β-環(huán)糊精與香芹酮形成常數(shù)的測定及其包合物的制備及表征

薛碩，董曼，張璐璐，尹凱靜，王琳，任婧楠，潘思軼，范剛*

1(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，環(huán)境食品學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢，430070) 2(湖北省食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖北 武漢，430075)

香芹酮(carvone)是留蘭香油的主要成分，香氣清新，令人愉悅?？勺鳛橄憔懔蠎?yīng)用到食品(硬糖、口香糖和各種飲料等)以及日化品(肥皂、牙膏、洗發(fā)水和一些化妝品等)行業(yè)中[1]。主要作用為調(diào)節(jié)風(fēng)味，并且香芹酮也具有一定的抗氧化性，所以也可以作為用于食品保藏的天然保鮮劑[2]。但是由于香芹酮易揮發(fā)，且水溶性較差，為了增強(qiáng)其在應(yīng)用過程中的穩(wěn)定性，可以將其包埋為性質(zhì)較為穩(wěn)定的包合物。而環(huán)糊精是最簡單的包合材料之一，其具有親水的外表面和中空疏水的內(nèi)表面，無論在固體狀態(tài)還是在水溶液中，都具有與疏水分子形成非共價(jià)包合物的能力[3]。在食品科學(xué)領(lǐng)域，環(huán)糊精通常被用來提高熱加工食品中風(fēng)味的保留率，或者用于精油的緩釋，或者用于改善不同果汁的顏色或者香氣，此外，精油與β-環(huán)糊精制備的微膠囊也在烹飪學(xué)中被廣泛應(yīng)用，以期改善食品的感官特性[4]。若將香芹酮與環(huán)糊精制成固態(tài)包合物，則可在一定程度上提高香芹酮的穩(wěn)定性、水溶性，降低其揮發(fā)性，且具有一定的緩釋功能，從而提高其利用效率。然而在環(huán)糊精的實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)當(dāng)考慮包合物的解離平衡和化學(xué)計(jì)量，當(dāng)環(huán)糊精包合物溶解于水中時(shí)，它與包合物在平衡狀態(tài)下分解成自由組分，而形成常數(shù)(Kf)是可以評價(jià)包合物的結(jié)合強(qiáng)度和理化性質(zhì)的有用指標(biāo)[5]。形成常數(shù)的測定方法有很多，比如紫外可見分光光度法[6]、靜態(tài)頂空氣相色譜法[7]以及相溶解度法[8]等，都可以用于測定環(huán)糊精與揮發(fā)性風(fēng)味化合物形成包合物的形成常數(shù)。本研究選用了在靜態(tài)頂空氣相色譜法基礎(chǔ)上改進(jìn)的SPME-GC-MS法進(jìn)行了香芹酮與β-環(huán)糊精之間的形成常數(shù)的測定，證明了香芹酮能與β-環(huán)糊精形成1∶1的包合物。并用共沉淀法制備了環(huán)糊精與香芹酮的包合物，對包合物進(jìn)行一系列表征，進(jìn)一步證實(shí)了包合物的形成。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

β-環(huán)糊精(分析純)，上海源葉生物科技有限公司；香芹酮(分析純)，美國Sigma-Aldrich公司；無水乙醇，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

T-10000電子天平，美國雙杰集團(tuán)有限公司；5417R高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山超聲公司；Beta2-8LD真空冷凍干燥機(jī)，德國Christ公司；6890N氣相色譜儀，美國Agilent公司；6890N/5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Agilent公司；蔡司MERLIN Compact超高分辨率場發(fā)射掃描電鏡，德國卡爾蔡司股份公司；Nexlus傅里葉變換紅外光譜儀，瑞士Mettler Toledo公司；D8 ADVANCE多晶X射線粉末衍射儀，德國布魯克儀器有限公司；熱重分析儀，瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 β-環(huán)糊精與香芹酮在水溶液中保留率和形成常數(shù)的測定

首先制備濃度為0、1、4、7、10 mmol/L的β-環(huán)糊精溶液，每個(gè)濃度制備3個(gè)平行。香芹酮的加入量保持不變(即將1 μL的香芹酮分別加入到100 mL不同濃度的環(huán)糊精溶液中)，密封完全后，放置于25 ℃的恒溫?fù)u床中，以200 r/min的速度振蕩30 min，振蕩后吸取10 mL于22 mL的氣相萃取瓶中，用聚四氟乙烯蓋密封后將固相微萃取頭通過隔墊插入頂空瓶，于磁力攪拌器中(25 ℃)平衡15 min，平衡后，推出纖維頭頂空吸附40 min，萃取好后用GC-MS分析，測得香芹酮峰面積，每個(gè)濃度梯度的測定都進(jìn)行3次。

