工業(yè)化生產(chǎn)凍干前不同階段雙歧桿菌死亡規(guī)律的模擬分析

王順余，張海蓉，李淵，何建新，陸圓圓，崔樹茂*，陸文偉，張灝

1(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 2(浙江李子園食品股份有限公司，浙江 金華，321015)

人類腸道定植著大量的微生物，其中雙歧桿菌屬在腸道微生物中扮演著非常重要的角色，比例約占成人糞便細(xì)菌的25%，在嬰兒糞便中，雙歧桿菌屬的比例達(dá)到了80%[1]。雙歧桿菌是人體胃腸道中益生菌群至關(guān)重要的組成部分，對(duì)調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡及治療人類腸道疾病有極其重要的作用。多項(xiàng)研究表明，雙歧桿菌的酶系機(jī)制可以刺激體內(nèi)抗體和細(xì)胞因子的產(chǎn)生，把巨噬細(xì)胞的β-半乳糖苷酶成功激活，更好地發(fā)揮其吞噬作用[2]；雙歧桿菌還可以產(chǎn)生一類活性因子，這種活性因子對(duì)人體具有免疫調(diào)節(jié)作用[3]，或菌體本身就充當(dāng)著一種非特異性免疫調(diào)節(jié)因子。另發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌對(duì)緩解腸易激綜合征[4-5]、緩解上呼吸道疾病[6]、調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)[7]等均具有較好的效果。隨著人的年齡增長(zhǎng)，體內(nèi)雙歧桿菌的數(shù)目逐年減少，為了充分發(fā)揮其益生功能，關(guān)于雙歧桿菌微生態(tài)制劑及其發(fā)酵食品的研究已成為焦點(diǎn)問題。

目前國內(nèi)外的雙歧桿菌制品主要有含雙歧桿菌酸奶、雙歧桿菌固體飲料、復(fù)合雙歧桿菌固體飲料及雙歧桿菌膠囊和片劑(主要國外市場(chǎng))等。雙歧桿菌凍干粉是雙歧桿菌制品的主要原料，一直是益生菌工業(yè)化生產(chǎn)的熱門菌株。但是，目前雙歧桿菌的生產(chǎn)效率很低，它是嚴(yán)格厭氧菌，生長(zhǎng)培養(yǎng)條件苛刻，對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求也比一般菌更復(fù)雜，凍干粉工業(yè)化生產(chǎn)的各個(gè)階段均可能對(duì)其活性產(chǎn)生影響。

雙歧桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)主要包括發(fā)酵液制備、離心收集菌泥、菌泥與凍干保護(hù)劑混合均質(zhì)、真空冷凍干燥等工藝步驟。在雙歧桿菌的分批發(fā)酵階段，需用氮?dú)獗罕ＷC嚴(yán)格的厭氧環(huán)境，待發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵液輸送至離心機(jī)進(jìn)行菌體收集。在菌體收集過程中，發(fā)酵液開始暴露在氧氣環(huán)境中，且離心時(shí)間往往超過1個(gè)甚至幾個(gè)小時(shí)，發(fā)酵液的空氣暴露有可能對(duì)菌體的活性產(chǎn)生影響。在離心過程中，一方面因?yàn)殡x心力自帶的機(jī)械作用和暴露空氣造成部分菌體死亡；另一方面，部分菌體殘留在上清液中而損失[8]。如果離心工藝掌握不當(dāng)，超過了菌體的最大承受能力范圍，就會(huì)直接導(dǎo)致凍干制劑活菌含量低。且在工業(yè)化生產(chǎn)中，菌泥的離心收集是持續(xù)進(jìn)行的，即待離心結(jié)束，先得到的菌泥在與凍干保護(hù)劑混合前會(huì)一直暴露在空氣中，這一環(huán)節(jié)也可能對(duì)菌體產(chǎn)生損傷。鑒于此，通過研究發(fā)酵液空氣暴露、離心力、離心時(shí)間、離心溫度和菌泥暴露空氣時(shí)間對(duì)雙歧桿菌離心損失率和存活率的影響，確定對(duì)菌體產(chǎn)生明顯損傷的工藝環(huán)節(jié)對(duì)提高雙歧桿菌的制備效率具有重要的意義。另外，凍干保護(hù)劑的添加雖然有研究表明能夠提高菌體在凍干過程的存活率，但在凍干前與菌泥混合均質(zhì)階段也會(huì)暴露在空氣中，在該階段菌體是否會(huì)有損傷尚不清楚，添加一定量的抗氧化劑是否能夠相應(yīng)地降低損傷率有必要研究確認(rèn)。

