基于1H-NMR的原發(fā)性肝癌脾虛濕盛證患者尿液代謝組學(xué)研究

王 東 李晶潔

代謝組學(xué)(metabonomics) 是研究生物體代謝活動中產(chǎn)生不同的內(nèi)源性代謝物質(zhì)，以探究機(jī)體整體性代謝變化情況及代謝途徑的一門新興學(xué)科。代謝組學(xué)的出現(xiàn)為生命科學(xué)的發(fā)展提供了有力的現(xiàn)代化實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，通過質(zhì)譜、色譜、核磁共振等化學(xué)分析技術(shù)，分析不同時(shí)期或不同狀態(tài)下內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的比例、濃度及代謝通量等變化，以找到與疾病診斷相關(guān)的標(biāo)志性代謝物[1]。近年來代謝組學(xué)用于中醫(yī)證型的研究取得了一定的進(jìn)展，為中醫(yī)病因病機(jī)、中醫(yī)證型等許多方面提供微觀指標(biāo)的量化[2]，使中醫(yī)辨證客觀化目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)成為可能。同時(shí)，代謝組學(xué)技術(shù)不失為探尋腫瘤中醫(yī)證候物質(zhì)基礎(chǔ)的較適宜的手段，本研究通過采用核磁共振氫譜檢測，用代謝組學(xué)方法來探討新疆原發(fā)性肝癌脾虛濕盛證患者的病機(jī)及特異性代謝標(biāo)志物，以闡述脾虛濕盛證及非脾虛濕盛證肝癌患者體內(nèi)主要代謝特征及其差異，探討肝癌脾虛濕盛證的客觀物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院住院治療的35例脾虛濕盛證肝癌患者作為脾虛濕盛證組，35例非脾虛濕盛證肝癌患者作為非脾虛濕盛證組，以上患者符合原發(fā)性肝癌西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn)，且以原發(fā)性肝癌為第一診斷，及新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院體檢中心體檢的40例和平質(zhì)健康體檢者作為對照組，其中肝癌患者符合以下診斷標(biāo)準(zhǔn)及納入標(biāo)準(zhǔn)，脾虛濕盛證患者符合以下中醫(yī)證型診斷依據(jù)。三組樣本基礎(chǔ)信息見表1。

表1 三組樣本基礎(chǔ)信息

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

原發(fā)性肝癌診斷采用第八屆全國肝癌學(xué)術(shù)會議上通過的《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》[3]，所有患者均經(jīng)組織學(xué)檢查證實(shí)為原發(fā)性肝癌者；中醫(yī)脾虛濕盛證診斷參照國家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《中醫(yī)證候辨治規(guī)范》及《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[4]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn)

①年齡>18歲；②所有納入對象均自愿參與研究并簽署知情同意書；③排除有精神障礙或嚴(yán)重心腦血管疾病者；④排除合并有活動性結(jié)核或嚴(yán)重感染性疾病患者;⑤排除妊娠期或哺乳期婦女。

1.4 檢測方法

標(biāo)本收集與處理：于患者入院后第二天清晨空腹采集中段尿液，并于4 ℃，3 500 r/min離心10 min，取上清液，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。待全部尿液收集完成后，將樣品從低溫冰箱中取出并在室溫中解凍，?00 μl尿液置離心管中，加入200 μl磷酸緩沖液(0.2 mol/l Na2HPO4～0.2 mol/l NaH2PO4，pH 7.4，用重水配制)，靜置20 min后4 ℃,3 500 r/min離心10 min，取上清液500 μl移入5 mm核磁管中，進(jìn)行核磁共振氫譜檢測(proton nuclear magnetic resonance spectroscopy，1H-NMR)。

1H-NMR檢測：首先對尿樣采用有預(yù)飽和的1D NOESY脈沖序列，把參數(shù)設(shè)置如下：譜寬8000 Hz、混合時(shí)間0.15 s、馳豫延遲時(shí)間2 s、采樣點(diǎn)數(shù)64 k，累加次數(shù)64次；在混合時(shí)間及馳豫延遲時(shí)間里采用預(yù)飽和方式以抑制水峰，偏置頻率設(shè)置在水峰的位置。FID信號通過處理后經(jīng)傅立葉變換轉(zhuǎn)化為NMR圖譜，所得NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行相位調(diào)整和基線校正后，對δ0.4～9.4范圍內(nèi)的譜圖按每段δ0.01的寬度進(jìn)行分段積分，積分后的數(shù)據(jù)按每張譜的總積分強(qiáng)度歸一化，所得數(shù)據(jù)輸出并轉(zhuǎn)換到Excel文件保存。將Excel格式數(shù)據(jù)輸入到SIMCA-P 10.0軟件(瑞典，Umetrics,Umea)進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

