高密度發(fā)酵產(chǎn)酪氨酸酚裂解酶及催化合成L-DOPA

徐冰冰，雷慶子，曾偉主，未雅楠，黃科峰，周景文*

1 (糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122) 2 (江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122) 3 (山東新華制藥股份有限公司，山東 淄博，255005)

左旋多巴(3,4-2-dihydroxylphenylalanine，L-DOPA)，又名3-羥基-L-酪氨酸，是一種前體藥物，可通過血腦屏障進(jìn)入腦循環(huán)而達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在脫羧酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟桶?，從而達(dá)到治療帕金森綜合癥的效果[1]。目前，L-DOPA是治療帕金森綜合癥的主要藥物[2]。L-DOPA的生產(chǎn)方法主要有植物提取法、化學(xué)合成法和生物酶催化法。植物提取法由于受到原材料來源的限制，應(yīng)用較少。以香草醛和乙內(nèi)酰脲為原料，經(jīng)8步反應(yīng)制得L-DOPA的化學(xué)合成法已經(jīng)用于商業(yè)化，但由于過程繁雜且合成過程中需要大量的金屬催化物，存在成本高、污染嚴(yán)重等問題[3-4]。生物酶法作為一種簡便，高效，環(huán)境友好的新型合成方法受到了越來越多研究者的關(guān)注[5-6]。

酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase，TPL，EC4.1.99.2)是依賴于磷酸吡哆醛(pyridoxal 5-phosphatemonohydrate,PLP)的多功能酶[7]，在生物體內(nèi)可催化L-酪氨酸發(fā)生β消去反應(yīng)生成丙酮酸、苯酚和氨。該反應(yīng)為可逆反應(yīng)，若以鄰苯二酚代替苯酚，便可在TPL催化下由鄰苯二酚、丙酮酸和氨合成L-DOPA[8-10]。TPL是合成L-DOPA的關(guān)鍵酶，主要來源于草生歐文氏菌(Erwiniaherbicola)、弗式檸檬酸菌(Citrobacterfreundii)以及堆肥共生小桿菌(Symbiobacteriumtoebii)[11-12]等菌株，其中來源于E.herbicola和C.freundii的酶活較高[13]。20世紀(jì)70年代初，YAMADA等[14]通過菌株選育和發(fā)酵條件優(yōu)化在日本味之素公司已實現(xiàn)了酶法合成L-DOPA的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。由于原始菌株中的TPL酶活較低，許多學(xué)者利用基因工程方法構(gòu)建重組菌株，使TPL基因異源高效表達(dá)。國內(nèi)對酶法合成L-DOPA的研究起步較晚。2001年，李華鐘等[15]首次將來源于C.freundii的TPL基因?qū)氲酱竽c桿菌(Escherichiacoli)，進(jìn)行異源表達(dá)，并對培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，TPL酶活較原始菌株提高了25倍，L-DOPA產(chǎn)量達(dá)15.36 g/L。目前，關(guān)于酶法合成L-DOPA的研究主要是通過基因工程手段對TPL基因進(jìn)行改造來提高表達(dá)量以及酶活[16-17]，從而提高L-DOPA的產(chǎn)量，高密度培養(yǎng)的相關(guān)報道較少。

為了滿足L-DOPA生產(chǎn)的工業(yè)化要求，必須進(jìn)一步提高TPL酶的表達(dá)量和酶活力。本文以重組菌株E.coliBL21 (DE3)為研究菌株，通過探究溶氧和補(bǔ)料策略提高菌體密度，在此條件下確定最佳誘導(dǎo)時間，大幅度提高了TPL酶活。在此基礎(chǔ)上，以高密度獲得的菌體進(jìn)行全細(xì)胞催化合成L-DOPA研究，全細(xì)胞催化具有操作簡便、穩(wěn)定性高、成本低和方便下游分離提取等優(yōu)勢[18-19]， 為L-DOPA的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種

