PMA-qPCR技術(shù)在發(fā)酵食品活菌計(jì)數(shù)中的應(yīng)用

陳卓君，魏銘，林果，陳昱锜，梁杉，張柏林，朱保慶*

1(林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083) 2(中糧營養(yǎng)健康研究院，北京，102209) 3(北京工商大學(xué),北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京，100048)

發(fā)酵食品是以農(nóng)產(chǎn)品、林產(chǎn)品和畜產(chǎn)品等為原料，利用微生物(不包含食品中直接加入的有益微生物)發(fā)酵而成的一類特殊食品。發(fā)酵食品最初是以延長食品保質(zhì)期、拓展食品在不同季節(jié)的可食性為目的；因其具有獨(dú)特的風(fēng)味和豐富的營養(yǎng)價值，近年越來越受到消費(fèi)者的歡迎[1]。微生物作為發(fā)酵食品的“靈魂”，與發(fā)酵食品的品質(zhì)直接相關(guān)，在提高產(chǎn)品貯藏期、富集功能因子和保障安全等方面都發(fā)揮著不可替代的作用[2]。因此，準(zhǔn)確計(jì)數(shù)發(fā)酵食品中的不同微生物，是研究發(fā)酵食品品質(zhì)形成機(jī)理以及工藝改進(jìn)和產(chǎn)品質(zhì)量控制的基礎(chǔ)。

傳統(tǒng)的微生物計(jì)數(shù)方法為菌落計(jì)數(shù)法，該方法易受主觀影響，繁瑣復(fù)雜，耗時耗力，存在較大誤差，既無法區(qū)分“可生存但不可培養(yǎng)”(viable but non-culturable,VBNC)狀態(tài)下細(xì)胞也無法對復(fù)雜菌系中的單一菌種進(jìn)行有效定量。隨著現(xiàn)代分子生物技術(shù)的發(fā)展，高靈敏度和特異性的實(shí)時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR，qPCR)也被開發(fā)用于發(fā)酵食品的微生物計(jì)數(shù)[3]，該方法的主要缺陷在于難以區(qū)分死菌和活菌，使得死菌中存留的大量DNA也可被擴(kuò)增，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果出現(xiàn)偏差[4]。近年來出現(xiàn)的疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)偶聯(lián)qPCR技術(shù)，可以有效避免常規(guī)qPCR的缺陷，也可檢測VBNC狀態(tài)的微生物。目前，該技術(shù)在發(fā)酵食品中已被用于多種發(fā)酵常見微生物的計(jì)數(shù)。本文系統(tǒng)地綜述了PMA-qPCR技術(shù)的原理、影響因素及在常見發(fā)酵食品中應(yīng)用現(xiàn)狀，同時提出了該技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展和拓展應(yīng)用的展望。

1 PMA-qPCR方法介紹

1.1 實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)原理及特點(diǎn)

qPCR是在標(biāo)準(zhǔn)PCR技術(shù)基礎(chǔ)上，使用熒光報(bào)告基團(tuán)(包括雙鏈DNA結(jié)合染料或在擴(kuò)增過程中摻入PCR產(chǎn)物的、與PCR引物或探針結(jié)合的染料分子)進(jìn)行DNA擴(kuò)增，利用具有熱循環(huán)功能及熒光染料篩查能力的儀器，每次循環(huán)結(jié)束后通過熒光染料檢測DNA含量，熒光染料產(chǎn)生的熒光信號與生成的PCR產(chǎn)物分子(擴(kuò)增片段) 數(shù)成正比。利用反應(yīng)指數(shù)期采集的數(shù)據(jù)，生成有關(guān)擴(kuò)增靶點(diǎn)起始量的精度極高的定量信息。與傳統(tǒng)PCR相比，熒光定量PCR具有特異性更強(qiáng)、靈敏度更高、檢測周期更短、自動化程度高等特點(diǎn)。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)在微生物計(jì)數(shù)方面得到了廣泛的應(yīng)用[5]。然而微生物在自然環(huán)境中以多種生理狀態(tài)存在：可培養(yǎng)的活菌，活的非可培養(yǎng)狀態(tài)，具有完整結(jié)構(gòu)但無生物活性的死菌以及膜損傷死菌。qPCR技術(shù)雖能克服傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法無法檢測VBNC狀態(tài)下細(xì)胞的缺陷，但無法區(qū)分死活菌DNA，這對活菌計(jì)數(shù)帶來巨大的挑戰(zhàn)[6]。

