HPLC-ELSD法測(cè)定北芪五加顆粒中黃芪甲苷的含量

趙留濤，韓志霞，魏紅艷，韓冰倩，陳晶晶，高梓晴，李憲斌，李江龍，袁之潤(rùn)，陳五常，吳春麗,4*

（1.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南鄭州450001；2.商丘愛己愛牧生物科技股份有限公司，河南虞城476300；3.鄭州愛己愛牧生物技術(shù)有限公司，河南鄭州450001；4.鄭州市新型獸藥制劑創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南鄭州450001）

北芪五加顆粒處方由黃芪和刺五加兩味藥材組成，其中具有益氣健脾、補(bǔ)腎安神功效[1]，用于提高禽的機(jī)體自身免疫力，配合疫苗使用提高疫苗免疫效果，廣泛用于畜禽養(yǎng)殖。 現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明黃芪具有顯著的免疫增強(qiáng)作用[2-3]，主要化學(xué)成分為多糖類[4]、皂苷類[5]及黃酮類[6]等，黃芪甲苷是黃芪提高畜禽機(jī)體免疫力的主要活性成分[7]，是控制黃芪及其制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)，因此將其做為控制北芪五加顆粒質(zhì)量的指標(biāo)。 本文研究建立了高效液相色譜－蒸發(fā)光散射法(HPLC-ELSD)測(cè)定北芪五加顆粒中黃芪甲苷的含量，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

儀器： Waters e 2695 型高效液相色譜儀，Waters 2424 蒸發(fā)光檢測(cè)器，Empower 化學(xué)工作站（美國(guó)沃特世公司）；METTLER TOLEDO AB135-S萬分之一天平（瑞士梅特勒- 托利多公司）；黃芪甲苷對(duì)照品，批號(hào)：1521-201003，購于中國(guó)藥品生物制品檢定所提供；乙腈（色譜級(jí)）；純化水；其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈- 水(37：63)為流動(dòng)相；用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器。 理論板數(shù)按黃芪甲苷峰計(jì)算不低于3500。

2.2 溶液配置

2.2.1 黃芪甲苷對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對(duì)照品適量， 加甲醇定容制成每1 ml 中含0.2 mg 的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取北芪五加顆粒適量，研細(xì)，精密稱定5.0g，置于具塞錐形瓶中，精密加甲醇50ml，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率33kHz）30 min，放置冷卻至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足失重量，搖勻，過濾，精密量取續(xù)濾液25ml，置水浴上蒸干，殘?jiān)铀?0ml，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3 次，每次20ml，合并正丁醇提取液，用氨試液20ml 洗滌，棄去氨試液，再用正丁醇飽和的水20ml 洗滌，棄去水洗液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液制備 依據(jù)處方中藥材的比例， 按標(biāo)準(zhǔn)制法制備缺黃芪藥材的陰性對(duì)照樣品，按2.2.2 項(xiàng)操作制備樣品陰性對(duì)照溶液。 按照上述色譜條件，分別將對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液注入色譜儀測(cè)定，結(jié)果陰性樣品色譜在與黃芪甲苷峰相應(yīng)的保留時(shí)間附近無干擾峰檢出。

2.3 測(cè)定法 分別精密吸取對(duì)照品溶液3 μl 和6 μl 及供試品溶液3 μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，以外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性照上述2.1 項(xiàng)下色譜條件，分別精密吸取陰性對(duì)照溶液10μL、供試品溶液10 μL、對(duì)照品溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。結(jié)果表明，陰性對(duì)照溶液在黃芪甲苷對(duì)照品相應(yīng)的保留時(shí)間處無干擾，見圖1。

2.4.2 線性關(guān)系考察 精密取黃芪甲苷對(duì)照品適量， 制成5 個(gè)不同濃度， 分別為0.05 mg/ml、0.10 mg/ml、0.20 mg/ml、0.50 mg/ml、1.00 mg/ml的對(duì)照品溶液，按2.1 項(xiàng)操作，分別測(cè)定峰面積，然后以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，黃芪甲含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線， 計(jì)算線性回歸方程，Y=1.57e+000X+2.29e+000，相關(guān)系數(shù)r=0.9993。試驗(yàn)結(jié)果見表1。 結(jié)果表明黃芪甲苷濃度在0.05～1.00 mg/ml 范圍內(nèi)，呈線性關(guān)系，結(jié)果見圖2。