本實驗室保存的重組大腸桿菌E.coliBL21 (DE3)。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(LB)(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10；固體培養(yǎng)基添加2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂粉。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(TB)(g/L)：甘油5，蛋白胨12，酵母提取物24，K2HPO42.31，K2HPO416.37。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油5，蛋白胨12，酵母提取物24，KH2PO42.31，K2HPO416.37，一水合檸檬酸1.1，MgSO4·7H2O 1，微量元素母液 1 mL。115 ℃滅菌20 min， 微量元素、一水合檸檬酸和MgSO4·7H2O分別單獨(dú)過濾除菌。

微量元素溶液(g/L)：CuCl2·2H2O 0.2，ZnSO4·7H2O 0.3，CaCl2·2H2O 1.5，CoSO4·7H2O 2.8，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.8，MnCl·4H2O 2，溶于1 mol/L HCl中。

補(bǔ)料母液(g/L)：甘油500。

1.2 實驗器材

T&J Atype 5 L發(fā)酵罐，上海迪必爾生物工程有限公司；ZQZY-80AS振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器公司；高壓蒸汽滅菌鍋,上海民儀電子有限公司；UV-2450紫外可見分光光度計,日本島津公司；AvantiJ-25落地式高速冷凍離心機(jī),美國貝克曼庫爾特有限公司；Agilent 1260 System高效液相色譜儀,美國安捷倫科技公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子活化

將在-80 ℃保藏的甘油管中的菌液劃線至帶有卡那霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板上。37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，從平板上挑取單菌落接種于含有25 mL LB液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，卡那霉素終濃度為50 mol/L。37 ℃，220 r/min培養(yǎng)8～10 h，即為種子液。

1.3.2 搖瓶培養(yǎng)

將活化后的種子液以1%的接種量接種至25 mL TB培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時，降溫至25 ℃，加入終濃度為0.2 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(Isopropyl-β-D-Thiogalactoside, IPTG)進(jìn)行誘導(dǎo)。

5 L發(fā)酵罐中，裝液量2.5 L，接種量2%。接種前發(fā)酵罐內(nèi)加入卡那霉素至50 μg/mL，用25%(體積分?jǐn)?shù))氨水和25%(體積分?jǐn)?shù))H3PO4控制pH值為7.0，通氣量2.5 L/min。分別設(shè)置400、500、600和700 r/min四種不同的轉(zhuǎn)速，考察轉(zhuǎn)速對TPL表達(dá)和L-DOPA產(chǎn)量的影響。

1.3.4 DO-stat流加控制培養(yǎng)

在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，采用DO-stat補(bǔ)料策略[20-21]向罐內(nèi)流加500 g/L的甘油。有研究發(fā)現(xiàn)溶氧維持在30%～40%時有利于重組大腸桿菌的生長和外源蛋白的高表達(dá)，因此分別考察了20%、30%、40%和50%四個不同溶氧水平對TPL的表達(dá)的影響。

1.3.5 誘導(dǎo)策略的優(yōu)化

在DO-stat補(bǔ)料的基礎(chǔ)上，分別在菌體生長的對數(shù)前期、對數(shù)中期和對數(shù)后期加入誘導(dǎo)劑，以確定TPL最優(yōu)表達(dá)的誘導(dǎo)時間。

1.3.6 粗酶液的制備及酶活測定

將發(fā)酵液于4 ℃，7 000 r/min離心10 min，收集菌體，用pH 7.0、50 mmol/L的磷酸鉀緩沖液離心洗滌細(xì)胞兩次。用pH 8.0、50 mmol/L的磷酸鉀緩沖液重懸菌體，稀釋至OD600為10，進(jìn)行超聲波破碎(破碎時間2 s， 間歇時間4 s)，破碎10 min，離心(1 200 r/min，10 min) 所得上清液即為粗酶液。

酶活的測定見文獻(xiàn)[9]。酶活單位定義為在30 ℃、pH 8.0的條件下，每分鐘水解L-酪氨酸產(chǎn)生1 μmol丙酮酸所需酶的量為一個酶活單位(U)。