本文的目的是通過研究雙歧桿菌工業(yè)化生產(chǎn)中凍干前的不同工藝階段對(duì)雙歧桿菌活性的影響，探究其死亡規(guī)律，以便針對(duì)性地改善關(guān)鍵工藝環(huán)節(jié)，提高雙歧桿菌的制備效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

兩歧雙歧桿菌CCFM16、青春雙歧桿菌CCFM8630、短雙歧桿菌CCFM683、長(zhǎng)雙歧桿菌L6，江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心保藏。

1.1.2 試劑

脫脂乳粉，上海恒天然商貿(mào)有限公司；海藻糖，日本林原-山東優(yōu)索化工科技有限公司；D-異抗壞血酸鈉，江西百勤異VC鈉有限公司；MRS培養(yǎng)基所需試劑、蔗糖、瓊脂等，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GRP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；ZQZY-VS3型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；TG16-WS型臺(tái)式高速離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；AW500SG型厭氧工作站，英國依萊泰科；UV-2450紫外分光光度計(jì)，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 雙歧桿菌種子液的制備

從保菌管內(nèi)分別吸取100 μL兩歧雙歧桿菌CCFM16、青春雙歧桿菌CCFM8630、短雙歧桿菌CCFM683和長(zhǎng)雙歧桿菌L6，接種到5 mL添加L-半胱氨酸鹽酸鹽的MRS(MRS-L)液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃厭氧工作站進(jìn)行活化培養(yǎng)36 h，連續(xù)活化2次，得各雙歧桿菌的活化種子液。

1.3.2 雙歧桿菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

將兩歧雙歧桿菌CCFM16、青春雙歧桿菌CCFM8630、短雙歧桿菌CCFM683和長(zhǎng)雙歧桿菌L6 4株菌種活化擴(kuò)培后，分別以2%、4%、2%、2%的接種量接種于MRS-L液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)，從0 h 開始，每隔2 h取樣測(cè)定菌液在600 nm下的OD值，繪制24 h內(nèi)生長(zhǎng)曲線，比較生長(zhǎng)最高活菌數(shù)，確定各自最佳收菌時(shí)間。若OD600>0.8時(shí)，需要進(jìn)行一定比例的稀釋，使紫外分光光度計(jì)上的讀數(shù)在0.2～0.8。 同時(shí)取12、14、16、18、20、22 h的樣品進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)方法采用平板菌落計(jì)數(shù)法。

1.3.3 發(fā)酵液空氣暴露不同時(shí)間雙歧桿菌存活率的測(cè)定

將各雙歧桿菌種子液接入500 mL錐形瓶MRS-L液體培養(yǎng)基(裝液量300 mL)，各菌株準(zhǔn)備6瓶，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)至各菌株的穩(wěn)定期。然后從各菌株的培養(yǎng)液中取出3瓶，置于37 ℃振蕩培養(yǎng)箱模擬工業(yè)化生產(chǎn)階段的發(fā)酵液空氣暴露；另一半樣品繼續(xù)放置在厭氧工作站中。每1 h測(cè)定活菌數(shù)，按照公式(1)計(jì)算雙歧桿菌在不同環(huán)境、不同時(shí)間的存活率。

(1)

1.3.4 不同離心條件下雙歧桿菌存活率的測(cè)定

各雙歧桿菌培養(yǎng)至穩(wěn)定期后，分裝至50 mL離心管，在不同的離心溫度(20和4 ℃)、離心力(4 000、6 000、 8 000×g)條件下離心不同時(shí)間(10、30 min)。離心結(jié)束后，重新將菌泥與上清液振蕩混勻，通過平板菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定不同離心條件離心后活菌數(shù)。按照公式(2)計(jì)算不同離心條件各雙歧桿菌的存活率。

(2)

1.3.5 菌泥室溫暴露不同時(shí)間雙歧桿菌存活率的測(cè)定

各雙歧桿菌在最適宜的離心條件下離心后，稱取1 g濕菌泥立即測(cè)定菌泥活菌數(shù)，其他菌泥置于9 cm平板，菌泥厚度達(dá)到平板邊沿高度(約1 cm)，置于室溫環(huán)境，模擬工業(yè)化生產(chǎn)離心后的菌泥堆積階段。每1 h取1 g暴露室溫環(huán)境的濕菌泥測(cè)定活菌數(shù)。按照公式(3)計(jì)算各雙歧桿菌菌泥空氣暴露不同時(shí)間的存活率。