GC-MS條件[9]：采用HP-5 MS彈性石英毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；載氣(He)流速1.2 mL/min；進(jìn)樣口溫度250 ℃；升溫程序：40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升至160 ℃，保持2 min，最后以8 ℃/ min升至220 ℃，保持3 min。

質(zhì)譜條件：接口溫度250 ℃；離子源EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量為70 eV；掃描范圍m/z50～550。

1.3.1 β-環(huán)糊精對香芹酮的保留率[10]

保留率可由公式(1)計(jì)算得出：

(1)

式中：A0和A分別代表在濃度為0和10 mmol/L的β-環(huán)糊精溶液中測出的香芹酮的峰面積；R為保留率。

1.3.2 β-環(huán)糊精與香芹酮的形成常數(shù)的測定

本研究中形成常數(shù)的測定參考了CIOBANU等[5]、BLACH等[11]、FOURMENTIN等[12]、LANDY等[13]的靜態(tài)頂空氣相色譜(static headspace gas chromatography, SH-GC)法，并進(jìn)行了修改，實(shí)驗(yàn)中用頂空固相微萃取法代替了頂空萃取，用GC-MS代替了GC法。測出定量的香芹酮(1 μL)加入到100 mL的不同濃度(0、1、4、7、10 mmol/L) 的β-環(huán)糊精溶液中，測出香芹酮峰面積的大小，并根據(jù)以下推導(dǎo)過程計(jì)算出香芹酮與β-環(huán)糊精之間的形成常數(shù)。首先環(huán)糊精與香芹酮分子在水溶液中形成包合物是一個(gè)動態(tài)平衡過程。假設(shè)二者以化學(xué)計(jì)量比1∶1相互結(jié)合時(shí)，即公式(2)：

(2)

式中：C1，C2，C3分別代表香芹酮、β-環(huán)糊精及其包合物的平衡濃度，K為包合平衡常數(shù)。假設(shè)起始β-環(huán)糊精濃度為C0，香芹酮的起始濃度為C，所以公式(2)可以寫為公式(3)：

(3)

由于使用的β-環(huán)糊精的量遠(yuǎn)大于香芹酮的量，所以C0≈C2，則公式(3)可以寫為公式(4) ：

(4)

1.4 物理混合物和包合物的制備

由于香芹酮的揮發(fā)性強(qiáng)，普通條件干燥易脫包，因此選擇了冷凍干燥法來制備，準(zhǔn)確稱取1.135 g的β-環(huán)糊精于錐形瓶中，加入100 mL蒸餾水后溶解，用移液槍準(zhǔn)確移取165 μL香芹酮，使兩者摩爾比為1∶1，將香芹酮逐滴加入環(huán)糊精溶液中，將得到的混合物放置于25 ℃的恒溫?fù)u床中，以300 r/min的速度振蕩24 h，取出后將其置于4 ℃冰箱中放置24 h，使得包合過程充分進(jìn)行，預(yù)凍后進(jìn)行冷凍干燥，將最后得到的粉末密封完全后，置于4 ℃冰箱中待用[6]。

準(zhǔn)確稱量1.135 g的β-環(huán)糊精，吸取165 μL的香芹酮，使兩者的摩爾比為1∶1，將兩者置于瑪瑙研缽中研磨，直到兩者充分混合均勻，即得到了β-環(huán)糊精與香芹酮的物理混合物。

1.5 包合物中香芹酮包合率的測定[14]

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定

將適量的香芹酮加入到無水乙醇中，配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 μL/ mL的無水乙醇溶液。應(yīng)用氣相色譜法分析得出相應(yīng)的峰面積，以香芹酮的體積濃度為橫坐標(biāo)，以測得香芹酮的峰面積(Y)與對應(yīng)的香芹酮的體積濃度(X)進(jìn)行線性回歸，得相應(yīng)回歸方程為：Y=2 370.9X-205.32，R2=0. 994。

1.5.2 氣相色譜條件

色譜柱：HP-5毛細(xì)管柱(30 m × 0.32 nm，0.25 μm)；分流比為50∶1；檢測器為FID；進(jìn)樣口溫度和檢測器溫度分別為250、270 ℃。升溫程序：40 ℃ 保持1 min， 以6 ℃/min升至220 ℃，保持1 min，再以30 ℃/min升至250 ℃，液體進(jìn)樣量為1.0 μL。

