循環(huán)非編碼RNA作為生物標(biāo)志物在心血管疾病中作用的研究進展

馬建君?黃萍

【摘要】人類基因組轉(zhuǎn)錄過程中產(chǎn)生了大量的非編碼RNA分子（ncRNA），其中一些分子具有重要的生物調(diào)節(jié)功能。近十年來，ncRNA在心血管生物學(xué)中的關(guān)鍵作用逐漸得到發(fā)掘，以發(fā)現(xiàn)微小RNA（miRNA）參與心血管發(fā)育和功能調(diào)節(jié)為起始，之后進一步使用循環(huán)的ncRNA作為心血管疾病的生物標(biāo)志物。在心血管疾病中，循環(huán)ncRNA包括miRNA、長鏈非編碼RNA以及環(huán)狀非編碼RNA，循環(huán)ncRNA被認為是心肌梗死、心力衰竭和心房顫動等多種心血管疾病的生物標(biāo)志物。該文對循環(huán)ncRNA作為心血管疾病生物標(biāo)志物的研究現(xiàn)狀和前景，包括其分泌機制和調(diào)控作用等相關(guān)問題進行綜述。

【關(guān)鍵詞】循環(huán)非編碼核糖核酸;心血管疾病;生物標(biāo)志物

Research progress on the role of circulating non-coding RNA as a biomarker of cardiovascular diseases ?Ma Jianjun， Huang Ping. Department of Neurology， Peoples Hospital of Haiyan County， Haiyan 314300， China

Corresponding author， Huang Ping， E-mail： huangpin19821217@ 163. com

【Abstract】A myriad of non-coding RNA molecules （ncRNAs） are produced during the process of human genome transcription，and some of these ncRNAs have important biological regulatory functions. In the recent decade，the pivotal role of ncRNAs in cardiovascular biology has been gradually explored. At the beginning， the microRNAs （miRNAs） are found to be involved in cardiovascular development and function regulation. Subsequently，circulating ncRNAs are considered as the biomarkers of cardiovascular diseases. Circulating ncRNAs including miRNA， linear long non-coding RNAs （lncRNAs） and circular long non-coding RNAs （circRNA） are considered as the biomarkers of cardiovascular diseases，such as myocardial infarction，heart failure and atrial fibrillation， etc. In this article， the current status and prospects of circulating ncRNAs as the biomarkers of cardiovascular diseases were summarized mainly from the aspects of secretion and regulation mechanism.

【Key words】Circulating non-coding RNA;Cardiovascular disease;Biomarker

心血管疾?。–VD）是全球范圍內(nèi)人類健康的重要威脅之一。考慮到CVD所帶來巨大的社會負擔(dān)，關(guān)于疾病管理方面的進步不應(yīng)僅局限在對這些疾病的治療研究，還應(yīng)著眼于開發(fā)早期檢測和預(yù)防CVD的平臺。近些年，多個與CVD相關(guān)的生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床。根據(jù)美國臨床化學(xué)協(xié)會（AACC）的要求，目前臨床上常用的心臟生物標(biāo)志物是心肌鈣蛋白和肌酸激酶（CK）。然而，隨著深度RNA測序技術(shù)的發(fā)展和進步，包括非編碼RNA（ncRNA）在內(nèi)的基因組新成員逐漸被發(fā)現(xiàn)，它們不編碼蛋白質(zhì)，但可以調(diào)節(jié)基因的功能，從而調(diào)節(jié)一系列生理及病理過程。根據(jù)功能、長度和結(jié)構(gòu)不同，ncRNA可分為轉(zhuǎn)移RNA（tRNA）、核糖體RNA（rRNA）、小核RNA（snRNA）、小核仁RNA（snoRNA）、引導(dǎo)RNA（gRNA）、微小RNA（miRNA）、長鏈ncRNA（lncRNA）、環(huán)狀ncRNA（circRNA）等。其中miRNA和lncRNA在CVD的治療、預(yù)后和診斷中的作用已經(jīng)得到了研究者的重視。此外，近幾年新發(fā)現(xiàn)的circRNA，由前體mRNA反向剪接產(chǎn)生，存在于多種物種中，各領(lǐng)域研究結(jié)果均提示其可能參與廣泛的病理生理功能調(diào)節(jié)。ncRNA存在于血液等外周循環(huán)中，并穩(wěn)定存在于多種環(huán)境條件，在多種疾病早期診斷和預(yù)后中體現(xiàn)了獨特的價值。

