梔子苷抗腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制研究*

孫源博，李桂芹，孫麗欣，王云楓，關(guān)利新，朱敏，贠捷

（牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院 1.腎內(nèi)科，2.影像科，黑龍江 牡丹江 157011；3.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腎內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150040）

腎間質(zhì)纖維化是終末期腎病的共同特點(diǎn)，在多種因素的作用下腎間質(zhì)細(xì)胞增多，纖維蛋白合成增加，基質(zhì)降解被抑制，細(xì)胞外基質(zhì)大量堆積，嚴(yán)重?fù)p傷腎臟細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腎功能降低、腎小管和腎小球的纖維化[1]。腎間質(zhì)纖維化程度能夠客觀地反映腎臟細(xì)胞和腎臟功能受損情況，腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，目前研究比較深入的是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor,TGF-β1）/Smad信號(hào)通路，該通路是腎間質(zhì)纖維化發(fā)病的核心，通路涉及多個(gè)環(huán)節(jié)，主要包括炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等[2]。

TGF-β 參與體內(nèi)多種生理病理過(guò)程，主要參與細(xì)胞存活、分化、遷移和黏附的調(diào)節(jié)。研究認(rèn)為，TGF-β1/Smad 信號(hào)傳導(dǎo)通路在TGF-β 發(fā)揮促纖維化過(guò)程中起著重要的作用[3-4]。目前研究發(fā)現(xiàn)，唯一的細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型受體底物是Smad 家族蛋白，它在TGF-β在細(xì)胞膜和受體結(jié)合直至細(xì)胞核完成信使傳導(dǎo)、上調(diào)或者下調(diào)靶基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程中起關(guān)鍵作用；且有研究發(fā)現(xiàn)不同類(lèi)型Smad 蛋白介導(dǎo)不同作用的TGF-β 信號(hào)傳導(dǎo)，其中Smad-2 蛋白是調(diào)節(jié)纖維化作用的關(guān)鍵蛋白[5-6]。

桅子為茜草科植物，臨床上常作為保肝利膽藥。梔子的主要有效成分為梔子苷，具有抗炎、抗氧化和抗糖尿病作用[7-9]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)梔子苷主要是通過(guò)抑制TLR/NF-κB/腫瘤壞死因子-α（TNF-α）活性發(fā)揮抗炎作用，楊奎等[10]對(duì)抑制大鼠腦出血后炎癥反應(yīng)從而減輕繼發(fā)性腦實(shí)質(zhì)損害的研究表明：中、高劑量梔子苷（15 和30 mg/kg）能降低血腫周?chē)X組織TNF-α 含量。NF-κB 存在于細(xì)胞質(zhì)中，與TGF-β1/Smad 信號(hào)有交聯(lián)。TGF-β1/Smad 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑激活是器官纖維化等疾病發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制，同時(shí)也是腎間質(zhì)纖維化主要和最終的共同通路[11]。故本研究以腎間質(zhì)纖維化大鼠模型為研究對(duì)象，從TGF-β1/Smad 信號(hào)通路及氧化應(yīng)激角度探討梔子苷對(duì)腎間質(zhì)纖維化的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與動(dòng)物

90%梔子苷（南京澤朗植提生物科技有限公司），白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）（Ab-9，cat：A7098）、超氧化物歧化酶（SOD）（Ab-33/37，cat：B7022-1）、丙二醛 （MDA）（Ab-124，cat：B0407）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D 公司，抗-Smad2 抗體[EP784Y]（Ab40855）和抗-TGF-β1抗體（Ab92486）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。清潔級(jí)健康SD大鼠（180～200 g），雌雄各半，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK（黑）2013-001。實(shí)驗(yàn)經(jīng)哈爾濱醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查并批準(zhǔn)。