(3)

1.3.6 菌泥與保護(hù)劑混合后空氣暴露不同時(shí)間雙歧桿菌存活率的測(cè)定

配制100 g/L脫脂乳粉、30 g/L蔗糖、30 g/L海藻糖組成的凍干保護(hù)劑溶液，105 ℃滅菌10 min后冷卻備用。各雙歧桿菌最適條件下離心后，將菌泥與凍干保護(hù)劑溶液按1∶1(質(zhì)量體積比)混合，快速混勻后立即測(cè)定活菌數(shù)，然后置于室溫環(huán)境，模擬工業(yè)化生產(chǎn)菌泥與保護(hù)劑混合及鋪板階段，每1 h后取樣測(cè)定菌懸液的活菌數(shù)。按照公式(4)計(jì)算菌泥與保護(hù)劑混合后空氣暴露不同時(shí)間雙歧桿菌的存活率。

(4)

1.3.7 抗氧化劑的添加對(duì)雙歧桿菌活性的影響

按1.3.6配制保護(hù)劑，無菌環(huán)境下加入10 g/L的D-異抗壞血酸鈉(0.22 μm的無菌濾膜過濾除菌)。

按照1.3.6的方法測(cè)定菌泥與添加抗氧化劑的凍干保護(hù)劑混合后空氣暴露3 h后各雙歧桿菌的存活率。

1.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)中各項(xiàng)數(shù)據(jù)的測(cè)定均為3次生物學(xué)重復(fù)的平均值。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值與標(biāo)準(zhǔn)差均采用Excel計(jì)算并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙歧桿菌生長(zhǎng)特性分析

在雙歧桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)中，發(fā)酵終點(diǎn)的判斷非常重要。在雙歧桿菌生長(zhǎng)的不同階段終止發(fā)酵，不僅影響離心收集菌泥中的活菌數(shù)，而且影響后續(xù)菌體的凍干存活率。眾多研究已經(jīng)表明，生長(zhǎng)不同階段的菌體具有不同的脅迫耐受能力，穩(wěn)定期的細(xì)胞較延滯期和對(duì)數(shù)期的細(xì)胞具有更強(qiáng)的脅迫耐受能力[9]。在乳酸菌的工業(yè)化生產(chǎn)時(shí)，收集穩(wěn)定期的菌體將更利于凍干。如，在鼠李糖乳桿菌生長(zhǎng)的穩(wěn)定期收集菌體，干燥存活率明顯高于延滯期和對(duì)數(shù)期早期[10]；在穩(wěn)定期早期收集的酒類酒球菌SD-2a在凍干時(shí)，存活率顯著高于對(duì)數(shù)期和中期的菌體[11]。雙歧桿菌的生產(chǎn)也應(yīng)該借鑒乳酸菌的生產(chǎn)規(guī)律，在發(fā)酵增殖的對(duì)數(shù)期、末期或穩(wěn)定期收集菌體[12]。但雙歧桿菌較乳桿菌對(duì)脅迫環(huán)境更加敏感，在菌體增殖至穩(wěn)定期時(shí)若不及時(shí)停止發(fā)酵，進(jìn)行收菌，菌體可能會(huì)較快死亡。因此，分析雙歧桿菌的生長(zhǎng)過程，應(yīng)結(jié)合OD值的測(cè)定和活菌計(jì)數(shù)，綜合判斷最佳收菌時(shí)間(圖1)。

圖1 不同雙歧桿菌生長(zhǎng)過程的OD值變化Fig.1 Changes of OD value in the growth process of different Bifidobacteria

