HPV感染對(duì)宮頸COX-2表達(dá)及血PGE2表達(dá)水平的影響*

黃晶，潘宜云，周小娟，余英，程細(xì)云，劉聯(lián)斌，申昌梅，羅德平

（贛州市腫瘤醫(yī)院 1.婦科，2.化療科，3.檢驗(yàn)科，江西 贛州 341000）

人乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus,HPV）感染可導(dǎo)致慢性炎癥，炎癥相關(guān)基因環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase,COX-2）及前列腺素E2（Prostaglandin E2,PGE2）在慢性炎癥啟動(dòng)致癌信號(hào)通路過(guò)程中均具有重要作用，且可以相互作用，共同促進(jìn)腫瘤的增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移過(guò)程[1-3]。本研究初步探討HPV 感染對(duì)慢性宮頸炎組織、子宮頸上皮瘤（cervical intraepithelial neoplasia,CIN）和宮頸癌組織中的COX-2 表達(dá)水平及血PGE2含量的影響；研究從宮頸炎癥病變至宮頸癌轉(zhuǎn)化的不同階段，HPV 感染的狀態(tài)及程度與COX-2 和PGE2表達(dá)的相關(guān)性，揭示HPV 感染與炎癥反應(yīng)在宮頸病變進(jìn)展及評(píng)估宮頸早期病變的重要性?？赏麨檫M(jìn)一步闡明宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學(xué)機(jī)制，為相關(guān)疾病的臨床診斷、治療、預(yù)后提供理論與實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為宮頸癌的三級(jí)預(yù)防提供新的視角。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2014年1月—2015年12月贛州市腫瘤醫(yī)院符合納入標(biāo)準(zhǔn)的初診為宮頸癌患者40 例作為宮頸癌組。年齡28～69 歲，中位年齡45 歲；腺癌5 例 （12.5%），鱗癌35 例（87.5%）。按照國(guó)際婦產(chǎn)聯(lián)盟 （Figo）宮頸癌分期，Ⅰ期16 例（40.0%），Ⅱ期10 例（25.0%），Ⅲ期14 例（35%），取標(biāo)本前均未接受放、化療。選取同期因婦科疾病治療或門診治療的慢性宮頸炎患者20 例（宮頸炎組）及CIN 患者20 例（CIN 組）。

宮頸癌患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①初診宮頸癌病理診斷明確患者；②Karhofsky 評(píng)分＞70 分；③2 周內(nèi)未服用消炎痛、阿司匹林等影響前列腺素代謝類藥，3 d 內(nèi)未做陰道沖洗或使用陰道內(nèi)藥物，24 h 內(nèi)無(wú)性生活；④最小年齡18 歲，最大年齡70 歲；⑤患者自愿并簽署同意書。

慢性宮頸炎、CIN 患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①慢性宮頸炎、CIN 診斷明確；②2 周內(nèi)未服用消炎痛、阿司匹林等影響前列腺素代謝類藥，3 d 內(nèi)未做陰道沖洗或使用陰道內(nèi)藥物，24 h 內(nèi)未進(jìn)行性生活；③最小年齡18 歲，最大年齡70 歲；④患者自愿并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤患者；②盆腔有放療史；③合并有其他嚴(yán)重心、肺、肝、腎疾病史患者；④近期服用COX 抑制劑如：阿司匹林、消炎痛等。研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 HPV 病毒檢測(cè)標(biāo)本的采集HC Ⅱ配套采樣器采集保存宮頸細(xì)胞標(biāo)本1 份，受檢者取膀胱截石位，窺陰器暴露宮頸后，采用專用宮頸細(xì)胞采集刷按順/逆時(shí)針旋轉(zhuǎn)3～5 圈，收集細(xì)胞后固定，標(biāo)本上標(biāo)注姓名、年齡及病案號(hào)相關(guān)信息。按照美國(guó)Digene 公司HC Ⅱ HPV DNA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書步驟，通過(guò)雜交捕獲Ⅱ代技術(shù)檢測(cè)HPV（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59 和68 型），DML 2000 微孔板判讀器測(cè)量樣本的相對(duì)光單位（relative light unit,RLU），宮頸癌組的RLU/標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照的RLU 比值≥ 1.0 診斷為HPV 陽(yáng)性，若比值＜1.0，則判定為陰性。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測(cè)COX-2 mRNA術(shù)中取新鮮手術(shù)切除宮頸病變標(biāo)本，立即放入液氮中保存?zhèn)溆谩rizol 提取組織總RNA，根據(jù)Promega（北京）生物技術(shù)有限公司M-MLV 操作說(shuō)明書逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。qRT-PCR 檢測(cè)組織COX-2 及內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)。引物序列：COX-2 正向引物為5'-CTCCTGTGCCTGATGATTGC-3'，反向引物為5'-CAGCCCGTTGGTGAAAGC-3'；GAPDH 正 向 引 物為5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，反向引物為5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'。采用20.0 μl 反應(yīng)體系：SYBR Taq 10.0 μl，正反向引物（2.5 μmol/L） 各0.5 μl，cDNA 1.0 μl，RNase-Free H2O 8.0 μl，反向 引物（2.5 μmol/L）0.5 μl。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）參數(shù)：95℃預(yù)變性2 min，95℃變性15 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，總計(jì)45 個(gè)循環(huán)。