1.2 PMA-qPCR檢測活菌的機(jī)理

膜損傷細(xì)胞沒有代謝活性，適宜條件下培養(yǎng)難以恢復(fù)生長，因此將膜完整性作為評判活菌標(biāo)準(zhǔn)已被多數(shù)學(xué)者接受[7]。基于活菌定量條件，疊氮溴化丙錠(propidiummonoazide，PMA)常被用于qPCR的前處理步驟[8]，待測菌與適宜濃度PMA避光條件下孵育一定時間，經(jīng)光鈍化后即可提取活菌DNA。

PMA是一種具有高親和力的光敏性DNA結(jié)合染料，如圖1所示，該染料自身熒光弱，與核酸結(jié)合后熒光信號大大增強(qiáng)。在DNA提取之前將PMA與待測樣品混合，PMA會選擇性的進(jìn)入膜損傷細(xì)胞并嵌入雙鏈DNA結(jié)構(gòu)中，每分子染料可與4～5個核苷酸相結(jié)合。在可見光(最大吸收峰為464 nm)作用下，PMA分子中疊氮基團(tuán)分解產(chǎn)生高活性的氮烯類化合物，與DNA分子發(fā)生共價交聯(lián)反應(yīng)生成沉淀，進(jìn)而抑制膜損傷細(xì)胞qPCR過程中DNA的擴(kuò)增。溶液中殘留的過量染料與水分子經(jīng)光照反應(yīng)生成羥胺化合物，進(jìn)而失去交聯(lián)活性，不會影響后續(xù)活細(xì)胞DNA擴(kuò)增[8]。利用PMA選擇滲透性和qPCR特異性，能夠顯著提高檢測速度和靈敏度。

圖1 PMA與DNA反應(yīng)原理示意圖[9]Fig.1 Schematic diagram for the reaction bewteen PMA and DNA

2 影響PMA-qPCR檢測效率的因素

2.1 目標(biāo)微生物

表1匯總了利用qPCR對常見發(fā)酵微生物計(jì)數(shù)的目的基因、引物序列等信息，諸多學(xué)者針對實(shí)驗(yàn)菌株會選擇不同目的基因，細(xì)菌通常采用16S rDNA編碼基因，而26S rDNA及ITS編碼基因常用于酵母的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)。

表1 不同微生物qPCR檢測目的基因的選取及引物列表Table 1 Selected genes and related primers used in qPCR for different microorganisms

續(xù)表1

微生物 引物 目的基因 擴(kuò)增長度/bp引物序列(5’-3’) 參考文獻(xiàn)Tet_R107AATCAACACCAACCGAGAATCC[38]真菌ITS1qITS2ITS1-5.8SrDNA-ITS2290TCCGTAGGTGAACCTGCGGTTYGCTGYGTTCTTCATCG[16] [17]酵母YEAST-F26S rDNA124GAGTCGAGTTGTTTGGGAATGC[18]YEAST-RTCTCTTTCCAAAGTTCTTTTCATCTTT[18]釀酒酵母CESP-FSCER-RITS2 和5.8S rDNA175ATCGAATTTTTGAACGCACATTGCGCAGAGAAACCTCTCTTTGGA[18][18]布魯氏酒香酵母DekITSITS308GACACGTGGAATAAGCAAGG[24]BruxITRATTATCCCCTCACTCCCCTC[24]葡萄有孢漢生酵母CESP-FHUV-RITS2和5.8S rDNA121ATCGAATTTTTGAACGCACATTGAACCCTGAGTATCGCCCACA[24][24]釀酒酵母SC1dSC1rRAPD bands301ACATATGAAGTATGTTTCTATATA-ACGGTGTGGTGCTGGTGCGGATCTA[18][18]