從圖1的OD值呈現(xiàn)的生長(zhǎng)趨勢(shì)分析，青春雙歧桿菌CCFM8630和短雙歧桿菌CCFM683生長(zhǎng)至18 h時(shí)達(dá)到穩(wěn)定期，菌濃度最高，之后幾小時(shí)基本穩(wěn)定；且此2株雙歧桿菌的生長(zhǎng)濃度均高于兩歧雙歧桿菌CCFM16和長(zhǎng)雙歧桿菌L6。后者均生長(zhǎng)至20 h達(dá)到穩(wěn)定期，且OD值呈現(xiàn)的菌濃度均低于前者，之后發(fā)酵液的OD值也基本穩(wěn)定。但比較圖2的活菌計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)雖然到達(dá)穩(wěn)定期的時(shí)間與圖1基本一致，但是活菌數(shù)達(dá)到最高值之后即開始降低，說明雙歧桿菌較敏感，到達(dá)穩(wěn)定期后因環(huán)境惡化，活菌細(xì)胞即受到影響導(dǎo)致活菌數(shù)開始降低。因此，雙歧桿菌的收菌時(shí)間應(yīng)嚴(yán)格控制在到達(dá)穩(wěn)定期的時(shí)間，延遲收菌時(shí)間會(huì)導(dǎo)致菌體死亡，活菌率降低。另外，也發(fā)現(xiàn)雖然青春雙歧桿菌CCFM8630發(fā)酵液的OD值比較高，但活菌計(jì)數(shù)很低?？赡芘c該菌株的莢膜成分、厚度、菌體大小、菌體內(nèi)容物有關(guān)，這些因素可能會(huì)影響菌體的抗逆性。

2.2 發(fā)酵液空氣暴露對(duì)雙歧桿菌活性的影響

在工業(yè)化生產(chǎn)中，雙歧桿菌的發(fā)酵通過氮?dú)獗簞?chuàng)造厭氧環(huán)境，確保雙歧桿菌的生長(zhǎng)。一旦發(fā)酵結(jié)束，開始進(jìn)入離心階段，發(fā)酵罐中氮?dú)鈱⒈慌诺?，通過通入空氣產(chǎn)生壓力運(yùn)送發(fā)酵液至離心設(shè)備。該階段發(fā)酵液將與空氣接觸，且該過程根據(jù)發(fā)酵罐的大小通常需要1～3 h。在圖2中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵液中雙歧桿菌到達(dá)穩(wěn)定期后活菌數(shù)就開始降低了；而雙歧桿菌是嚴(yán)格厭氧菌，與空氣的接觸是否會(huì)進(jìn)一步加劇菌體損失？

A-兩歧雙歧桿菌CCFM16;B-青春雙歧桿菌CCFM8630；C-短雙歧桿菌CCFM683;D-長(zhǎng)雙歧桿菌L6圖2 不同雙歧桿菌生長(zhǎng)過程的活菌數(shù)變化Fig.2 Changes of viable cells in the growth process of different Bifidobacteria

表1 厭氧和空氣暴露環(huán)境下發(fā)酵液中各雙歧桿菌在不同時(shí)間的存活率Table 1 Survival rates of Bifidobacteria in fermentation broth under anaerobic and air exposure conditions at different time

暴露時(shí)間/h兩歧雙歧桿菌CCFM16青春雙歧桿菌CCFM8630短雙歧桿菌CCFM683長(zhǎng)雙歧桿菌L6厭氧環(huán)境菌體存活率/%空氣暴露菌體存活率/%厭氧環(huán)境菌體存活率/%空氣暴露菌體存活率/%厭氧環(huán)境菌體存活率/%空氣暴露菌體存活率/%厭氧環(huán)境菌體存活率/%空氣暴露菌體存活率/%0100100100100100100100100193.9±2.386.1±5.895.6±5.894.3±3.592.8±3.583.5±4.599.2±3.789.8±2.6293.9±3.984.7±3.993.8±3.591.1±2.492.5±6.982.4±5.993.4±5.788.6±3.6390.5±5.783.7±5.792.6±2.985.6±4.991.4±2.280.5±2.189.0±2.682.9±2.3

從表1中可以看出，除青春雙歧桿菌CCFM8630外，其他3株雙歧桿菌在發(fā)酵液有溶氧存在時(shí)，活性均受到顯著影響。雖然青春雙歧桿菌CCFM8630表現(xiàn)出較好的耐氧能力，但發(fā)酵液空氣暴露3 h后活性依然受到了影響。因此，為提高雙歧桿菌工業(yè)化生產(chǎn)的得率，應(yīng)盡可能避免發(fā)酵液與空氣暴露，且減少暴露時(shí)間。

2.3 離心條件對(duì)雙歧桿菌活性的影響

菌體收集是益生菌工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵步驟，雖然膜濾濃縮、離心等均被研究用于菌體的收集，但是離心依然是現(xiàn)代工業(yè)菌體收集的主要方式。眾所周知，離心會(huì)對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)(包括DNA)產(chǎn)生影響，從而對(duì)菌體活性產(chǎn)生損傷[15]。由表2可知，離心對(duì)兩歧雙歧桿菌CCFM16、短雙歧桿菌CCFM683和長(zhǎng)雙歧桿菌L6均產(chǎn)生了較嚴(yán)重的影響，但青春雙歧桿菌CCFM8630具有較強(qiáng)的離心耐受能力。

