表沒食子兒茶素沒食子酸酯對病毒性心肌炎小鼠的心肌保護作用

曾 閔, 陳 智, 易世江, 王野峰, 王 勛

(1. 湖南省兒童醫(yī)院 心血管內(nèi)科, 湖南 長沙, 410007; 2. 桂林醫(yī)學(xué)院, 廣西 桂林, 541001)

病毒性心肌炎是主要由嗜心肌性柯薩奇病毒感染引起的心臟病，其主要的病理表現(xiàn)為心肌的變性、壞死及炎性細(xì)胞的浸潤。該疾病致死率較高，臨床可表現(xiàn)為嚴(yán)重的心律失常、心源性休克甚至猝死[1]。目前該病的發(fā)病機制尚不明確，可能與氧化損傷、免疫損傷以及自噬有關(guān)[2-3]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)是綠茶茶多酚的主要活性成分，研究[4]顯示其具有抗病毒、抗腫瘤、抗炎及抗氧化等重要的作用。本研究探討EGCG對病毒性心肌炎是否具有保護作用，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

BALA/C雄性小鼠(SPF級)購自桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心，柯薩奇病毒V3(Nancy 株)購自桂林醫(yī)學(xué)院, EGCG(Sigma), 紫外分光光度儀(產(chǎn)地: 上海; 型號: ZF-7), 肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)試劑盒購自南京建成生物研究所。

1.2 實驗方法

選取45只雄性BALA/C小鼠, 6周齡，體質(zhì)量(21.00±1.80) g, 隨機分為正常組、對照組及EGCG組，每組15只。對照組、EGCG組小鼠腹部消毒后腹腔注射0.1 mL柯薩奇病毒B3(CVB3)病毒液。接種成功后, EGCG組予以EGCG 100 mg/(kg·d)灌胃處理，對照組予以同體積的生理鹽水灌胃。正常組小鼠腹腔注射同等體積生理鹽水。給藥持續(xù)10 d后摘除眼球并取血，檢測血清cTnT、CK-MB的水平。處死動物，取出小鼠心臟，吸水濾紙吸干水后，石蠟包埋，HE染色觀察心肌細(xì)胞及周圍組織變化情況。

1.3 心肌病理觀察及評分

將包埋的石蠟心臟組織標(biāo)本切片HE染色后，由2位有經(jīng)驗的醫(yī)生閱片，并依據(jù)參考文獻(xiàn)[1, 5], 根據(jù)各心臟切片細(xì)胞浸潤及心肌壞死百分比評估嚴(yán)重程度，其中0為無病變, +為<所累及心肌的25%;為25%～<50%;為50%～75%;為>75%。

1.4 ELISA檢測各組大鼠血清中CK-MB、cTnT的水平

眼球摘除取血后，置于血清管中，室溫下靜置4 h后, 3 000轉(zhuǎn)/min離心15 min, 吸取上清液，置于-80 ℃冰箱保存。cTnT、CK-MB活性的檢測按試劑說明書逐步操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0進行統(tǒng)計處理，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察

正常組小鼠飲食及生活習(xí)性無改變，精神良好; 實驗小鼠接種CVB3的1 d后出現(xiàn)萎靡不振、拒食、脫毛、毛色灰暗的現(xiàn)象。1周時，對照組小鼠死亡7只，病死率46.6%, EGCG組死亡5只，病死率33.3%, 而正常組無死亡。

2.2 各組小鼠心肌組織切片病理情況

正常組心肌細(xì)胞胞漿均勻，細(xì)胞形態(tài)好，排列規(guī)則，未見周圍炎性細(xì)胞浸潤; 實驗組可見心肌細(xì)胞死亡，大量炎性炎性細(xì)胞浸潤，細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞核消失，間質(zhì)可見纖維組織增生。EGCG組心肌細(xì)胞壞死數(shù)量明顯減少，僅有少量炎性細(xì)胞浸潤，較對照組明顯好轉(zhuǎn)。見表1。

表1 3組小鼠心肌病理評分比較 分

與正常組比較, *P<0.05; 與對照組比較, #P<0.05。

2.3 各組小鼠血清中CK-MB、cTnT水平的比較

正常組中血清CK-MB的水平顯著低于對照組及EGCG組(P<0.01), EGCG組中CK-MB的活性水平較對照組的水平顯著降低(P<0.05); cTnT在正常組中幾乎檢測不到，而對照組、EGCG組cTnT的表達(dá)顯著增高(P<0.01), 但EGCG組cTnT的活性水平顯著低于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 小鼠血清中CK-MB、cTnT水平比較

cTnT: 心肌肌鈣蛋白T; CK-MB: 肌酸激酶同工酶。

與正常組比較, **P<0.01; 與對照組比較, #P<0.05。

3 討 論

兒茶素是綠茶中主要的多酚類化合物，包括表沒食子兒茶素3-沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素3-沒食子酸酯和表沒食子酸酯、沒食子兒茶素和沒食子兒茶素沒食子酸酯。EGCG是綠茶中最主要的兒茶素[4]。研究[5-7]顯示，EGCG具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗菌的作用。進一步的研究[8-12]發(fā)現(xiàn)，EGCG還具有抗流感病毒、乙肝病毒、腺病毒及EB病毒等多種病毒的作用，其機制與抑制病毒的復(fù)制有關(guān)。本研究將CVB3接種于小鼠，成功建立病毒性心肌炎，分別用生理鹽水或EGCG灌胃處理，發(fā)現(xiàn)與對照組相比, EGCG組小鼠的成活率顯著更高，提示EGCG對柯薩奇病毒具有一定的抑制作用。

cTnT是診斷心肌損傷的一個敏感性指標(biāo)[13]。有臨床研究[14]顯示, cTnT聯(lián)合CK-MB用于診斷病毒性心肌炎具有較高的敏感度和特異度。有研究[15]顯示, EGCG可通過抑制病毒復(fù)制而改善CVB3誘導(dǎo)的心肌炎。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常組對比，對照組CK-MB、cTnT的活性水平明顯升高，提示CVB3能夠?qū)е滦募p傷。EGCG組CK-MB、cTnT的活性水平均較對照組降低，提示EGCG對病毒性心肌炎亦具有一定的保護作用。

綜上所述, EGCG對病毒性小鼠心肌炎具有一定的保護作用，并能降低血清cTnT、CK-MB的活性水平，這為EGCG在病毒性心肌炎治療中的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。