1.2 腎間質(zhì)纖維化模型復(fù)制及分組

將40 只SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、正常大鼠灌胃組、模型組、30 mg/kg 和15 mg/kg 梔子苷組，每組8 只。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，模型復(fù)制前1 天禁食，自由飲水。參照徐志宏等[12]方法復(fù)制大鼠腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型，具體方法簡(jiǎn)述如下：10%水合氯醛（4 ml/kg）腹腔注射麻醉，待麻醉滿意后，大鼠固定于手術(shù)臺(tái)(右側(cè)臥位)。備皮區(qū)常規(guī)位于左肋下偏背部。碘伏消毒液 （4.5 g/L）按常規(guī)消毒術(shù)區(qū)3 遍，鋪無(wú)菌孔巾。手術(shù)切口選在左側(cè)肋腰點(diǎn)，無(wú)菌手術(shù)刀切開(kāi)皮膚，鈍性分離皮下組織及肌層，切開(kāi)腹膜，直至清楚暴露出左側(cè)腎臟組織，分離左側(cè)腎動(dòng)脈及左側(cè)輸尿管，然后7-0 絲線結(jié)扎腎下極及腎盞，無(wú)菌手術(shù)剪在線中間位置剪斷輸尿管。其中對(duì)照組大鼠僅分離出左側(cè)腎動(dòng)脈及左側(cè)輸尿管。復(fù)位腎臟，生理鹽水沖洗腹腔，逐層縫合手術(shù)切口，切口皮膚涂碘伏后貼無(wú)菌貼膜。從術(shù)后第1 天開(kāi)始灌胃給予不同劑量的梔子苷2 周。正常大鼠灌胃組予以15 mg/kg 梔子苷灌胃2 周。對(duì)照組和模型組給予同體積的生理鹽水灌胃2 周。

1.3 組織病理學(xué)觀察

取各組腎臟組織，10%中性甲醛固定后石蠟包埋，切片后進(jìn)行HE 染色和天狼星紅染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4 生化指標(biāo)測(cè)定

灌胃結(jié)束后，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清肌酐（serum creatinine,Scr）和血尿素氮（blood urea nitrogen,BUN），3 500 r/min 離心15 min 取上清液，按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定TNF-α、IL-1β、MDA和SOD 含量。

1.5 Western blotting 檢測(cè)腎臟組織TGF-β1 和Smad-2 蛋白表達(dá)

取腎臟組織100 mg，加入組織裂解液提取腎臟組織總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離，轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉室溫孵育2 h 后，加入一抗工作液，4℃過(guò)夜，TBS-T 緩沖液洗膜5 次，10 min/次，加入二抗工作液，室溫孵育1 h，TBS-T 洗膜5 次，10 min/次，采用ECL 法顯色。凝膠成像系統(tǒng)拍照并分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠腎組織病理學(xué)變化

對(duì)照組大鼠腎臟組織腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)纖維組織增生，無(wú)系膜細(xì)胞或者基質(zhì)組織增生；模型組腎小球基質(zhì)組織增生，鮑曼囊擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞腫脹、空泡樣變性、灶狀壞死、片狀萎縮，甚至可見(jiàn)上皮細(xì)胞壞死脫落于腎小管管腔內(nèi)。腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)，纖維組織增生，甚至呈片狀纖維化改變；給予30 或15 mg/kg 梔子苷后炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)少，腎小管排列較整齊，間質(zhì)纖維化面積??；正常大鼠灌胃組腎臟組織腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)清晰，腎間質(zhì)內(nèi)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)纖維組織增生。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化 （HE）

2.2 梔子苷對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠Scr 和BUN 的影響

各組大鼠Scr 和BUN 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，正常大鼠灌胃組Scr和BUN 水平與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型組大鼠Scr 和BUN 水平較對(duì)照組上升（P＜0.05），30 mg/kg 和15 mg/kg 梔子苷組大鼠Scr 和BUN水平與模型組比較呈劑量依賴性下降（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.3 梔子苷對(duì)腎間質(zhì)纖維化大鼠血清IL-1β、TNF-α、SOD 和MDA 含量的影響

各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、SOD 和MDA 含量的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較，正常大鼠灌胃組血清IL-1β、TNF-α、SOD 和MDA 與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），模型組與對(duì)照組比較，IL-1β、TNF-α、MDA 含量增加，SOD 含量減少（P＜0.05），30 mg/kg 和15mg/kg 梔子苷組與模型組比較，IL-1β、TNF-α、MDA 含量呈劑量依賴性減少，SOD 含量呈劑量依賴性增加（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠Scr 和BUN 水平的比較 （n=8，μmol/L，±s）

表1 各組大鼠Scr 和BUN 水平的比較 （n=8，μmol/L，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05

組別 Scr BUN對(duì)照組 29.451±2.238 5.449±1.324正常大鼠灌胃組 27.318±1.976 4.985±2.240模型組 50.236±5.8541） 15.316±1.1421）30 mg/kg 梔子苷組 34.529±3.3542） 10.116±1.1442）15 mg/kg 梔子苷組 40.126±4.5252） 12.219±1.0172）F 值 69.586 148.716 P 值 0.000 0.000