研究表明[10]，對不同微生物進(jìn)行PMA處理時應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化時，目標(biāo)菌種不同(特別是革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)差異)可能對DNA活性染料效果有很大影響。革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁含有外膜，而革蘭氏陽性菌主要為肽聚糖層[4]，這種差異使PMA可以更快滲透入膜損傷的革蘭氏陰性菌，如果兩種細(xì)菌存在于同一環(huán)境樣本中，最終可能產(chǎn)生群落定量偏差[11]。值得指出的是，現(xiàn)階段研究多針對于細(xì)菌，對真菌和病毒的描述較少。同時為了正確地描述食品生態(tài)系統(tǒng)中的微生物種群，需要考慮的重要因素之一是待擴(kuò)區(qū)域的選擇。目標(biāo)基因必須有2個基本特征: (1)存在于待檢測的微生物組的所有成員中；(2)具有可設(shè)計(jì)通用引物的保守區(qū)域和可分化的可變區(qū)域[12]。針對目的基因進(jìn)行正確的引物設(shè)計(jì)也至關(guān)重要，LAI等[13]基于內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔基因和23S rDNA基因，設(shè)計(jì)了格氏乳桿菌(Lactobacillusgasseri)和唾液乳桿菌(Lactobacillussalivarius)特異性引物，從而可以有效計(jì)數(shù)益生菌產(chǎn)品中兩種乳酸菌活細(xì)胞值。

2.2 PMA處理?xiàng)l件

除待測菌自身差異外，PMA處理?xiàng)l件也是影響擴(kuò)增效果的重要因素，關(guān)鍵點(diǎn)包括：PMA濃度、暗反應(yīng)時間、光反應(yīng)時間[14-19]，三者需要針對反應(yīng)體系進(jìn)行平衡優(yōu)化(表2)。

PMA濃度應(yīng)以能夠最大程度抑制死菌，同時不影響活菌的后續(xù)定量為先決條件。TANTIKACHORNKIAT等[20]在研究中推測PMA的最佳濃度可能與細(xì)胞密度有關(guān)：細(xì)胞密度越高，則需要更高的PMA濃度才能有效抑制死菌DNA的擴(kuò)增。有研究表明密度處于106～107CFU/mL的酵母和密度近似108CFU/mL的細(xì)菌得到準(zhǔn)確定量結(jié)果的條件均為6 μmol/L PMA。

表2 針對不同微生物PMA處理?xiàng)l件優(yōu)化Table 2 The optimal conditions of the PMA treatments for different microorganisms

暗反應(yīng)時間的長短決定了PMA嵌入DNA的充分程度，嵌入DNA的PMA在強(qiáng)光照射下與DNA共價交聯(lián)，未反應(yīng)PMA則被鈍化，光反應(yīng)時間決定后續(xù)活菌DNA擴(kuò)增效率。ANDORR等[21]測定釀酒酵母時發(fā)現(xiàn)使用6 μmol/L PMA處理樣品，進(jìn)行10 min暗反應(yīng)后采用兩次相隔1 min的30秒曝光方法定量結(jié)果更為準(zhǔn)確。SHAO等[22]使用了20 μmol/L PMA進(jìn)行20 min光鈍化，可有效檢測德氏乳桿菌(Lactobacillusdelbrueckiissp.)是否進(jìn)入VBNC狀態(tài)，這與NOCKER等[8]針對純凈環(huán)境培養(yǎng)細(xì)菌優(yōu)化后的處理?xiàng)l件有所不同。