1.5.3 包合物中香芹酮的提取

準(zhǔn)確稱量20 mg的包合物，加入5 mL無水乙醇，密封后混勻，并于60 ℃條件下超聲處理30 min，使得香芹酮從β-環(huán)糊精的空腔中轉(zhuǎn)移到無水乙醇中。然后4 200 r/min離心處理5 min以獲得澄清的上清液，過濾膜后用氣相色譜分析得出相應(yīng)的峰面積，使用回歸方程計(jì)算出包合物中香芹酮的含量。

1.5.4 包合率的計(jì)算

包含率計(jì)算如公式(5)。

(5)

1.6 包合物的表征

1.6.1 掃描電鏡

對單純的β-環(huán)糊精以及包合物進(jìn)行掃描電鏡測試[15]。將樣品固定在樣品臺上，噴鍍鉑金后3.0 kV條件下進(jìn)行觀察，放大倍率為600、6 000倍。

1.6.2 紅外光譜分析

紅外光譜分析用溴化鉀壓片法進(jìn)行[16]，β-環(huán)糊精、物理混合物及包合物粉末在干燥狀態(tài)下用瑪瑙研缽充分研磨并與KBr混合均勻。壓成1 mm厚的薄片后進(jìn)行掃描。香芹酮液體的測定采用KBr涂膜法，即滴加少量香芹酮于2片空白溴化鉀片中，壓成薄膜后進(jìn)行掃描。掃描波數(shù)為400～4 000 cm-1。

1.6.3 X-衍射分析

分別對β-環(huán)糊精、物理混合物及包合物進(jìn)行X-衍射測試[15]。測定條件為Cu Kα射線、管電壓40 kV、管電流200 mA，掃描3～40°、掃描速率8°/min、步長0.02°。

1.6.4 熱重分析

分別對香芹酮液體、β-環(huán)糊精、物理混合物及包合物進(jìn)行TGA分析[17-18]。升溫：40～500 ℃，升溫速率：10 ℃/min，N2保護(hù)；實(shí)驗(yàn)前對TG裝置進(jìn)行校準(zhǔn)，每次運(yùn)行前用N2清洗30 min。

1.7 數(shù)據(jù)處理

由3次平行實(shí)驗(yàn)測定得到的各實(shí)驗(yàn)平均值及標(biāo)準(zhǔn)偏差采用Microsoft Office Excel 2016進(jìn)行計(jì)算，并用Origin 85軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 香芹酮與環(huán)糊精的保留率及其形成常數(shù)

2.1.1 香芹酮與β-環(huán)糊精的保留率

在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行了3次實(shí)驗(yàn)，保留率分別為80.7%、85.91%、82.16%，平均值為82.94%，平均偏差為0.26%，由此可以表明，香芹酮與β-環(huán)糊精有形成包合物的趨勢，因?yàn)棣?環(huán)糊精對香芹酮表現(xiàn)出了較好的保留能力。

2.1.2 香芹酮與β-環(huán)糊精之間的形成常數(shù)

用Origin進(jìn)行方程擬合發(fā)現(xiàn)，根據(jù)理論，測試點(diǎn)構(gòu)成一條回歸直線(Y=1 066.7X+1)，R2=0.99。說明β-環(huán)糊精與香芹酮形成了1∶1的包合物。而形成常數(shù)Kf等于回歸直線的斜率，則Kf=1 066.7 mol-1(圖1)。

a-實(shí)際數(shù)據(jù)點(diǎn)；b-包含物的理論曲線圖1 實(shí)驗(yàn)實(shí)際測出的數(shù)據(jù)點(diǎn)與當(dāng)Kf=1 066.7 mol-1時(shí)β-環(huán)糊精與香芹酮形成1∶1的包合物時(shí)的理論曲線Fig.1 Representation of the experimental points obtained for carvone and β-cyclodextrin compared with theoretical titration curve for a 1∶1 complex

2.2 固體包合物的表征

2.2.1 包合率的測定

在相同實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行了3次實(shí)驗(yàn)，包合率分別為74.75%、72.3%、78.0%，平均值為75.04%，平均偏差為2.89%，由此可以表明，香芹酮與β-環(huán)糊精的匹配性良好，由冷凍干燥法得到的包合物包合效果良好，用β-環(huán)糊精作為香芹酮的包埋壁材有很好的發(fā)展前景。