表2 不同離心溫度、離心時(shí)間和離心力條件下各雙歧桿菌的存活率Table 2 Survival rates of Bifidobacteria under different centrifugal temperature, centrifugal time and centrifugal force

20 ℃條件下離心，雙歧桿菌的存活率顯著低于4 ℃ 條件離心；且離心時(shí)間30 min的菌體存活率顯著低于10 min離心的菌體；而不同離心力之間存活率差異不顯著。離心溫度和離心時(shí)間是影響菌體活性的關(guān)鍵因素，而離心力不是關(guān)鍵因素。離心強(qiáng)度在一定范圍內(nèi)對(duì)菌體的損傷是固定的，延長(zhǎng)離心時(shí)間，離心溫度升高，會(huì)加重細(xì)胞皺縮、坍陷、胞外物質(zhì)離散、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破壞等現(xiàn)象，導(dǎo)致菌體活性嚴(yán)重降低[16]。因此，為減少雙歧桿菌在生產(chǎn)過程中的損失，應(yīng)盡可能采用低溫離心，且縮短離心時(shí)間。

2.4 菌泥室溫暴露對(duì)雙歧桿菌活性的影響

發(fā)酵液全部離心結(jié)束，根據(jù)處理量的多少，通常需要1～3 h。在開始離心收集的菌泥，暫時(shí)移至乳化裝置儲(chǔ)備，待發(fā)酵液全部離心結(jié)束后添加保護(hù)劑進(jìn)行均質(zhì)乳化。在添加保護(hù)劑前菌泥會(huì)暴露在室溫環(huán)境中1～3 h，以最適宜的條件離心收集菌體后，將菌泥暴露在室溫環(huán)境中，模擬上述工業(yè)化生產(chǎn)情況，測(cè)定菌泥暴露不同時(shí)間，雙歧桿菌的存活率。通過表3發(fā)現(xiàn)，菌泥在室溫環(huán)境暴露于空氣中活性顯著降低。且暴露時(shí)間越長(zhǎng)，雙歧桿菌活性損失越大。兩歧雙歧桿菌CCFM16、青春雙歧桿菌CCFM8630、短雙歧桿菌CCFM683和長(zhǎng)雙歧桿菌L6的菌泥室溫暴露空氣1 h， 存活率分別降至(84±2.0)%、(94±2.2)%、(85±2.3)%和(93±2.3)%。菌泥暴露3 h后，4株菌的存活率顯著降低，分別降至(55±3.3)%、(80±6.0)%、(72±1.6)%和(90±5.7)%。菌體在室溫環(huán)境下，酶代謝雖然降低，但依然具有較高的活性。菌泥堆積缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，且代謝產(chǎn)物已在胞內(nèi)積累，加速了菌體衰亡?？諝庵醒醯臐B入，進(jìn)一步對(duì)菌體細(xì)胞產(chǎn)生毒害。長(zhǎng)雙歧桿菌L6損失較低，可能與其產(chǎn)生更多的胞外多糖有關(guān)，胞外多糖具有抗氧化、耐干燥、黏附等作用，可能增強(qiáng)該菌的抗逆性[17]。綜上，低溫和縮短菌體暴露時(shí)間是減少雙歧桿菌生產(chǎn)過程活性損失的關(guān)鍵。

表3 室溫暴露環(huán)境下各雙歧桿菌菌泥在不同時(shí)間的存活率Table 3 Survival rates of Bifidobacteriaof bacterial mud at different time in air exposure environment