一、ncRNA與心血管病理生理學(xué)

ncRNA可以分為小家族（< 200 nt）或大家族（> 200 nt）。小ncRNA是基因組位點通過轉(zhuǎn)錄和特定核酸酶的進一步加工產(chǎn)生的，而大的ncRNA則是通過與產(chǎn)生編碼mRNA相同的轉(zhuǎn)錄和剪接機制產(chǎn)生。在ncRNA發(fā)現(xiàn)之初，人們即發(fā)現(xiàn)其對于正常的心臟生理功能是必要的，由此認識到ncRNA在心血管病理生理過程中的重要作用。在過去的十年里，CVD中由ncRNA控制的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)逐漸顯露。與心血管生理過程和疾病有關(guān)的ncRNA主要有miRNA、lncRNA和circRNA。

人類基因組中，miRNA是小ncRNA中最豐富的家族，含有2000多個不同的miRNA基因座。miRNA通過與編碼轉(zhuǎn)錄本的3-UTR區(qū)域結(jié)合，并招募形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物的特定沉默蛋白，對靶基因的基因表達發(fā)揮負調(diào)控作用。在正常情況下，miRNA作為調(diào)節(jié)因子維持蛋白質(zhì)水平，調(diào)控生理穩(wěn)態(tài)，miRNA的調(diào)節(jié)活性與其mRNA靶基因有關(guān)。而在病理狀態(tài)下，某些miRNA的異位表達可能導(dǎo)致其非自然靶基因的調(diào)節(jié)和功能失衡。研究者最初是通過研究miRNA在如心力衰竭、心肌梗死或心肌病等特定心臟疾病中的異常表達模式來推斷其在心肌中的病理生理作用的[1-2]。而深入研究表明，miRNA在心血管生物學(xué)不僅作為調(diào)節(jié)分子存在，同時也可成為潛在的治療靶點，具有重要的研究意義[3-4]。人心肌特異性miRNA可參與心臟收縮功能的調(diào)節(jié)，心肌特異性miRNA在動物模型中的異常表達導(dǎo)致心肌功能異常如心肌肥厚、心律失常和纖維化等[4]?；诟咄繙y序技術(shù)的發(fā)展，數(shù)百個miRNA在CVD的發(fā)生和發(fā)展中的作用得以表征。而進一步的研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)與CVD相關(guān)的miRNA并不是心臟特異性的，比如miR-21-5p或miR-126-3p等以前被認為是癌癥相關(guān)的miRNA，在CVD中作為調(diào)節(jié)心肌纖維化的關(guān)鍵分子存在，參與心室重構(gòu)、心力衰竭的調(diào)節(jié)。并且有相當(dāng)一部分與CVD有關(guān)的miRNA可以在人類體液（包括血液、尿液和唾液）中作為循環(huán)物質(zhì)被檢測出來，這提示了它們可能作為生物標(biāo)志物的應(yīng)用價值[5]。

lncRNA是長度大于200 nt的ncRNA轉(zhuǎn)錄物，是由類似于蛋白質(zhì)編碼基因但缺乏編碼潛能的轉(zhuǎn)錄單位產(chǎn)生的。lncRNA可與基因組DNA和RNA均發(fā)生相互作用，作為靈活的分子支架來招募染色質(zhì)修飾酶和轉(zhuǎn)錄因子，從而輔助它們完成正確的功能定位，因此人們越發(fā)認識到其在調(diào)節(jié)細胞功能方面的重要作用。lncRNA也可作為競爭的內(nèi)源性RNA，通過“海綿”來調(diào)節(jié)miRNA的活性，從而使miRNA遠離天然的mRNA靶標(biāo)[6]。近年來，

lncRNA-HBL1被認為是人類誘導(dǎo)多功能干細胞向心肌細胞發(fā)育的調(diào)節(jié)因子，其過度表達通過一種競爭性結(jié)合hsa-miR-1的機制來抑制心肌細胞的分化[7]。

circRNA是由非典型反向剪接的RNA轉(zhuǎn)錄本反向連接外顯子邊界產(chǎn)生的ncRNA家族。目前的研究表明，circRNA主要作為分子海綿捕獲其他RNA分子，控制其他調(diào)節(jié)蛋白或miRNA分子水平[8]。在人心肌組織中，circRNA的豐度一般與其同源的mRNA有關(guān)。近年來的報道揭示了circRNA通過調(diào)控miRNA水平在心血管疾病中的重要作用，動物模型實驗顯示，一些circRNA通過結(jié)合miR-141或miR-26b-5p促進心肌纖維化，或者通過結(jié)合miR-223作為心肌肥大的保護因子[9-11]。

