防己薄層鑒別法優(yōu)化及不同部位化學(xué)成分差異分析

楊 帆，黃 旭，吳夢(mèng)麗，高 慧，謝陽(yáng)姣，2

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530200；2.廣西壯瑤藥工程技術(shù)研究中心，廣西 南寧 530200）

防己為防己科千金藤屬（Stephaniatetradra S.Moore）多年生落葉藤本植物，以根入藥，具有祛風(fēng)濕、利水消腫的功效［1］，其主要化學(xué)成分為生物堿類，包括粉防己堿、防己諾林堿、氧化防己堿等［2］。防己作為漢防己甲素片、防己關(guān)節(jié)丸等中成藥的原料藥在臨床上廣泛應(yīng)用［3-5］。薄層色譜法是中藥化學(xué)成分鑒定中常規(guī)方法之一，具有能同時(shí)分離多種樣品、固定相和流動(dòng)相的選擇與變換靈活性大等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于藥物分析、中藥檢驗(yàn)、藥物分離純化、中藥指紋圖譜等多個(gè)領(lǐng)域［6-10］。在《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部有關(guān)防己的標(biāo)準(zhǔn)中［1］，采用薄層方法對(duì)其進(jìn)行定性分析，其中使用的展開劑含有易制毒化學(xué)物三氯甲烷（氯仿）。張紹軒等［11］采用薄層色譜法對(duì)利心丸中牡丹皮、防己進(jìn)行定性研究，以及黃蘅［12］采用薄層色譜研究炎見(jiàn)寧片中防己的化學(xué)成分，兩者所用展開劑中同樣含有三氯甲烷。三氯甲烷對(duì)檢測(cè)人員具有較大的危害，宜進(jìn)行優(yōu)化。本研究擬在藥典標(biāo)準(zhǔn)上，對(duì)防己的薄層色譜法進(jìn)行優(yōu)化，去除三氯甲烷等有毒物質(zhì)，優(yōu)化顯色程序，為防己的快速鑒別提供更優(yōu)的方法。此外，采用優(yōu)化的薄層色譜法對(duì)防己根、莖、葉等不同部位進(jìn)行化學(xué)成分分析，初步探索防己不同部位的化學(xué)成分，為挖掘防己藥材更多的藥用價(jià)值提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 藥材 防己藥材于2018年10月采集于南寧和武鳴防己藥材種植基地，經(jīng)謝陽(yáng)姣研究員鑒定為正品。藥材經(jīng)60℃烘干后粉碎，過(guò)三號(hào)篩，置-4℃冰箱保存?zhèn)溆?。其中，條件考察均采用同一樣品，均為種植于武鳴的福建金坑鄉(xiāng)下炕組藥材的根。不同部位試驗(yàn)藥材為廣西南寧種植基地安徽3號(hào)根、莖、葉。

1.2 儀器與試藥 超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；千分之一電子天平（上海蒲春計(jì)量?jī)x器有限公司）；Sartorius BP211D分析天平（十萬(wàn)分之一）；HWS-26電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學(xué)儀器有限公司）；粉碎機(jī)（永康市速峰工貿(mào)有限公司）；雙槽展開缸（上海信宜儀器廠）；硅膠GF254板（青島海洋化工有限公司制造，規(guī)格25 mm×75 mm，批號(hào)20180626，厚度0.20～0.25 mm）；硅膠G板（青島海洋化工有限公司制造，規(guī)格50 mm×100 mm，批號(hào)20170626，厚度0.20～0.25 mm）；硅膠G板（青島海洋化工有限公司制造，規(guī)格100 mm×100 mm，批號(hào)20170626，厚度0.20～0.25 mm）；其余所用試劑均為分析純；粉防己堿對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品鑒定研究院（批號(hào)110711-201609，含量99.2%）；防己諾林堿對(duì)照品購(gòu)自北京中興嘉仁生物技術(shù)有限公司（批號(hào)170301-005，含量98%）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 取粉防己堿對(duì)照品、防己諾林堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 ml含粉防己堿0.1 mg、防己諾林堿0.05 mg的混合溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備 取本品根、莖、葉粉末（過(guò)三號(hào)篩）各約0.5 g，精密稱定，分別精密加入2%鹽酸甲醇溶液25 ml，稱定重量，超聲15 min，放冷，再稱定重量，用2%鹽酸甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液5 ml，置10 ml量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，即得。