壩址區(qū)主要物理地質(zhì)現(xiàn)象為基巖風(fēng)化，由于巖體較完整，礦物顆粒細(xì)微均勻，結(jié)構(gòu)致密，風(fēng)化程度相對較弱。強(qiáng)風(fēng)化帶表現(xiàn)為巖體裂隙發(fā)育，巖石棱角不清，錘擊易碎，斷面可見新鮮面，用鎬可挖掘。弱風(fēng)化帶裂隙較發(fā)育，巖石棱角可見，巖體多被切割成小塊狀，裂隙間有次生礦物充填，錘擊聲脆，斷口為新鮮面，不能用鎬挖掘，需爆破開挖。左岸基巖強(qiáng)風(fēng)化層厚2～3 m，弱風(fēng)化層厚4.0～6.0 m，右岸基巖強(qiáng)風(fēng)化層厚3～4 m，弱風(fēng)化層厚4.0～6.0 m，壩基強(qiáng)風(fēng)化層厚1.5～3.5 m，弱風(fēng)化層厚2～3 m。巖體中黑云角閃斜長片麻巖的風(fēng)化程度較變質(zhì)二長花崗巖強(qiáng)烈。

1.3.7 全細(xì)胞催化合成L-DOPA

將6 g/L(濕重)的菌體重懸于反應(yīng)體系中，體系組成為(g/L)：丙酮酸鈉15，鄰苯二酚10，乙酸銨30，EDTA 2，無水亞硫酸鈉4，用氨水調(diào)節(jié)pH值為8.5。搖瓶水平與發(fā)酵罐水平的轉(zhuǎn)化條件如表1所示。

表1 搖瓶與發(fā)酵罐上的L-DOPA轉(zhuǎn)化參數(shù)Table 1 L-DOPA conversion parameters on shake flasks and fermenters

注：搖瓶間歇補(bǔ)料措施為每隔1.5 h分別補(bǔ)加丙酮酸鈉和鄰苯二酚6和4 g/L，共補(bǔ)料3次；發(fā)酵罐連續(xù)補(bǔ)料措施為丙酮酸鈉與鄰苯二酚補(bǔ)加流速分別為9和6 g/(L·h)，連續(xù)補(bǔ)料4 h?！?”表示未檢測。

1.3.8 檢測方法

L-DOPA的測定：取反應(yīng)結(jié)束后的轉(zhuǎn)化液，加入1 mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，離心取上清，將上清液稀釋20倍后采用高效液相色譜儀檢測反應(yīng)體系中L-DOPA的含量。

HPLC檢測條件為：色譜柱：Agilent C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：V(乙腈)∶V(水)=2.4∶97.6，其中水溶液中含有0.08% (體積分?jǐn)?shù))的甲酸，柱溫30 ℃，流速1 mL/min，檢測波長280 nm。

甘油濃度的測定：采用高效液相檢測[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的分批發(fā)酵

前期研究已經(jīng)在搖瓶上對重組菌的生長以及TPL的表達(dá)做了較全面的優(yōu)化，得到最佳接種量為1%，培養(yǎng)2 h加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)10 h后菌體質(zhì)量濃度達(dá)到21.5 g/L,酶活為0.98 U/mL。由于發(fā)酵罐與搖瓶培養(yǎng)環(huán)境相差很大，發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件不可完全套用搖瓶條件。為了解重組菌在罐上的生長特性，首先在5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行分批發(fā)酵培養(yǎng)，參考搖瓶條件進(jìn)行放大實驗。發(fā)酵過程中菌體濃度、pH、溶氧和甘油消耗的變化曲線如圖1所示。

圖1 重組E. coli BL21分批發(fā)酵過程曲線Fig.1 Process curve of batch fermentation with recombinant E. coli BL21