圖1 專屬性考察色譜圖

圖2 黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.3 精密度試驗(yàn) 使用高效液相色譜儀， 連續(xù)進(jìn)樣6 次， 每次進(jìn)樣量為3 μL 黃芪甲苷對(duì)照品溶液，測(cè)得黃芪甲苷峰面積RSD 為0.93%，結(jié)果表明，所建立方法的精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性 取同一供試品，按2.2.2 項(xiàng)操作制備方法制備6 份供試液，分別進(jìn)樣檢測(cè)黃芪甲苷峰面積，并分別計(jì)算黃芪甲苷含量和含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD 為2.50%，結(jié)果顯示，所建立方法的重現(xiàn)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、1、2、3、4、5 小時(shí)時(shí)測(cè)定黃芪甲苷峰面積、 并分別計(jì)算含量和含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，RSD 為2.10%，表明5 小時(shí)內(nèi)供試品溶液中黃芪甲苷在5 小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 回收率 取同一批號(hào)已知含量供試品 （黃芪甲苷含量0.5802 mg/g）20 g，研細(xì)，混勻，取2.5g，精密稱定，共取6 份，各加入黃芪甲苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1 ml， 按2.2.2 項(xiàng)操作制備方法制備供試品溶液，按2.3 項(xiàng)操作進(jìn)樣量，測(cè)的黃芪甲苷峰面積并計(jì)算其含量，再算出加樣回收率，測(cè)得平均回收率為101.93%，RSD 為2.95%，表明方法準(zhǔn)確度良好，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)（n=6）

2.4.7 樣品含量測(cè)定取20110201、20110202 和20110203 三個(gè)批號(hào)供試品， 按照2.2.2 項(xiàng)下的方法制備供試品溶液并測(cè)定， 計(jì)算黃芪甲苷的含量，含量分別為0.48 mg/g、0.50 mg/g、0.50 mg/g。

3 討論

3.1 色譜柱選擇與耐用性試驗(yàn)T3 色譜柱是基于超純硅膠基質(zhì)的反相C18 色譜柱，在保留和分離強(qiáng)極性化合物使用效果好，而且在較寬的pH 值范圍內(nèi)保持良好性能。 同常規(guī)C18 色譜柱相比，T3 色譜柱具有不同的分離選擇性和相對(duì)更好的保留性能。 更適合極性較大的化合物。 黃芪甲苷是自黃芪中提取分離的單體化合物，是皂苷類成分的一種極性較大化合物，所以用ACQUITY UPLC HSS T3 色譜柱進(jìn)行質(zhì)量研究。 同時(shí)C18色譜柱做耐用性理論塔板等性能也較好，在以后的含量測(cè)定中也可使用。

3.2 流動(dòng)相的確定 參考文獻(xiàn)[8-9]流動(dòng)相乙腈-水(32：68)條件下調(diào)整流動(dòng)相比例，最終確定流動(dòng)相比例為乙腈- 水(37：63)。

3.3 蒸發(fā)光檢測(cè)器條件的優(yōu)化[10]

3.3.1 氣體壓力的優(yōu)化 考察氣體壓力分別為25psi、30psi、35psi，結(jié)果顯示氣壓大小影響霧化，氣壓增大信噪比也增大，但峰面積減小，所以最終定氣壓25psi。

3.3.2 漂移管溫度的優(yōu)化 分別考察漂移管溫度為55℃、60℃、65℃、70℃條件，結(jié)果表明黃芪甲苷峰各項(xiàng)指標(biāo)在漂移管溫度為60℃時(shí)效果較好，因此設(shè)定漂移管溫度為60℃。

4 結(jié)論

試驗(yàn)研究證明HPLC-ELSD 法測(cè)定北芪五加顆粒中黃芪甲苷的含量，在上述試驗(yàn)條件下，黃芪甲苷分離度良好，保留時(shí)間合適，方法學(xué)考察表明該方法專屬性、重復(fù)性、精密度良好，能夠準(zhǔn)確測(cè)定出黃芪甲苷的含量，從而有效控制北芪五加顆粒的質(zhì)量。