2.2.2 掃描電鏡分析

通過掃描電鏡我們可以觀察到單純的β-環(huán)糊精與包合物的大小以及表面形態(tài)有很大差異。在相同的放大倍數(shù)下，2種物質(zhì)都表現(xiàn)出明顯的晶體狀態(tài)，但是包合物的體積明顯比單純的β-環(huán)糊精小；而且兩者的表面形態(tài)也完全不同，包合物的晶體聚集程度更高一些。單純的β-環(huán)糊精的表面較為松散、大多不規(guī)則，而且表面有些凸凹不平，恰好適合對小分子物質(zhì)進(jìn)行包合[19]。而包合物的表面更加光滑平整，且呈現(xiàn)出規(guī)則的立方體形態(tài)，這些說明包合物是一種新的物相，而且存在狀態(tài)比較穩(wěn)定[20]。

2.2.3 紅外光譜分析

圖2為香芹酮、β-環(huán)糊精、物理混合物及包合物的紅外光譜圖。從香芹酮的紅外光譜可以看出，香芹酮在2 922.28 cm-1處有C—H的伸縮吸收振動峰；在1 669.90 cm-1處有C═O的特征峰，在1 365.88、1 245.57 cm-1處有C—C的伸縮振動峰，在1 109.81 cm-1處有C—C的伸縮振動吸收峰。β-環(huán)糊精主要在3 375.1cm-1處有締合O—H的伸縮振動吸收峰；在2 929.18 cm-1處有C—H的伸縮振動吸收峰；在1 643 cm-1左右有H—O—H吸收峰;在1 156.91和1 028.46 cm-1處有C═C的伸縮振動吸收峰[21]。

A-香芹酮；B-β-環(huán)糊精；C-物理混合物;D-包合物圖2 香芹酮、β-環(huán)糊精、物理混合物及包合物紅外光譜圖Fig.2 IR spectrums of carvone, β-cyclodextrin, physical complex and their inclusion complex

物理混合物與單純的β-環(huán)糊精相比，吸收峰的位置基本相同，吸收強(qiáng)度有所差異(可能是由于壓片過程中取樣的多少導(dǎo)致的)，而沒有香芹酮的特征峰出現(xiàn)可能是因?yàn)橄闱弁獦O易揮發(fā)，取樣量又很少，在制樣過程中幾乎全部揮發(fā)導(dǎo)致的。而β-環(huán)糊精包合物的紅外光譜圖表現(xiàn)與單純的β-環(huán)糊精相似，而與對應(yīng)的單純的香芹酮的紅外光譜圖存在很大差異。

與單純的香芹酮相比，包合物中香芹酮在1 365、1 246 cm-1處吸收減弱，這可能是因?yàn)榭腕w分子在環(huán)糊精包合物中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)較小，吸收峰被大量的環(huán)糊精吸收峰遮蔽，紅外光譜圖吸收的變化說明，β-環(huán)糊精與香芹酮主客體間雖然形成了包合物，但是未發(fā)現(xiàn)新的吸收峰，說明β-環(huán)糊精與香芹酮之間是物理性結(jié)合而不是化學(xué)性結(jié)合[22]。同時(shí)，在結(jié)合后香芹酮的特征峰發(fā)生了一定程度的偏移，說明包埋過程對香芹酮產(chǎn)生了影響[23]。

2.2.4 X-衍射分析

由圖3可以看出，3種物質(zhì)皆有多且尖銳的衍射峰，說明它們都包含多種不同擬晶態(tài)的物質(zhì)。其中單純的β-環(huán)糊精與物理混合物的衍射峰除了衍射峰的強(qiáng)度有些差別外，衍射峰的位置及數(shù)量幾乎沒有差異，這可能是由于本次試驗(yàn)中的客體分子香芹酮為揮發(fā)性的液體，不會產(chǎn)生衍射峰，因此物理混合后并不會改變β-環(huán)糊精的結(jié)晶狀態(tài)，而比較β-環(huán)糊精及其包合物的譜圖發(fā)現(xiàn)，包合物的衍射峰卻明顯不同于環(huán)糊精。環(huán)糊精在2θ=4.50、8.88、10.6、12.46、16.96、20.72、22.7、24.28、27.05°等處出現(xiàn)衍射峰，而包合物并沒有這些峰且在2θ=6.52、9.38、14.88、18.1、25.7、30.1°等處出現(xiàn)新的衍射峰，說明香芹酮與β-環(huán)糊精形成包合物后晶態(tài)發(fā)生了變化，新的物相產(chǎn)生[24]。而且由圖3還可看出，包合物的衍射峰數(shù)量沒有β-環(huán)糊精的多，但是峰較寬，可以判斷包合物的結(jié)晶程度低于β-環(huán)糊精。

a-β-環(huán)糊精; b-物理混合物;c-包合物圖3 β-環(huán)糊精、物理混合物及包合物的X-射線衍射圖Fig.3 X-ray diffraction patterns of β-cyclodextrin, physical complex and inclusion complex