由圖1可知，0～2 h為菌體生長的延遲期，此時菌體在適應(yīng)發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)環(huán)境，生長緩慢，甘油消耗較慢；3～8 h為菌體生長對數(shù)期，菌體濃度迅速增加，甘油消耗速率加快，溶氧濃度最低降至14%，在發(fā)酵4 h時進(jìn)行降溫誘導(dǎo)，溶氧出現(xiàn)回升，之后隨著發(fā)酵液中甘油濃度的降低，溶氧持續(xù)升高；8～12 h為減速生長期，碳源基本耗盡，菌體生長緩慢，12 h菌體量達(dá)到最高；12～16 h細(xì)胞開始裂解，菌濃開始下降，為衰亡期。整個發(fā)酵過程中pH呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢，但整體波動幅度較小，較為穩(wěn)定。最終菌體OD600達(dá)到31.2，TPL酶活為0.9 U/mL，全細(xì)胞反應(yīng)后測得L-DOPA產(chǎn)量為18.3 g/L。根據(jù)分批培養(yǎng)結(jié)果將大腸桿菌在5 L發(fā)酵罐上的發(fā)酵周期定為12 h。

2.2 誘導(dǎo)溫度對重組菌的生長以及TPL表達(dá)的影響

在分批培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)溫度是影響菌體生長和蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素。大腸桿菌的最適生長溫度為37 ℃，而細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)酶的最適溫度與菌體的最適生長溫度可能存在一定差異。溫度較高時，蛋白表達(dá)過快易形成包涵體。因此，酶的生產(chǎn)溫度往往低于菌體最適生長溫度。發(fā)酵過程中在誘導(dǎo)產(chǎn)酶之前，主要是追求菌體的快速生長，因此選擇37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)；添加誘導(dǎo)劑時，將溫度調(diào)節(jié)至15、20、25和30 ℃，考察不同誘導(dǎo)溫度對菌體生長和TPL表達(dá)的影響(圖2、圖3)。

圖2 誘導(dǎo)溫度對菌體生長和TPL酶活的影響Fig.2 Effects of induction temperature on cell growth and TPL activity

M-蛋白質(zhì)marker，1～4分別代表誘導(dǎo)溫度為15、20、25和30 ℃的全細(xì)胞蛋白電泳圖3 不同誘導(dǎo)溫度對TPL蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of induction temperature on TPL protein expression level

由圖2可以看出，分別控制誘導(dǎo)溫度為15、20、25和30 ℃時，誘導(dǎo)12 h后菌體濃度分別為11.2、23.2、29.1和28.6，TPL酶活分別為0.43、0.72、0.93和0.85 U/mL，誘導(dǎo)溫度為25和30 ℃條件下，菌體濃度和TPL酶活都相差不大，但兩者在25 ℃條件下都略高于30 ℃，并且25 ℃誘導(dǎo)情況下TPL蛋白表達(dá)量最高(圖3)。根據(jù)以上結(jié)果，選擇25 ℃為最佳誘導(dǎo)溫度。

2.3 攪拌轉(zhuǎn)速對酪氨酸酚裂解酶分批發(fā)酵的影響

在發(fā)酵過程中，溶解氧濃度是影響菌體生長以及外源蛋白表達(dá)的關(guān)鍵因素，攪拌轉(zhuǎn)速是有效調(diào)節(jié)發(fā)酵液中溶氧狀態(tài)的主要條件之一，但過高攪拌轉(zhuǎn)速產(chǎn)生的剪切力也會對菌體的生長產(chǎn)生影響[23-24]，故在5 L發(fā)酵罐上分別設(shè)置轉(zhuǎn)速為400、500、600和700 r/min，考察其對細(xì)胞生長及TPL的表達(dá)的影響，結(jié)果如圖4所示。

A-甘油濃度;B-菌體濃度;C-溶氧濃度;D-TPL酶活圖4 攪拌轉(zhuǎn)速對甘油濃度、菌體濃度、溶氧濃度和TPL酶活的影響Fig.4 Effects of stirring speeds on glycerol concentration,bacteria concentration, dissolved oxygen solubility and TPL enzyme activity