1.2.3 ELISA 檢測(cè)血PGE2含量分別采集CIN 組及宮頸癌組患者空腹靜脈血5 ml，5% EDTA 防凝，采血后2 000 r/min 離心5 min，分離血漿，置入-20℃冰箱中冷凍保存待測(cè)。ELISA 檢測(cè)血清PGE2的水平，PGE2檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D 公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV 病毒載量及COX-2 在不同宮頸組織中的表達(dá)

隨著宮頸病變進(jìn)展，HPV 病毒載量也增多，其中宮頸炎組（3.6±0.6）、CIN 組（6.5±1.5）、宮頸癌組（10.4±2.9），CIN 組及宮頸癌組與宮頸炎組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=66.950，P=0.000）（見圖1A）；qRT-PCR 檢測(cè)結(jié)果可見不同宮頸組織中COX-2 mRNA 均有一定程度表達(dá)，與宮頸炎組（4.1±0.9）比較，CIN 組（7.6±1.3）中COX-2 表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.884，P=0.001）；宮頸癌組（10.5±1.1）中COX-2 mRNA 表達(dá)與CIN 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-9.052，P=0.000），宮頸癌組中COX-2 mRNA 表達(dá)升高。由此可知，COX-2 表達(dá)與宮頸癌進(jìn)展有關(guān)（見圖1B）。

2.2 宮頸組織中HPV 感染與COX-2、PGE2 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性

根據(jù)HPV 感染狀態(tài)而分的HPV 陰性組和HPV陽(yáng)性組的COX-2 mRNA 表達(dá)水平分別為（4.7±1.2）和（10.2±1.6），HPV 感染陽(yáng)性宮頸組織中COX-2 mRNA 表達(dá)水平高于陰性宮頸組織（t=15.062，P=0.000）（見圖2A）；血清PGE2mRNA 表達(dá)水平分別為（7.0±1.9）和（10.5±2.3），HPV 感染陽(yáng)性宮頸組織中PGE2mRNA 表達(dá)與陰性宮頸組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.426，P=0.000）陽(yáng)性宮頸組織中PGF2mRNA 表達(dá)升高（見圖2B）。

2.3 宮頸癌患者血清PGE2 與HPV 病毒載量的相關(guān)性

宮頸癌患者HPV 感染陽(yáng)性與血清PGE2含量相關(guān)，進(jìn)一步分析得出患者HPV 感染后，隨HPV 病毒載量升高，血清PGE2含量亦隨之升高，宮頸癌患者血清PGE2與HPV DNA 載量呈正相關(guān)（rs=0.257，P=0.003）。見圖3。

圖1 HPV 病毒載量與COX-2 在不同宮頸組織中的表達(dá) （±s）

圖2 宮頸組織HPV 感染與COX-2、PGE2 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性 （±s）

2.4 宮頸癌組織COX-2 mRNA 與血清PGE2 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性

高表達(dá)COX-2 mRNA 與血清PGE2mRNA 表達(dá)增加相關(guān)，本研究結(jié)果進(jìn)一步提示宮頸組織癌中COX-2 mRNA 表達(dá) 與血清PGE2mRNA 表達(dá)相關(guān)，COX-2、PEG2mRNA 表達(dá)經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)（P＜0.05）不服從正態(tài)分布，采用Spearman 相關(guān)性檢驗(yàn)分析COX-2、PEG2mRNA 表達(dá)之間的相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者呈正相關(guān)（rs=0.684，P=0.000）。見圖4。

圖3 血清PGE2 與HPV 病毒載量的相關(guān)性

圖4 宮頸癌組織COX-2 mRNA 表達(dá)與血清PGE2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