2.2.5 熱重分析

熱重分析(TGA)主要是用于評價(jià)包合物中香芹酮的熱穩(wěn)定性和揮發(fā)性[25]，由圖4可知，香芹酮在40～220 ℃迅速損失質(zhì)量，質(zhì)量損失高達(dá)99.59%，這是由于香芹酮極易揮發(fā)的性質(zhì)導(dǎo)致。β-環(huán)糊精存在2個(gè)失重階段，分別為50～100 ℃和325～375 ℃。

a-香芹酮; b-β-環(huán)糊精; c-物理混合物和d-包合物;A-TGA圖;B-DTG圖圖4 香芹酮、β-環(huán)糊精、物理混合物和包合物的TGA和DTG分析圖Fig.4 The TGA and DTG profiles of carvone, β-CD, physical mixture and inclusion complex

第一個(gè)是水分的蒸發(fā)(損失13.59%)，第二個(gè)是由于β-環(huán)糊精的分解引起的。而物理混合物在40～130 ℃存在2個(gè)失重階段，第一個(gè)階段比單純的β-環(huán)糊精中水的蒸發(fā)引起的失重溫度要低，速度也更快一些，證明是由于β-環(huán)糊精的水分蒸發(fā)與香芹酮的揮發(fā)共同引起的(損失14.43%)，第二個(gè)階段是香芹酮的繼續(xù)揮發(fā)引起的(損失5.92%)，這2個(gè)階段的損失比單純的β-環(huán)糊精在此溫度范圍內(nèi)的質(zhì)量損失增加了6.76%，而且混合物在280 ℃開始分解，最大分解溫度為312 ℃，與單純的β-環(huán)糊精基本相同，說明香芹酮與β-環(huán)糊精只是簡單的物理混合，沒有形成包合物。而雖然包合物也有3個(gè)失重階段，但是失重階段的范圍卻和物理混合物有所差別，130 ℃前是水分蒸發(fā)，130～325 ℃階段的失重是由于香芹酮的揮發(fā)引起的，而單純的香芹酮和物理混合物中的香芹酮的失重分別發(fā)生在60～220 ℃和100～150 ℃。且包合物中β-環(huán)糊精最大分解溫度(280 ℃)比單純β-環(huán)糊精低32 ℃，這可能是因?yàn)橄闱弁M(jìn)入了β-環(huán)糊精空腔內(nèi)，影響了β-環(huán)糊精在加熱過程中的穩(wěn)定性導(dǎo)致，這些變化表明，香芹酮與β-環(huán)糊精發(fā)生了作用，形成了包合物[26]。

3 結(jié)論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定冷凍干燥法制備的包合物的保留率為75.05%，β-環(huán)糊精與香芹酮之間的形成常數(shù)為1 066.7 mol-1，證明香芹酮與β-環(huán)糊精之間形成了1∶1的包合物。由氣相色譜法確定冷凍干燥法制備的包合物的包合率為(75.04±2.89)%，證明冷凍干燥法制備的包合物包埋效果良好。對所制備的香芹酮包合物進(jìn)行掃描電鏡、紅外光譜、X-衍射以及熱重分析，結(jié)果均表明，包合物與單純的β-環(huán)糊精的特性不同。通過掃描電鏡得知，β-環(huán)糊精包埋前后晶體的大小以及表面形態(tài)都發(fā)生了變化，通過紅外光譜分析得出，包合物中既沒有香芹酮的特征吸收峰，也未出現(xiàn)新的吸收峰，表明香芹酮與環(huán)糊精的包合物的形成沒有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)；通過X-衍射分析得出，環(huán)糊精與包合物的結(jié)晶狀態(tài)不同，表明包合物是一種新的物相。熱重分析結(jié)果表明，β-環(huán)糊精與香芹酮發(fā)生了作用，不是簡單的物理混合，而是形成了包合物，香芹酮的熱穩(wěn)定性得到了提高。