二、ncRNA的分泌性調(diào)節(jié)

人類和其他真核細胞能夠利用特異性細胞分泌機制主動分泌RNA，因此在細胞外培養(yǎng)基以及人的體液循環(huán)中均可檢測到ncRNA。對于細胞外RNA的研究報道一直在持續(xù)增加，不僅由于它們所具有的內(nèi)在調(diào)節(jié)功能，也在于它們可以作為疾病和治療反應(yīng)的生物標(biāo)志物。在分泌調(diào)節(jié)性RNA中，miRNA是CVD中最廣泛的生物標(biāo)志物，但是最近其他循環(huán)RNA，如lncRNA和circRNA的研究越來越受到人們的關(guān)注。細胞外囊泡（EV）是由脂質(zhì)雙層包裹的小細胞衍生結(jié)構(gòu)，直徑可達4000 nm，心血管系統(tǒng)內(nèi)的細胞在生理以及心肌梗死、腦卒中或冠狀動脈疾病等病理條件下釋放不同的EV，可在血液、尿液、唾液和腦脊液等體液中被檢測到，其數(shù)量和分子組成取決于釋放的細胞來源和類型。其中外泌體和微囊泡是兩種大小、產(chǎn)生機制和特異性分子特征均不同的EV類型，它們重點參與了細胞間ncRNA的轉(zhuǎn)移及信號通訊。

三、循環(huán)ncRNA作為心血管疾病的生物標(biāo)志物

1. 循環(huán)ncRNA與心力衰竭

心力衰竭是一種復(fù)雜的疾病，通常由其他疾病引起，其特點是心臟泵血效率下降，不能滿足身體和肺的所有需要。Tijsen等[12]篩選出與呼吸困難表型相關(guān)的6個水平上調(diào)的循環(huán)miRNA分子，其中只有miR-423-5p與心力衰竭密切相關(guān)，在慢性心力衰竭患者心肌內(nèi)上調(diào)。在對75例射血分?jǐn)?shù)下降的心力衰竭、射血分?jǐn)?shù)保留心力衰竭和非心力衰竭患者的分析中發(fā)現(xiàn)，miR-30c、miR-146a、miR-221、miR-328和miR-375在患者組中均有差異表達[13]。至少有50種循環(huán)miRNA和3種循環(huán)lncRNA具有成為心力衰竭不同表現(xiàn)的生物標(biāo)志物的潛力。心肌梗死所致心力衰竭患者中，循環(huán)線粒體lncRNA LIPCAR與發(fā)生心臟重構(gòu)相關(guān)，可作為獨立預(yù)測生存概率的危險因素[14]。NFAT非編碼抑制基因和肌球蛋白重鏈相關(guān)RNA轉(zhuǎn)錄子在心力衰竭患者血漿中上調(diào)，可能作為一種新的預(yù)測疾病的生物標(biāo)志物[15]。Boeckel等[16]在最近研究中指出，lncRNA Heat 2是一種在免疫細胞比較豐富的lncRNA，在心力衰竭患者的血液中升高，并發(fā)揮調(diào)控內(nèi)皮細胞功能的生物學(xué)作用。