3 PMA-qPCR計(jì)數(shù)在發(fā)酵食品中的應(yīng)用

3.1 酒

釀酒是一種復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)過程，受到多種微生物和環(huán)境因素的影響，如何對酒樣中微生物定性定量，對工藝控制及成品酒貯存至關(guān)重要。現(xiàn)階段以此方法進(jìn)行酒類研究較少，主要集中于葡萄酒。釀造中，隨著主要發(fā)酵產(chǎn)物乙醇濃度的增加，酒樣中細(xì)胞的膜流動性受到影響，對膜蛋白產(chǎn)生毒性，從而抑制細(xì)胞生長甚至導(dǎo)致死亡[23]。ANDORR[21]推測，發(fā)酵過程中高濃度酒精導(dǎo)致死菌大規(guī)模的出現(xiàn)，可能會對活菌定量產(chǎn)生影響；在實(shí)驗(yàn)中添加106個/mL膜損傷菌進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，過量死亡細(xì)胞的存在并未干擾到菌群密度為103～107CFU/mL酵母菌的計(jì)數(shù)結(jié)果。將優(yōu)化后的PMA處理?xiàng)l件用于發(fā)酵酒及陳釀酒中總酵母、釀酒酵母、非釀酒酵母和腐敗酵母的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同生理狀態(tài)下酵母均可被快速定量。同時在不同葡萄酒酒樣中利用Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對微生物進(jìn)行計(jì)數(shù)時，應(yīng)考慮基質(zhì)的影響。RIZZOTTI等[24]在檢測10種葡萄酒中酵母、乳酸菌及醋酸菌密度時，針對不同基質(zhì)制作了相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，大幅降低環(huán)境因素對結(jié)果的影響。

PMA-qPCR技術(shù)在其他酒類中也有應(yīng)用，VENDRAME等[25]以布魯氏酒香酵母(Brettanomycesbruxellensis)為目標(biāo)菌株，建立起了一套能夠在9 h快速檢測酒樣中是否存在腐敗酵母的方法，檢測限在紅酒、白酒、啤酒中分別為0.83、0.63、0.23 lg CFU/mL。中國傳統(tǒng)真菌發(fā)酵米酒中，LV[26]優(yōu)化了對于釀酒酵母(S.cerevisiae)，植物乳桿菌(L.plantarum)和紫紅曲霉((M.purpureus)的PMA處理?xiàng)l件，同時對qPCR、PMA-qPCR、RT-qPCR處理結(jié)果進(jìn)行了對比，發(fā)現(xiàn)PMA-qPCR與傳統(tǒng)計(jì)數(shù)方法最為擬合，同時檢測限較低，據(jù)此建立了監(jiān)控米酒發(fā)酵過程中整體菌群動態(tài)變化的高效途徑。

3.2 發(fā)酵乳

發(fā)酵乳是乳和乳制品在發(fā)酵菌的作用下發(fā)酵而成的酸性凝乳狀制品，主要包括酸奶、奶酪及開菲爾等。發(fā)酵乳常被用于引入除發(fā)酵劑外益生菌的載體，益生菌是一種通過改善腸道微生物平衡從而對宿主施加有益影響的微生物添加物，乳桿菌和雙歧桿菌是發(fā)酵乳生產(chǎn)中常使用的兩種益生菌，用于改進(jìn)發(fā)酵乳的口感、質(zhì)地等感官特性，增強(qiáng)發(fā)酵乳的健康性能[27]。國際食品法典標(biāo)準(zhǔn)發(fā)酵乳卷[28](CODEX STAN 243—2003) 中規(guī)定在最低保質(zhì)期內(nèi)發(fā)酵乳中發(fā)酵微生物應(yīng)是大量存活的，在除了用于發(fā)酵的特定發(fā)酵劑之外，發(fā)酵乳中微生物的計(jì)數(shù)至少要有106CFU /g。所以在發(fā)酵乳的生產(chǎn)和保存中微生物的存活率有直接影響。