2.4 梔子苷對(duì)腎臟組織中TGF-β1 和Smad-2蛋白表達(dá)的影響

模型組腎臟組織中TGF-β1和Smad-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組增加（P＜0.05），30 mg/kg 和15mg/kg 梔子苷組TGF-β1、Smad-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量與模型組比較，呈劑量依賴性減少（P＜0.05），30 mg/kg 和15mg/kg梔子苷組大鼠腎臟組織中TGF-β1、Smad-2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3 和圖2。

表2 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、SOD 和MDA 含量的比較 （n=8，pg/ml，±s）

表2 各組大鼠血清IL-1β、TNF-α、SOD 和MDA 含量的比較 （n=8，pg/ml，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05

組別 IL-1β TNF-α SOD MDA對(duì)照組 129.236±12.132 30.589±5.153 80.129±3.732 0.918±0.135正常大鼠灌胃組 128.650±14.723 31.351±3.452 83.344±2.878 0.864±0.098模型組 1 160.214±63.1391） 52.816±3.1351） 55.049±4.3141） 4.318±0.1921）30 mg/kg 梔子苷組 880.625±56.3492） 37.866±4.1842） 73.713±4.3992） 2.113±0.3982）15 mg/kg 梔子苷組 949.602±85.1192） 42.622±4.3772） 65.821±5.8762） 3.273±0.2462）F 值 819.428 438.605 211.097 23.761 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1 和Smad-2 蛋白表達(dá)的比較 （n=8，±s）

表3 各組大鼠腎臟組織TGF-β1 和Smad-2 蛋白表達(dá)的比較 （n=8，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.05；2）與模型組比較，P＜0.05

組別 TGF-β1 Smad-2對(duì)照組 0.183 0±0.016 9 0.065 6±0.006 2模型組 0.811 6±0.056 41) 0.378 2±0.023 11)30 mg/kg 梔子苷組 0.340 5±0.032 31)2) 0.120 9±0.013 31)2)15 mg/kg 梔子苷組 0.401 9±0.039 41)2) 0.152 1±0.014 21)2)F 值 59.292 73.470 P 值 0.000 0.000

圖2 梔子苷對(duì)腎臟組織TGF-β1 和Smad-2 蛋白表達(dá)的影響

3 討論

腎間質(zhì)纖維化是由多種細(xì)胞事件、多個(gè)分子參與、多個(gè)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)和相互作用的結(jié)果，其主要病理特征包括間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖、細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度積聚、腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化等[13]。其中，腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化和腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的增殖是腎間質(zhì)纖維化的主要因素。本研究HE 染色和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示，腎間質(zhì)纖維化大鼠腎小球內(nèi)基質(zhì)增生、鮑曼囊擴(kuò)張，小管上皮細(xì)胞腫脹，小管空泡變性、灶狀壞死，片狀萎縮，管腔內(nèi)可見(jiàn)脫落壞死的上皮細(xì)胞，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞彌漫浸潤(rùn)，片狀纖維化；對(duì)照組和正常大鼠灌胃組組織病理學(xué)觀察腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)大致正常。上述形態(tài)學(xué)研究與相關(guān)文獻(xiàn)[14]報(bào)道一致，表明本實(shí)驗(yàn)采用的動(dòng)物模型復(fù)制方法可行且成功。給予梔子苷灌胃2 周后能夠改善炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和腎小管上皮細(xì)胞腫脹程度，降低間質(zhì)纖維化面積，經(jīng)組織染色可看出腎小管結(jié)構(gòu)清晰，管腔內(nèi)無(wú)變性壞死的細(xì)胞，除上述變化外亦可見(jiàn)管壁上皮細(xì)胞排列規(guī)則，無(wú)萎縮，腎間質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)纖維化表現(xiàn)。同時(shí)亦表明梔子苷抗腎間質(zhì)纖維化主要表現(xiàn)在腎小管上皮細(xì)胞。