2. ncRNA與心肌梗死

心肌梗死是心血管疾病的主要死亡原因之一，其特點是心肌組織局部受損，心肌缺乏血液供應(yīng)而導(dǎo)致細胞死亡。心肌肌球蛋白基因相關(guān)的心肌特異性miRNA（miR-208a/b以及miR-499）是心肌損害和梗死嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物[17]。在ST段抬高型心肌梗死患者中發(fā)現(xiàn)，循環(huán)miR-1、miR-133a、miR-133b和miR-499-5p的水平與肌鈣蛋白T濃度和LVEF的升高正相關(guān)，可能與梗死后心肌損傷和壞死的程度有關(guān)[18]。其他循環(huán)miRNA如miR-192-5p，miR-194-5p和miR-34a-5p也被證明是檢測心肌梗死后心力衰竭較為相關(guān)的風(fēng)險評估預(yù)測因子[19]。Zampetaki等[20]進行了為期10年的跟蹤研究，篩查了19種血漿miRNA，最終發(fā)現(xiàn)，miR-126的升高水平以及miR-223和miR-197的低水平與AMI的發(fā)生存在較強的關(guān)聯(lián)。一些循環(huán)的lncRNA也被認為是AMI的潛在生物標(biāo)志物。lncRNA UCA1，最初被鑒定為膀胱癌和肺癌等腫瘤的預(yù)測生物標(biāo)志物，同樣在健康成年人的心臟中特異表達，研究發(fā)現(xiàn)早期AMI患者血漿中l(wèi)ncRNA UCA1水平下降，發(fā)病后第3日升高，并且lncRNA UCA1循環(huán)水平與miR-1表達呈負相關(guān)[21]。Wu等[22]通過微陣列分析發(fā)現(xiàn)，在小鼠正常心肌組織中與心肌梗死組織中有63個circRNA存在差異表達。

3. 循環(huán)ncRNA與心肌病

心肌病是以心肌的形態(tài)和功能異常為特征的一組心臟疾病。當(dāng)它們起源于心肌功能障礙或生理變化時，可分為原發(fā)性或內(nèi)源性心肌病;當(dāng)其致病因素為心臟外部因素時，可分為繼發(fā)性或外源性心肌病。由于研究發(fā)現(xiàn)一些血漿miRNA（miR-423-5p）水平的增加與心肌病本身的嚴(yán)重程度無關(guān)，而是與初級病情相關(guān)的心力衰竭病例有關(guān)，關(guān)于循環(huán)miRNA能否作為擴張型心肌病患者的生物標(biāo)志物的研究還沒有定論[15]。肥厚性心肌病引起的心肌重構(gòu)似乎與miRNA向血流中的釋放有關(guān)，但僅少數(shù)miRNA（miR-199a-5p，miR-27A-3p，miR-29a-5p）與左心室肥厚參數(shù)存在相關(guān)，而只有miR-29a-5p與心肌肥厚和纖維化有關(guān)，提示其可作為評估心肌重構(gòu)的生物標(biāo)志物[23]。Khan等[24]通過對肥厚型心臟病和擴張型心臟病患者心臟標(biāo)本進行RNA序列分析發(fā)現(xiàn)，Camk2d circRNA在兩種患者中均存在下調(diào)，而titin circRNA僅在擴張型心臟病患者中下調(diào)。

4. 循環(huán)ncRNA與冠狀動脈疾病

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┦怯蓜用}粥樣硬化斑塊的形成引起的，伴隨著動脈壁的結(jié)構(gòu)重塑，內(nèi)皮細胞的活化，炎癥細胞的激活，最終可發(fā)展為心肌缺血。一般而言，冠心病和動脈粥樣硬化與內(nèi)皮功能障礙和脂質(zhì)代謝受損有關(guān)，miRNA可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)、細胞因子反應(yīng)性、白細胞募集和血管平滑肌細胞功能等多種途徑調(diào)節(jié)動脈粥樣硬化斑塊的形成和進展[25]。高脂血癥條件有利于miR-122-5p水平的增加，該miRNA可作為AMI的預(yù)后生物標(biāo)志物[26]。循環(huán)miR-208a-3p水平在心血管疾病中的表達明顯升高，與冠狀動脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度相關(guān)[27]。Xu等[28]報道循環(huán)lncRNA IFNG-AS1表達水平與冠心病患者疾病風(fēng)險增加、病情嚴(yán)重程度及炎癥升高有關(guān)。Zhang等[29]研究指出，在中國人群中，血漿lncRNA H19和LLIPCAR水平的升高與患冠心病的風(fēng)險增加有關(guān)，被認為可能是冠心病新的生物標(biāo)志物。最近，在一項由112例患者組成的研究中，Bazan等[30]發(fā)現(xiàn)，高級別頸動脈疾病急性癥狀患者血清中circRNA-284/hsa-mir-221比值顯著升高，并顯示出良好的特性，提示miRNA和circRNA可聯(lián)合作為斑塊破裂和腦卒中的生物檢測標(biāo)志。Yari等[31]對50例受CAD影響的患者外周血進行分析，lncRNA ANRIL表達變異與冠心病易感性存在關(guān)聯(lián)，為CAD患者提供了一個新的預(yù)測標(biāo)志物。Ziaee等[32]研究表明，lncRNA SENCR和CD14在單核細胞中的表達呈正相關(guān)，兩者的結(jié)合分析可以有助于早發(fā)性冠狀動脈疾病的早期無創(chuàng)診斷。