3.2.1 酸奶

酸奶主要是以新鮮牛乳為原料，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵形成的風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富的功能性乳制品。酸奶是益生菌最常見且經(jīng)濟(jì)的載體，在傳統(tǒng)發(fā)酵劑基礎(chǔ)上，發(fā)展益生菌酸奶可有效解決耐藥菌株問題，同時滿足人民對健康食品的不斷需求[29]。以混合菌株作為發(fā)酵劑是增強(qiáng)酸奶益生性的較優(yōu)方法，GARCA-CAYUELA等[30]利用PMA-qPCR檢測了貨架期內(nèi)(28 d)及超出貨架期30和60 d的酸奶樣品中種水平上嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus)STY-31、德氏乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillusdelbrueckiisubsp. bulgaricus)LBY-27、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)LA-5、干酪乳桿菌干酪亞種(Lactobacilluscaseisubsp.casei)LC-01 和雙歧桿菌(Bifidobacteriumlactis)BB-12的動態(tài)變化；結(jié)果發(fā)現(xiàn), PMA-qPCR可以在設(shè)計(jì)了種間特異性引物的基礎(chǔ)上，在復(fù)雜微生物環(huán)境條件中做到105CFU/mL菌濃度檢測范圍內(nèi)的簡單快速計(jì)數(shù)，實(shí)驗(yàn)中不會出現(xiàn)交叉污染現(xiàn)象，菌株的生存能力在貨架期后才會減弱。目的基因的選擇與特異性引物的設(shè)計(jì)在定量微生物方法中的重要性也被SCARIOT等[31]進(jìn)一步證實(shí)，利用PMA-qPCR檢測副干酪乳桿菌(L.paracasei)ATCC 10746的tuf基因，觀察其在純凈環(huán)境和酸奶發(fā)酵過程中的生存狀況，得到不同基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)曲線平均效率為94%和96% (R2> 0.98)，兩個樣本的檢測限(LOD)均為104CFU/mL。將發(fā)酵1和30 d的酸奶進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)菌株仍保持在108CFU/mL，qPCR方法得到的計(jì)數(shù)值高于PMA-qPCR。這些研究證明PMA-qPCR技術(shù)可用于在復(fù)雜酸奶發(fā)酵環(huán)境中快速定量益生菌，幫助生產(chǎn)者選取生存能力更強(qiáng)的優(yōu)勢菌株。

3.2.2 奶酪

奶酪同樣是一種以混合發(fā)酵劑發(fā)酵的食品，作為益生菌的優(yōu)良載體，具有獨(dú)特的風(fēng)味和質(zhì)地。PMA-qPCR技術(shù)已被用于監(jiān)控切打干酪(chadder cheese)發(fā)酵過程中益生菌生長情況，éMILIE[32]探究了添加3種益生菌對車打干酪發(fā)酵及成熟期的影響，樣品以乳酸乳球菌為發(fā)酵劑，分別添加雙歧桿菌(B.animalissubsp. lactis)BB-12、鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)RO011、瑞士乳桿菌(L.helveticus)RO052和3種益生菌混合物，結(jié)果表明,益生菌添加會影響發(fā)酵菌株的生長，混合菌株之間雖存在抑制作用，但在成熟期奶酪中仍能保持較高活性(lg 9 CFU/g)。除此之外，也有學(xué)者使用PMA-qPCR技術(shù)與體外模擬實(shí)驗(yàn)相結(jié)合從而得出比培養(yǎng)依賴型定量更為高效的方法。VILLARREAL等[33]使用qPCR、PMA-qPCR結(jié)合平板計(jì)數(shù)法評價了嗜酸乳桿菌La-5、雙歧桿菌BB-12和清酒乳桿菌(L.sakeisubsp. sakei)2a在小瑞士奶酪貨架期間的存活率，發(fā)現(xiàn)3種方法在測定初期沒有較大差異，然而隨著體外誘導(dǎo)試驗(yàn)的變化，不同方法之間差異增大，電鏡結(jié)果顯示qPCR計(jì)數(shù)了大量膜損傷細(xì)胞而PMA-qPCR克服了這個問題。在檢測中顯示BB-12菌株有較好的生存能力，能夠維持在6 lgCFU/g及以上。基于這些研究，ERKUS等[34]發(fā)掘了PMA-qPCR更大的應(yīng)用潛力，以8種混合菌株為發(fā)酵劑的GUODA干酪在成熟過程中會出現(xiàn)大量膜不完整細(xì)胞，這給宏基因組帶來了巨大挑戰(zhàn)，用PMA處理發(fā)酵期和成熟期樣品后選擇性剔除了膜損傷細(xì)胞，從而可以對奶酪微生物群落中活細(xì)胞進(jìn)行更高效的宏基因組鑒別分析。