2.3 TLC鑒別結(jié)果

2.3.1 藥典法 參照薄層色譜法［1］試驗(yàn)，分別吸取供試品、對(duì)照品溶液各5 μl，點(diǎn)樣于同一硅膠G板上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇-5%濃氨液（6∶1∶1∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.3.2 改進(jìn)的方法 取防己根、莖、葉粉末各1 g，分別加2%鹽酸甲醇15 ml，常溫超聲提取30 min，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)?%鹽酸甲醇5 ml使溶解，作為供試品溶液。另取粉防己堿對(duì)照品、防己諾林堿對(duì)照品，加甲醇制成每1 ml各含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（通則0502）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各8 μl，分別于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲醇-5%氨水（7∶1∶0.7∶0.3）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀試液，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖1 防己根、莖、葉TLC圖譜（藥典方法）

圖2 防己根、莖、葉TLC圖譜（改進(jìn)?的方法）

圖1 、圖2結(jié)果顯示，采用以上2種方法，在與對(duì)照品相對(duì)應(yīng)的色譜位置上供試品均顯相同顏色的斑點(diǎn)，且分離度均較好。比較根、莖、葉的色譜斑點(diǎn)數(shù)可知，所有部位藥典法顯色斑點(diǎn)數(shù)均少于改進(jìn)的方法，為更有效地鑒別化學(xué)成分差異，宜選擇改良的方法進(jìn)行鑒別。由改良方法的顯色結(jié)果可知，各斑點(diǎn)顯色程度有差異，根中的斑點(diǎn)顯色較清晰。斑點(diǎn)顏色的深淺通?？纱砗康母叩停梢?jiàn)，防己藥材無(wú)論是在不同部位還是主要成分的含量上均有著明顯的差異。

3 討 論

據(jù)報(bào)道，不同的提取溶劑、提取方法、點(diǎn)樣量、展開劑等對(duì)薄層色譜結(jié)果都會(huì)產(chǎn)生影響。因此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)上述影響因素進(jìn)行了考察。

3.1 不同提取溶劑比較 試驗(yàn)考察了50%甲醇、100%甲醇、90%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇、1%三乙胺甲醇、2%鹽酸甲醇等提取溶劑，發(fā)現(xiàn)每種提取溶劑差異不顯著，綜合考慮斑點(diǎn)大小和顏色深淺，選擇2%鹽酸甲醇作為最終的提取溶劑。

3.2 不同提取方法考察 以2%鹽酸甲醇為提取溶劑，考察藥典法回流1 h、超聲1 h、超聲30 min、超聲15 min的差異，發(fā)現(xiàn)4種提取方法顯色均較清晰，沒(méi)有顯著差異；但回流微有拖尾，且回流加熱操作復(fù)雜，擬考慮超聲提取。3個(gè)超聲時(shí)間之間，從節(jié)省時(shí)間方面考慮，選擇超聲15 min作為本試驗(yàn)的提取方法。

3.3 點(diǎn)樣量考察 試驗(yàn)分別對(duì) 8 μl、10 μl、12 μl、14 μl、16 μl點(diǎn)樣量進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，8 μl和10 μl之間顯色和斑點(diǎn)大小均無(wú)差異，12 μl、14 μl、16 μl存在不同程度的拖尾，故以8 μl和10 μl點(diǎn)樣量較好，從節(jié)省點(diǎn)樣量考慮，本試驗(yàn)采用8 μl為點(diǎn)樣量。