DONNAHOO 等[15]研究發(fā)現(xiàn)TNF-α 可以直接誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡反應(yīng)，同時(shí)上調(diào)IL-1β 表達(dá)，這與筆者實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致，即模型組大鼠血清中TNF-α 和IL-1β 含量增加，梔子苷灌胃后大鼠血清中TNF-α 和IL-1β 含量降低，正常大鼠灌胃組和對(duì)照組上述指標(biāo)無(wú)變化，表明炎癥反應(yīng)參與腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，梔子苷通過(guò)減輕腎小管上皮細(xì)胞炎癥浸潤(rùn)程度及下調(diào)TNF-α 和IL-1β 表達(dá)水平，從而減輕單側(cè)輸尿管梗阻（UUO）所致大鼠腎臟炎癥反應(yīng)。30 或15 mg/kg 梔子苷灌胃后腎間質(zhì)纖維化大鼠血清中炎癥因子IL-1β 和TNF-α 含量均降低，且呈劑量依賴性降低，SOD 活性升高，且隨著梔子苷濃度的增加而升高，MDA 含量降低，表明梔子苷能夠通過(guò)降低氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)改善腎間質(zhì)纖維化。吳虹等[16]、LIU等[17]研究與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組血清中SOD 含量降低，MDA 含量增加，梔子苷灌胃后與模型組比較血清中SOD 含量增加，MDA 含量降低，正常大鼠灌胃組和對(duì)照組比較上述指標(biāo)無(wú)變化。SOD 是生物體內(nèi)清除氧自由基的最主要的物質(zhì)，可以阻斷并且對(duì)抗氧自由基對(duì)腎小管上皮細(xì)胞的損害及有可能修復(fù)已經(jīng)受損的腎小管上皮細(xì)胞，是觀察細(xì)胞損傷、修復(fù)的直觀指標(biāo)。結(jié)果表明梔子苷可以有效地提高UUO所致大鼠腎臟SOD 活力，增強(qiáng)抗氧化能力，修復(fù)受損腎小管上皮細(xì)胞，從而緩解腎間質(zhì)纖維化過(guò)程。MDA水平能夠間接反映腎小管上皮細(xì)胞受損程度，是過(guò)氧化反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的一種具有細(xì)胞毒性物質(zhì)。結(jié)果表明和模型組比較灌胃30 和15 mg/kg 梔子苷后MDA水平下降，說(shuō)明梔子苷能夠減輕UUO 所致腎小管上皮損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與李莎莎等[18]的結(jié)果相一致。

Scr 和BUN 是評(píng)估腎功能的2 個(gè)重要的指標(biāo)，肌酐是肌肉組織中肌酸的代謝終產(chǎn)物，尿素氮為蛋白代謝終產(chǎn)物，兩者均有腎臟代謝排出體外。本研究發(fā)現(xiàn)模型組Scr 和BUN 含量都增加，灌胃給予不同濃度的梔子苷后能夠降低Scr 和BUN 含量，對(duì)照組和正常大鼠灌胃組Scr 和BUN 指標(biāo)無(wú)差異。表明梔子苷改善腎間質(zhì)纖維化作用。

TGF-β1是關(guān)鍵的促腎間質(zhì)纖維化因子，其中TGF-β1是已知的最強(qiáng)的致纖維化細(xì)胞因子之一[19]，TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，Smad-2 途徑是公認(rèn)的、最重要的下游通路之一，是已知的唯一胞內(nèi)激酶受體底物[5-6]。TGF-β1/Smad-2 信號(hào)通路是腎臟纖維化核心通路。通過(guò)實(shí)驗(yàn)得知，相比對(duì)照組，模型組中大鼠腎臟TGF-β1及Smad-2 的表達(dá)增加，表明TGF-β1/Smad-2信號(hào)傳導(dǎo)通路參與UUO 所致腎間質(zhì)纖維化過(guò)程。與模型組中腎臟組織中TGF-β1表達(dá)和Smad-2 比較，給予不同濃度的梔子苷能夠降低TGF-β1和Smad-2 蛋白的表達(dá)，表明梔子苷能夠通過(guò)降低TGF-β1和Smad-2蛋白的表達(dá)，改善腎間質(zhì)纖維化。蘭天等[20]通過(guò)研究得出與本實(shí)驗(yàn)相類(lèi)似的結(jié)果。本研究結(jié)果顯示，灌胃30 和15 mg/kg 的梔子苷后大鼠腎臟組織中TGF-β1和Smad-2 蛋白表達(dá)無(wú)差異，為避免梔子苷對(duì)腎臟組織毒性，筆者未采取大劑量梔子苷進(jìn)行研究，本課題組將在進(jìn)行充分的細(xì)胞毒理性研究后根據(jù)劑量曲線進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究以腎間質(zhì)纖維化大鼠為研究對(duì)象，闡明梔子苷具有改善腎間質(zhì)纖維化作用，其可能機(jī)制與通過(guò)降低炎癥因子IL-1β 和TNF-α 釋放，減輕氧化應(yīng)激對(duì)腎臟組織損傷，以及降低TGF-β1和Smad-2 蛋白的表達(dá)有關(guān)。