5.循環(huán)ncRNA與其他心血管疾病

心肌炎是一種心臟炎癥性疾病，可由微生物感染、免疫或自身免疫反應(yīng)引起，病毒感染引起的細胞損傷也能夠改變循環(huán)miRNA的表達譜。Corsten等[33]發(fā)現(xiàn)，2種心肌特異性miRNA——miR-208和miR-499，在急性病毒性心肌炎患者的血清中表達上調(diào)。這些miRNA的表達水平與疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。進一步研究血漿miRNA和lncRN7As可能會為心肌炎的診斷提供更為特異的ncRNA生物標(biāo)志物。心律失常包括心房顫動和心動過速，存在較高發(fā)病率和病死率。因此，用于心律失常診斷和預(yù)后的新的特異性生物標(biāo)志物對于治療這種疾病和預(yù)防心臟性猝死有著重要的意義。在反復(fù)發(fā)作的持續(xù)性心動過速患兒血漿中發(fā)現(xiàn)，室性心動過速患者中miR-133a水平增加，而miR-1在室上性心動過速患者中減少，提示兩者可能作為區(qū)分兩組患者的潛在標(biāo)志物[34]。除了心臟特異性的miRNA外，miR-150可能是心房顫動的另一個標(biāo)志，研究發(fā)現(xiàn)在陣發(fā)性和持續(xù)性心房顫動患者的血液中該miRNA水平降低[35]。

一些治療癌癥或其他疾病的藥物會引起心臟毒性和損傷，影響心臟功能，引起高血壓、細胞凋亡、心律失常、纖維化，最終導(dǎo)致心力衰竭。目前關(guān)于該種情況下患者血漿中ncRNA的水平研究還較少，第一個證據(jù)來自于一項評估異丙腎上腺素引起的大鼠心臟組織損傷的體內(nèi)研究，這種干預(yù)導(dǎo)致血清miR-208濃度增加與心肌損傷的常規(guī)血漿標(biāo)志物心肌肌鈣蛋白Ⅰ呈時間依賴關(guān)系，且不受腎損傷的影響;更多的體內(nèi)研究支持miR-208水平對異丙腎上腺素、甲丙腎上腺素、烯丙胺和米托蒽醌等藥物較為敏感[36-37]。然而在阿霉素化學(xué)治療過程中，乳腺癌患者的血液中沒有檢測到循環(huán)的miR-208[37]。這些差異可能是與物種的特殊性、給藥時間或劑量的不同有關(guān)，也可能由于藥物的不同有關(guān)，因此，也可能存在其他種類的藥物所致心臟毒性的miRNA生物標(biāo)志物。這需要更多的研究來詳細地描述miRNA和其他ncRNA在心臟毒性過程中的作用。

四、展 望

綜上所述，循環(huán)ncRNA作為CVD非侵入性生物標(biāo)志物，單獨或與經(jīng)典生化或電生理生物標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用的潛力是巨大的。使用循環(huán)ncRNA作為CVD的生物標(biāo)志物比傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物具有更大的優(yōu)勢，但是操作的標(biāo)準(zhǔn)化方案尚未得到確認，同時生物體液中回收少量核酸并定量也是一項比較具有挑戰(zhàn)性的技術(shù)探索。在循環(huán)ncRNA中，血漿/血清miRNA被認為是許多心臟病的潛在生物標(biāo)志物，在診斷、預(yù)后和治療反應(yīng)等方面有著廣泛的應(yīng)用。其他循環(huán)ncRNA，如lncRNA和circRNA，也是CVD領(lǐng)域很有前途的生物標(biāo)志物，雖然目前它們在CVD中的生理作用及機制還需要進一步深入研究。最近的文獻指出，ncRNA的真正作用是作為“遺傳激素”，可能通過循環(huán)的生物體液在器官“cross-talk”中傳遞來調(diào)節(jié)遠距離的靶細胞，但要了解它們的生物功能、機制和潛力，作為CVD的診斷工具和治療靶點，還有很長的路要走。

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（收稿日期：2019-05-12）

（本文編輯：楊江瑜）