3.4 不同展開體系的考察 綜合文獻(xiàn)研究，本實(shí)驗(yàn)考察了乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（6∶1∶1∶0.1）、正丁醇∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（6∶1∶1∶0.1）、異丙醇∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（6∶1∶1∶0.1）、氯仿∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（6∶1∶1∶0.1）及乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（7∶1∶0.7∶0.3），發(fā)現(xiàn)除了乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（7∶1∶0.7∶0.3）能達(dá)到有效分離外，其他方法均有不同程度的拖尾，因此本試驗(yàn)采用乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（7∶1∶0.7∶0.3）為展開劑。

3.5 藥典和改進(jìn)的展開劑比較分析 試驗(yàn)考察了藥典法展開劑氯仿∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（6∶1∶1∶0.1）與改良的展開劑乙酸乙酯-丙酮-甲醇-5%濃氨液（7∶1∶0.7∶0.3）的展開效果。如果僅考察防己的主要藥用成分粉防己堿和防己諾林堿，藥典法和改良法的分離度和顯色程度均較好。但對(duì)于其他可能含量較低的化學(xué)成分，藥典法顯色效果較改良的方法差，顯色斑點(diǎn)數(shù)較少。在展開劑組分方面，藥典法展開劑中含有毒性較大的易制毒化學(xué)品氯仿，本試驗(yàn)試圖把氯仿?lián)Q為極性相似的異丙醇、正丁醇、乙酸乙酯，其他溶劑不變，發(fā)現(xiàn)異丙醇、正丁醇在跑板中很慢，分離度不好且拖尾嚴(yán)重，乙酸乙酯分離度也較差，但跑板快且顯示的斑點(diǎn)比藥典法多1個(gè)。通過(guò)調(diào)整乙酸乙酯-丙酮-甲醇-5%氨水的比例，發(fā)現(xiàn)在乙酸乙酯∶丙酮∶甲醇∶5%氨水（7∶1∶0.7∶0.3）的條件下，各成分斑點(diǎn)分離清晰，效果最好。藥典方法使用的展開劑中含易制毒化學(xué)物質(zhì)氯仿，潛在危害較大，改進(jìn)的方法以低毒的乙酸乙酯代替氯仿，克服了這一不足；其次能展現(xiàn)更多的化學(xué)成分，對(duì)于鑒定防己不同部位化學(xué)成分差異具有更好的效果。

本試驗(yàn)采用改良的展開劑，能分離更多的化學(xué)成分，發(fā)現(xiàn)根中有2個(gè)斑點(diǎn)莖中沒(méi)有出現(xiàn)，同時(shí)莖中有2個(gè)斑點(diǎn)根中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)，表明通過(guò)充分的分離，根與莖化學(xué)成分存在差異。葉與根的化學(xué)成分差異較大，但與莖有多個(gè)相同的斑點(diǎn)，表明地上部分化學(xué)成分具有相似之處。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，莖含有與根相同的主要活性成分粉防己堿和防己諾林堿，由于防己為落葉多年生植物，塊根生長(zhǎng)緩慢資源日漸不足，對(duì)根的藥用功效進(jìn)行開發(fā)，適當(dāng)替代防己根的應(yīng)用，可緩解防己資源的壓力。同時(shí)加大對(duì)葉的藥用功效的開發(fā)，可擴(kuò)大防己的生物利用度，減少資源浪費(fèi)。

本試驗(yàn)建立的2%鹽酸甲醇、超聲提取15 min為提取條件，硅膠G為薄層板、乙酸乙酯-丙酮-甲醇-5%氨水（7∶1∶0.7∶0.3）為展開劑、稀碘化鉍鉀為顯色劑、點(diǎn)樣量8 μl，常溫展開的薄層色譜條件，操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，能有效鑒別防己藥材不同部位的化學(xué)成分；防己根、莖、葉在化學(xué)成分類別和含量上均存在差異，可對(duì)其功效差異進(jìn)一步研究，為防己藥材高效利用提供參考。