不同的攪拌轉(zhuǎn)速對甘油消耗速率以及溶氧濃度的變化影響不大，在發(fā)酵8 h甘油質(zhì)量濃度均低于1 g/L； 對菌體生長和TPL酶活的影響較為明顯。轉(zhuǎn)速較低時，菌體生長過程中尤其是在對數(shù)生長期，溶氧一直維持較低的水平，限制了細(xì)胞的生長，因此轉(zhuǎn)速為400 r/min時(圖4-B)，菌體生長速率較慢，OD600最終達(dá)到23.3,明顯低于其他3種較高轉(zhuǎn)速。而轉(zhuǎn)速較高時，隨之產(chǎn)生的剪切力可能會影響菌體生長，當(dāng)攪拌轉(zhuǎn)速為500 r/min時，相較于600 r/min (OD600=30.8)和700 r/min (OD600=32.6)更利于菌體的生長，最終獲得細(xì)胞濃度為35.1，比400 r/min提高了50.6%。500 r/min 時TPL最終酶活達(dá)到1.1 U/mL，相比于400 r/min (0.9 U/mL)、600 r/min(0.93 U/mL)和700 r/min (0.82 U/mL)分別提高了22.2%、18.2%和34.1%。固定攪拌轉(zhuǎn)速會使整個發(fā)酵過程中溶氧出現(xiàn)過高或過低的情況，均不利于菌體生長和酶的表達(dá)，后續(xù)研究中需進(jìn)一步探究控制溶氧的策略。

2.4 DO-Stat流加控制培養(yǎng)

由上述研究可發(fā)現(xiàn)，固定的攪拌轉(zhuǎn)速在發(fā)酵前期易導(dǎo)致溶氧過低，菌體生長的對數(shù)期溶氧甚至?xí)陀?0%，不利于菌體生長；而發(fā)酵后期由于碳源的缺乏溶氧會維持在較高水平，而過高的溶氧濃度也不利于菌體生長和蛋白表達(dá)。為了進(jìn)一步提高菌體量和TPL表達(dá)量，結(jié)合溶氧濃度調(diào)控與補(bǔ)料策略，采用DO-Stat反饋流加甘油將整個發(fā)酵過程中的溶氧水平控制在一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)。考察了20%、30%、40%和50%四個溶氧水平對菌體的生長、TPL酶活以及多巴產(chǎn)量的影響。整個發(fā)酵過程在分批補(bǔ)料發(fā)酵模式下進(jìn)行，當(dāng)溶氧濃度回升到各預(yù)調(diào)控水平時開始進(jìn)行DO-Stat培養(yǎng)，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，采用DO-Stat反饋控制培養(yǎng)可以成功將發(fā)酵液中的溶氧濃度控制各設(shè)置水平(圖5-C)。發(fā)現(xiàn)不同溶氧條件下菌體生長趨勢相同，2～6 h為菌體生長的對數(shù)期，甘油迅速消耗，耗氧速率加快，之后菌體生長逐漸變慢，導(dǎo)致發(fā)酵液中甘油量逐漸積累(圖5-A)。分別控制溶氧濃度為20%、30%、40%和50%時，得到最終菌體濃度分別為36.8、32.4、35和33.2，比較發(fā)現(xiàn)20%的溶氧濃度更適合菌體生長(圖5-B)。

A-甘油濃度；B-菌體濃度;C-溶氧濃度;D-TPL酶活圖5 溶氧水平對甘油濃度、菌體濃度、溶氧濃度和TPL酶活的影響Fig.5 Effects of dissolved oxygen on glycerol concentration, bacteria concentration, dissolved oxygen concentration and TPL activity

誘導(dǎo)后的2 h，菌體正處于生長對數(shù)期，酶活迅速提高，而當(dāng)菌體進(jìn)入穩(wěn)定期后，隨著誘導(dǎo)時間的延長，酶活緩慢提高，因此提前誘導(dǎo)時間可能會有利于酶活的提高。12 h發(fā)酵結(jié)束后，控制DO為20%時，獲得的菌體濃度雖然最高，但TPL酶活為1.42 U/mL；而控制DO為30%和40%時，酶活均高于控制DO為20%時，分別為1.47和1.55 U/mL，而繼續(xù)提高溶氧濃度至50%，酶活又降低至1.35 U/mL，結(jié)果表明適當(dāng)?shù)奶岣呷苎鯘舛扔欣诖龠M(jìn)酶的表達(dá)。