1H-NMR圖譜進(jìn)行基線校正和相位校正后檢測，數(shù)據(jù)采用平均中心化(mean centering)或Pareto標(biāo)度化(paretoscaling)進(jìn)行預(yù)處理，再綜合采用多變量統(tǒng)計(jì)學(xué)方法中主成分分析(principal component analysis，PCA) 、偏最小二乘判別分析(partial least square discriminant analysis，PLS-DA) 及單變量統(tǒng)計(jì)分析方法測定相關(guān)代謝標(biāo)志物的含量。對各組患者尿液NMR譜圖中檢測到的代謝產(chǎn)物的峰面積進(jìn)行雙尾Welch's t test分析，以P<0.05為兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以下結(jié)果中數(shù)值為代謝產(chǎn)物色譜峰的相對強(qiáng)度，將譜圖按0.0lppm分段積分后，以每張譜總積分值為10000進(jìn)行歸一化，同一譜峰積分合并后計(jì)算其所對應(yīng)代謝產(chǎn)物的(mean±SD)。

2 結(jié)果

原發(fā)性肝癌患者尿中與機(jī)體能量代謝密切相關(guān)的肌酐含量顯著較對照組健康人低(P<0.01)，且脾虛濕盛證組低于非脾虛濕盛證組(P<0.05)；而?；撬岬暮匡@著高于對照組,且脾虛濕盛證組高于非脾虛濕盛證組(P<0.05)。與對照組相比肝癌患者尿中的馬尿酸、氧化三甲胺(TMAO)含量下降，且脾虛濕盛證組明顯低于非脾虛濕盛證組(P<0.05)。三梭酸循環(huán)的中間產(chǎn)物--檸檬酸，在肝癌患者尿中含量也明顯低于對照組，而琥珀酸高于對照組，兩者在脾虛濕盛證組與非脾虛濕盛證組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。原發(fā)性肝癌患者尿中乙酸含量顯著性高于對照組(P<0.05)，而在脾虛濕盛證組與非脾虛濕盛證組中比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。肝癌患者尿中丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸含量均較對照組低，且脾虛濕盛證組低于非脾虛濕盛證組(P<0.05)。 需要指出的是，以下數(shù)值為代謝產(chǎn)物色譜峰的相對強(qiáng)度，各組尿中代謝物含量變化具體見表2。

表2 各組尿樣代謝物水平變化情況

注：與對照組比較，#為P<0.05；與非脾虛濕盛證組比較，*為P<0.05。

3 討論

我們在臨床上對新疆大量肝癌患者的臨床診治中，發(fā)現(xiàn)肝癌的主要病機(jī)是脾胃受損，釀生內(nèi)濕，導(dǎo)致肝癌的正虛主要是脾虛，實(shí)邪主要是濕邪，這可能跟新疆地區(qū)人們的生活習(xí)慣有關(guān)[5]，新疆人恣飲烈酒，喜食膏粱厚味，口味重而多咸，這種飲食習(xí)俗容易損傷脾胃，釀生濕痰。明代《景岳全書》說：“酷飲無度，傷于酒濕，或以縱食生冷，敗其真陽”脾胃損傷濕邪易侵，導(dǎo)致脾胃運(yùn)化失職，脾虛容易駐濕，駐濕又會加重脾虛[6]，出現(xiàn)不停的惡性循環(huán)。其中脾虛是濕盛的原因，又是濕盛的結(jié)果，濕邪阻滯臟腑經(jīng)絡(luò)，易變生為癥瘕、瘀阻、積聚[7]。臨床流行病學(xué)調(diào)查研究也表明：肝癌早、中、晚期不同階段，常見有脾虛濕盛證患者。潘敏求等[8]采用頻數(shù)和排序等統(tǒng)計(jì)分析253篇中醫(yī)藥治療原發(fā)性肝癌的文獻(xiàn)，結(jié)果表明脾虛濕困出現(xiàn)頻率為79.07%，是中醫(yī)臨床辨證最常見的證型之一。凌昌全教授小組研究發(fā)現(xiàn)[9]，臨床肝癌Ⅱ、Ⅲ期肝膽濕熱、脾虛濕阻證候出現(xiàn)率較高，健脾化濕排毒是常用治療大法。這些研究均說明脾虛濕盛是肝癌的主要病機(jī),并貫穿于疾病的始終。本研究就選用新疆地區(qū)的原發(fā)性肝癌脾虛濕盛證患者作為研究對象，通過對患者尿液代謝組學(xué)研究，以探討新疆原發(fā)性肝癌脾虛濕盛證患者的病機(jī)及特異性代謝標(biāo)志物，以探尋腫瘤中醫(yī)證候物質(zhì)基礎(chǔ)及使中醫(yī)辨證客觀化目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)成為可能。