3.2.3 開菲爾

開菲爾(Kefir)是一種利用開菲爾粒(Kefir grain)，對牛奶、羊奶等發(fā)酵，得到的含醇、酸及少量CO2的發(fā)酵乳。開菲爾粒是一種天然存在的混菌發(fā)酵體系，內(nèi)含多種微生物，分析其菌相組成是探討發(fā)酵過程、代謝機(jī)制及確保發(fā)酵乳安全性的前提[35]。PORCELLATO等[36]將PMA-qPCR技術(shù)與變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)及自動核糖體間隔基因分析(automated Ribosomal intergenic spacer analysis，ARISA)聯(lián)用，探究了3個生產(chǎn)批次的開菲爾產(chǎn)品在貨架期及超過貨架期兩周內(nèi)的菌群動態(tài)變化。結(jié)果表明在儲存過程中，PMA處理后的Kefir樣品與原始樣品中菌群存在顯著差異，作為發(fā)酵劑的主要構(gòu)成菌株鏈球菌屬(Streptococcus)、乳球菌屬(Lactococcus)和乳桿菌屬(Lactobacillus)濃度明顯下降，DGGE及ARISA檢測不同批次樣品中均出現(xiàn)了污染微生物。這種直接從食品中提取DNA進(jìn)行分析的方法為開菲爾類發(fā)酵產(chǎn)品的研究提供了新的思路。

3.3 魚露

魚露因富含谷氨酸而被作為食品中天然的增鮮劑。它以低值魚蝦或水產(chǎn)品加工下腳料為原料，利用環(huán)境、魚自身的酶系及耐鹽酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物在一定條件下發(fā)酵而成[37]。因其自然發(fā)酵周期較長(12～18個月)，生產(chǎn)中通常采用添加發(fā)酵劑的形式加速發(fā)酵和提高產(chǎn)品品質(zhì)，所以監(jiān)測添加菌種的生長變化對于發(fā)酵過程的質(zhì)控是必要的。為了快速檢測出富含28株原生菌株的復(fù)雜初始發(fā)酵環(huán)境中添加發(fā)酵劑的生長情況，UDOMSIL等[38]使用基于目標(biāo)菌株堿性絲氨酸蛋白酶X基因(aprX)及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行精確定量，在優(yōu)化后的PMA處理?xiàng)l件下，對嗜鹽性蛋白酶產(chǎn)生菌(Virgibacillussp.)SK37和嗜鹽四生球菌(Tetragenococcus.halophilus) MS33的最低限可達(dá)到103、102CFU/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)PMA-qPCR檢測的穩(wěn)定性未受到復(fù)雜基質(zhì)的影響，所以可被用于監(jiān)測發(fā)酵劑發(fā)酵過程的實(shí)用工具(表3)。

表3 不同發(fā)酵食品活菌檢測線性范圍及最低檢測限Table 3 The detection limits of PMA-qPCR technique for enumeration of living microbes in different fermentation foods

4 展望

PMA-qPCR技術(shù)是近年來較為新型的微生物計(jì)數(shù)技術(shù)，以其較高的工作效率和準(zhǔn)確的定量結(jié)果受到很多學(xué)者的青睞。本文綜述了近年來PMA-qPCR技術(shù)在發(fā)酵食品科研領(lǐng)域的應(yīng)用情況；值得注意的是，由于特定發(fā)酵食品內(nèi)環(huán)境的復(fù)雜性和特異性，在實(shí)際應(yīng)用中需針對相應(yīng)的食品基質(zhì)進(jìn)行PMA反應(yīng)條件優(yōu)化。