宮頸癌是女性第二大常見惡性腫瘤，全球每年的新發(fā)例數(shù)約為53 萬(wàn)，占所有女性腫瘤的12 %，死亡數(shù)達(dá)27.5 萬(wàn)例[4]。我國(guó)是宮頸癌的高發(fā)區(qū)，占全世界新發(fā)例數(shù)的1/5～1/4，每年2 萬(wàn)～3 萬(wàn)婦女死于宮頸癌，嚴(yán)重威脅女性健康[5]。2004年IRAC 指出，HPV感染是CIN 及宮頸癌發(fā)生的必要因素，尤其是HPV 16 的持續(xù)感染。早期宮頸癌的治愈率在90%以上，早發(fā)現(xiàn)早治療是提高宮頸癌治愈率的關(guān)鍵。HC Ⅱ是目前宮頸癌篩查最常見方法之一，應(yīng)用于HPV 感染的篩查，具有高度敏感性、客觀性及可重復(fù)性。許多研究指出CIN 的病變程度與HPV 病毒載量相關(guān)，HPV病毒載量越高，宮頸癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)越高[6-7]，但也有研究指出HPV 病毒載量與宮頸病變無(wú)相關(guān)[8]，該結(jié)論仍存在一定爭(zhēng)議。本研究通過(guò)HC Ⅱ檢測(cè)HPV 分型及病毒載量，以HPV 16 感染為主，統(tǒng)計(jì)分析宮頸癌HPV 病毒載量最高，CIN 次之，宮頸炎最低。

COX 是前列腺素生物合成過(guò)程中的關(guān)鍵限速酶，可催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化成各類前列腺素[9]。前列腺素合成后，以自分泌或旁分泌方式釋放并結(jié)合細(xì)胞特異性G 蛋白偶聯(lián)受體，從而參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的生理活動(dòng)[10]。COX-2 作為宮頸癌預(yù)后的危險(xiǎn)因素，與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤生長(zhǎng)浸潤(rùn)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均密切相關(guān)，甚至貫穿宮頸癌病變的整個(gè)過(guò)程[11-13]。本研究結(jié)果顯示，COX-2 在宮頸癌及CIN 組織中表達(dá)均高于宮頸炎組織，這與早期病變時(shí)主要以炎癥反應(yīng)為主這一因素相關(guān)。HPV 病毒E6、E7基因可誘導(dǎo)COX-2 異常高表達(dá)，這與其E6、E7 蛋白結(jié)合性抑制p53 及pRb 蛋白，進(jìn)而導(dǎo)致DNA 損傷修復(fù)受損；E6 蛋白轉(zhuǎn)錄激活C-myc基因并與誘導(dǎo)COX-2 表達(dá)相關(guān)[14-15]。本研究中，HPV感染后可提高COX-2基因的表達(dá)。

PGE2是花生四烯酸在COX 作用下的產(chǎn)物之一，其過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、腫瘤血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，以及弱化宿主免疫功能，鄒余糧等[16]研究發(fā)現(xiàn)血清及組織PGE2含量與宮頸病變程度呈正相關(guān)，這與COX-2 蛋白生成增加或活性增強(qiáng)促進(jìn)PGE2表達(dá)有關(guān)。SALES 等[17]證實(shí)，COX-2 與PGE2受體在宮頸癌組織中表達(dá)同時(shí)上調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)COX-2表達(dá)與PGE2呈正相關(guān)。此外，HPV 感染陽(yáng)性宮頸病變組織血清PGE2含量高于HPV 感染陰性，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PGE2含量與HPV-DNA 載量呈正相關(guān)，HPV 感染如何促進(jìn)PGE2表達(dá)還有待進(jìn)一步研究。DEVA 等[18]在白色念珠菌中插入含HPV16 病毒序列，感染陰道上皮系統(tǒng)后促進(jìn)PGE2合成酶表達(dá)，從而提高PGE2表達(dá)。研究指出HPV16 E5 蛋白可通過(guò)COX-2 依賴途徑促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞PGE2受體EP4 表達(dá)[19]。

目前HPV 檢測(cè)已列入宮頸癌常規(guī)篩查中，但HPV 定量檢測(cè)存在爭(zhēng)議。EINSTEIN 等研究[20]指出在確診宮頸癌前，HPV 感染且高病毒載量，進(jìn)展為宮頸癌概率較低病毒載量者高30～60 倍。多種高危型HPV 病毒載量與宮頸癌前病變有關(guān)，研究表明[21]HPV16 病毒載量對(duì)宮頸癌病變預(yù)測(cè)最為重要，HPV 16感染者高病毒載量與CIN2+（CIN2 及以上病變）病變級(jí)別存在相關(guān)（）。HPV定量檢測(cè)對(duì)宮頸癌具有重要預(yù)測(cè)意義。本研究認(rèn)為，在已確定HPV 感染患者中進(jìn)行HPV 定量檢測(cè)具有必要性，同時(shí)COX-2 與PGE2等炎癥相關(guān)分子水平檢測(cè)亦有重要臨床指示作用。