代謝組學(xué)是1999 年由英國Nicholson教授及其同事提出的[10-11]，是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)之后近年來發(fā)展起來的一門新興學(xué)科，通過對各種常見生物體內(nèi)生物體液和組織代謝物進(jìn)行檢定和分析，把機(jī)體的代謝信息與病理生理過程相關(guān)聯(lián)起來，以揭示機(jī)體的代謝本質(zhì)及研究機(jī)體整體與全局[12]。目前代謝組學(xué)發(fā)展趨勢用于輔助疾病的診斷與分型，如對冠心病診斷、腫瘤機(jī)制、藥物的肝毒等方面的研究[13]。羅氏等[14]研究，對肝郁脾虛模型大鼠的血漿進(jìn)行超導(dǎo)傅立葉變化核磁共振波譜儀檢測，分析其代謝物的共性及生物標(biāo)記物的主成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝郁脾虛證組大鼠的血漿乳酸、醋酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和部分未知化合物的譜峰峰形改變較其他組明顯，且隨著時(shí)間的不同，代謝物譜峰也有差異，提示通過代謝組學(xué)可找到與中醫(yī)證型相關(guān)聯(lián)的生物學(xué)基礎(chǔ)。Li等[15]通過MNR 技術(shù)對氣虛血瘀證模型鼠的尿液代謝物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)模型組的甲酸鹽、肌酐等產(chǎn)物與正常組相比存有差異。動物實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)不同證型大鼠血漿代謝譜之間存在差異[16]。

本研究對比了原發(fā)性肝癌患者與健康人，原發(fā)性肝癌脾虛濕盛證患者與非脾虛濕盛證患者的肌酐、?；撬帷幟仕?、馬尿酸、琥珀酸、氧化三甲胺(TMAO)、乙酸、丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸等含量。其中肌酐與機(jī)體能量代謝密切相關(guān)，在原發(fā)性肝癌患者尿中肌酐含量顯著較對照組健康人低(P<0.01)，且脾虛濕盛證組低于非脾虛濕盛證組(P<0.05)，脾虛濕盛證患者尿液肌酐含量的減少也提示了其整體代謝水平低下。?；撬崾悄懼猁}的重要組成部分，主要參與脂肪的消化過程，?；撬崴降奈蓙y可能與機(jī)體脂質(zhì)代謝失調(diào)有關(guān)，有研究稱?；撬峥勺鰹楦斡不嚓P(guān)的代謝標(biāo)記物之一[17]，在本研究中原發(fā)性肝癌患者的?；撬崴斤@著高于對照組,且脾虛濕盛證組高于非脾虛濕盛證組(P<0.05)，其提示脂類代謝水平紊亂。馬尿酸是腸道菌群產(chǎn)生的腐敗產(chǎn)物，而氧化三甲胺也與腸道菌群代謝有關(guān)[18]。正常情況下，腸道菌群可刺激宿主免疫功能，幫助宿主防御疾病，協(xié)助宿主消化吸收,當(dāng)腸道菌群失調(diào)時(shí)，人就會出現(xiàn)腹瀉、便秘、消化不良等癥狀，而馬尿酸、氧化三甲胺含量的異?？煞从郴颊吣c道微生物菌群的失調(diào)[19]。本研究中，肝癌患者尿中的馬尿酸、氧化三甲胺(TMAO)含量比對照組下降，且脾虛濕盛證組明顯低于非脾虛濕盛證組(P<0.05)。這與該證型臨床多表現(xiàn)為便溏、腹瀉的證候相一致。同時(shí)檸檬酸、琥珀酸作為三梭酸循環(huán)的中間產(chǎn)物，對于機(jī)體物質(zhì)代謝產(chǎn)生重要作用,三梭酸循環(huán)是糖類、脂類、氨基酸的最終代謝通路，是機(jī)體獲得能量的主要方式，肝癌患者尿中檸檬酸含量明顯低于健康人群，而琥珀酸高于健康人群，兩者在脾虛濕盛證組與非脾虛濕盛證組比較，差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此可見，脾虛濕盛證肝癌患者出現(xiàn)糖代謝紊亂。另外，丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸在生物體內(nèi)的蛋白質(zhì)代謝過程中占重要地位，參與生物中的許多重要化學(xué)反應(yīng)[20]，而肝臟是體內(nèi)氨基酸代謝的主要場所，當(dāng)肝臟由于各種原因損傷時(shí)，可導(dǎo)致體內(nèi)發(fā)生復(fù)雜的代謝紊亂，肝細(xì)胞內(nèi)氨基酸代謝降低[21]。本研究中原發(fā)性肝癌患者尿中丙氨酸、亮氨酸、谷氨酸含量均較對照組低，且脾虛濕盛證組患者較非脾虛濕盛證低，提示肝癌患者尤其是脾虛濕盛證肝癌患者氨基酸分解代謝水平低下，蛋白合成不足。同時(shí)谷氨酸代謝異常易導(dǎo)致出現(xiàn)中樞疲勞，而脾虛濕盛證患者的尿液中谷氨酸含量降低，與該證型患者出現(xiàn)神疲懶言、體倦乏力的臨床表現(xiàn)相一致。綜上所述，對脾虛濕盛證肝癌患者尿液代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者存在糖代謝、脂類代謝、氨基酸分解代謝紊亂，且原發(fā)性肝癌脾虛濕盛證患者體內(nèi)多種生命代謝的紊亂程度較非脾虛濕盛證患者嚴(yán)重。