和RTK信號通路有反饋抑制作用。眾所周知，ERK/MAPK途徑可以響應(yīng)TGF的刺激，并在許多細(xì)胞環(huán)境中協(xié)調(diào)TGF-Smad信號通路，因為ERK/MAPK信號通路是Spry蛋白的良好靶點(diǎn)，并且Spry的過度表達(dá)可以阻斷異常TGF-Smad信號導(dǎo)致的EMT過程，這表明了ERK/MAPK通路在TGF誘導(dǎo)EMT中的作用。雖然TGF反應(yīng)主要通過經(jīng)典的Smad信號級聯(lián)發(fā)生，但是通過與其他細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的相互作用，使其變得更加復(fù)雜及多樣化[13]。

4.3 Sprouty對LEC的影響MAPK/ERK信號通路的抑制劑如 Spry、Sef、Spred在LEC中強(qiáng)烈表達(dá)。雖然晶狀體中Sef的缺乏似乎對晶狀體發(fā)育沒有影響，但是當(dāng)Spry1和Spry2基因從小鼠晶狀體中敲除時，這些突變小鼠的晶狀體上皮在出生后經(jīng)過異常的細(xì)胞活動導(dǎo)致白內(nèi)障的發(fā)生，而Spry2過表達(dá)則抑制LECs的增殖和分化，這些研究強(qiáng)調(diào)了Spry在小鼠晶狀體發(fā)育和白內(nèi)障發(fā)生中的重要性[34]。

晶狀體中Spry的缺乏可損害LEC內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，包括使ERK1/2的磷酸化增加，以及Smad2/3、snail和slug(TGF-β下游靶基因)的核異位，從而導(dǎo)致E-cadherin分子的失調(diào)以及α-SAM上調(diào)，這均導(dǎo)致細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)化、ECM的異常沉積，最終導(dǎo)致EMT的發(fā)生[31]。Spry對TGF-β有著逆轉(zhuǎn)的聯(lián)系，在晶狀體上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中Spry的表達(dá)下調(diào)了TGF-β的應(yīng)答。而且，Shin等[20]最近研究證明，晶狀體后囊中缺乏Spry1/2結(jié)果增加了ERK1/2的磷酸化，導(dǎo)致了Smad2信號通路的異?；罨筁EC發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而引起白內(nèi)障的發(fā)生，以及在晶狀體細(xì)胞中Spry過表達(dá)能夠有效阻止TGF-β信號通路，轉(zhuǎn)而抑制EMT過程和白內(nèi)障的形成。Tan等[18]在人LECs中研究證實(shí)，Spry2通過抑制Smad2和ERK1/2的磷酸化過程負(fù)性調(diào)節(jié)TGF-β2誘導(dǎo)的 EMT和遷移，盡管Spry2對LECs中其他生長因子信號通路的調(diào)節(jié)作用還有待研究，但是Spry2對ERK1/2的抑制作用表明Spry2也可能負(fù)向調(diào)節(jié)人LEC中的FGF和EGF信號通路。

5 總結(jié)及展望

Spry作為抑制RTK信號通路激活的重要負(fù)向調(diào)節(jié)因子，與TGF-β信號通路存在交叉關(guān)系，Spry基因的敲除或Spry蛋白不表達(dá)不僅僅能夠?qū)е抡EC生理功能的喪失，也可導(dǎo)致EMT，從而導(dǎo)致PCO病理過程的發(fā)生。總的來說，Spry在TGF信號通路中具有抑制作用。目前Spry在PCO的病理基礎(chǔ)及發(fā)病機(jī)制仍有待更多的研究來確定。在人晶狀體組織和上皮細(xì)胞中的Spry可能成為預(yù)防和治療PCO的新的治療靶點(diǎn)。