2.5 菌與保護(hù)劑懸液空氣暴露對(duì)雙歧桿菌活性的影響

收集菌泥結(jié)束后，菌泥與凍干保護(hù)劑在乳化罐內(nèi)完成均質(zhì)乳化，之后通過管路輸送至凍干機(jī)房，在室溫環(huán)境下完成人工或自動(dòng)鋪板。在菌懸液預(yù)凍成冰之前，菌體可能會(huì)利用保護(hù)劑中的碳水化合物產(chǎn)酸[18]，均質(zhì)過程中的溶氧與會(huì)增加菌體的損傷。表4結(jié)果表明，均質(zhì)乳化后2 h內(nèi)，菌體活性損失不顯著。但3 h后，兩歧雙歧桿菌CCFM16和短雙歧桿菌CCFM683的活性出現(xiàn)顯著降低。青春雙歧桿菌CCFM8630表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗逆性，在發(fā)酵液空氣暴露、離心、菌泥空氣暴露、菌與保護(hù)劑懸液空氣暴露環(huán)境下活性損失均比其他雙歧桿菌低。說明了不同的雙歧桿菌的抗逆性不同，面對(duì)不同階段的加工脅迫活性保持呈現(xiàn)出差異。長(zhǎng)雙歧桿菌L6在離心得到菌泥后的加工階段，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗逆性，表明該菌株產(chǎn)生的較大量的多糖具有一定的抗氧化作用，對(duì)該菌株的活性具有一定的保護(hù)作用。

盡管不同菌株的菌泥在與保護(hù)劑混合后，菌體活性損失有差異，但是3 h后均有降低。為了確保各菌株在預(yù)凍前活性損失降至最低，應(yīng)盡可能提高菌泥在與保護(hù)劑混合后長(zhǎng)時(shí)間活性的維持。

表4 空氣暴露環(huán)境下各雙歧桿菌菌泥混合凍干 保護(hù)劑后在不同時(shí)間的存活率Table 4 Survival rates of Bifidobacteria in suspensions of bacteria mixed with lyoprotectant at different time in air exposure environment

2.6 抗氧化劑的使用對(duì)雙歧桿菌活性保持的作用

保護(hù)劑溶液添加抗氧化劑后，顯著提高了3 h后菌體的活性，均達(dá)到了85%以上(圖3)。說明菌體與保護(hù)劑混合后，菌體活性的損失主要是氧化損傷，通過添加抗氧化劑可以很大程度地減少菌體損失[19]。另有研究表明，保護(hù)劑添加抗氧化劑可以提高乳酸菌的凍干存活率，甚至提高凍干菌粉的穩(wěn)定性。綜上，適宜地在凍干保護(hù)劑中添加適量?jī)龈杀Ｗo(hù)劑，可減少雙歧桿菌的加工損失，提高雙歧桿菌的生產(chǎn)效率。

1-兩歧雙歧桿菌CCFM16;2-青春雙歧桿菌CCFM8630; 3-短雙歧桿菌CCFM683;4-長(zhǎng)雙歧桿菌L6圖3 不同雙歧桿菌菌泥與不同保護(hù)劑混合3h后菌體的存活率Fig.3 Survival rates of Bifidobacteria in suspensions of bacteria mixed with different lyoprotectant in air exposure environment for 3 h

3 結(jié)論

(1)雙歧桿菌發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液空氣暴露對(duì)菌體細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生損傷，發(fā)酵液空氣暴露1 h，兩歧雙歧桿菌CCFM16、青春雙歧桿菌CCFM8630、短雙歧桿菌CCFM683和長(zhǎng)雙歧桿菌L6的菌體活性即產(chǎn)生10%左右的損失，暴露3 h后，4株菌的活性損失均超過20%。在雙歧桿菌的生產(chǎn)過程中，應(yīng)防止發(fā)酵液長(zhǎng)時(shí)間空氣暴露。

(2)離心作為雙歧桿菌收集的主要手段，離心溫度和離心時(shí)間是影響菌體活性的關(guān)鍵因素，而離心力在一定范圍內(nèi)影響不顯著。4 ℃下離心4株菌的存活率顯著高于20 ℃條件，離心時(shí)間30 min 4株菌的存活率低于離心10 min。雙歧桿菌在生產(chǎn)過程中，應(yīng)盡可能采用低溫離心，且縮短離心時(shí)間。

(3)離心后收集的菌泥暴露于空氣中，也會(huì)加速4株雙歧桿菌的活性損失，且暴露時(shí)間延長(zhǎng)，雙歧桿菌活性顯著降低。其中兩歧雙歧桿菌受影響最大，長(zhǎng)雙歧桿菌的影響最小。

(4)菌泥與保護(hù)劑混合后，長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中也會(huì)對(duì)雙歧桿菌產(chǎn)生較顯著的損傷。且菌體的活性損失主要?dú)w因?yàn)檠趸瘬p傷，通過在保護(hù)劑中添加D-異 抗壞血酸鈉作為抗氧化劑，能夠有效緩解空氣暴露對(duì)雙歧桿菌活性的影響。