根據(jù)上述結(jié)果，為了進(jìn)一步驗證不同溶氧濃度對TPL表達(dá)的影響，提出兩階段控制溶氧策略：即誘導(dǎo)前控制溶氧在20%，誘導(dǎo)后分別控制溶氧濃度在20%和40%，比較不同溶氧濃度對TPL表達(dá)的影響。誘導(dǎo)后每隔1 h取樣，將收集的細(xì)胞進(jìn)行超聲破碎，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)果見圖6。

不同溶氧溶度對TPL蛋白表達(dá)的影響較大，誘導(dǎo)后控制溶氧在40%時TPL蛋白表達(dá)量明顯高于20%的溶氧濃度。由此可見，較高的溶氧更利于TPL的表達(dá)，兩階段控制溶氧一方面能在發(fā)酵前期盡可能多的獲得菌體量，另一方面又能使誘導(dǎo)后TPL蛋白更高效的表達(dá)。經(jīng)全細(xì)胞催化后，溶氧為20%時得到的菌體催化生產(chǎn)L-DOPA產(chǎn)量為23.4 g/L；溶氧 為40%時得到的菌體催化生產(chǎn)L-DOPA產(chǎn)量為28.4 g/L。

A-20% DO;B-40%DOM-蛋白質(zhì)Marker，1～6分別代表誘導(dǎo)1、2、3、4、5和6 h的全細(xì)胞蛋白電泳圖6 誘導(dǎo)后不同溶氧濃度對TPL蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effects of dissolved oxygen concentration on TPL protein expression level after induction

2.5 誘導(dǎo)起始時間的優(yōu)化

基于2.3的研究結(jié)果，進(jìn)一步研究誘導(dǎo)開始時間對TPL表達(dá)以及多巴產(chǎn)量的影響。分別在菌體生長的對數(shù)前期(OD600=7)、對數(shù)中期(OD600=14)和對數(shù)后期(OD600=25)加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)(以上3種條件誘導(dǎo)前DO均控制在20%左右，誘導(dǎo)后DO均控制在40%左右)，結(jié)果如圖7所示。在對數(shù)前期、中期和后期誘導(dǎo)所獲得的最高細(xì)胞濃度分別為51.2、36.8和33.6，相比于優(yōu)化前分別提高了64.1%、17.2%和7.6%，最高酶活分別為2.4、1.9和1.7 U/mL，較分批培養(yǎng)分別提高了170%、111%和92.2%。在前期進(jìn)行誘導(dǎo)，菌體生長速度和TPL酶活均高于中期誘導(dǎo)和后期誘導(dǎo)，且在誘導(dǎo)后7 h菌體濃度達(dá)到最高，這可能由于流加甘油時間較早，且甘油總量高于其他兩種誘導(dǎo)策略，為菌體的生長提供了充足的碳源。有報道提出誘導(dǎo)期間流加甘油可以促進(jìn)酶的表達(dá)[20]。前期誘導(dǎo)時，在誘導(dǎo)后7 h，隨著菌體濃度的下降，TPL酶活也開始降低，由此可知，提前加入誘導(dǎo)劑不僅提高了菌體濃度和酶活，還縮短了整個發(fā)酵周期，發(fā)酵時間可由之前的12 h縮短為10 h。進(jìn)一步比較了不同誘導(dǎo)起始時間對多巴產(chǎn)量的影響，結(jié)果表明，在菌體生長的對數(shù)前期進(jìn)行誘導(dǎo)最終獲得的L-DOPA 產(chǎn)量最高，為34.2 g/L，相較于分批發(fā)酵提高了46.5%(圖8)。

A-菌體生長;B-TPL酶活圖7 誘導(dǎo)起始時間對菌體生長和TPL酶活的影響Fig.7 Effects of induction time on cell growth and TPL activity

圖8 誘導(dǎo)起始時間對L-DOPA濃度的影響Fig.8 Effects of initial induction time on L-DOPA concentration

對分批培養(yǎng)、兩階段控制溶氧以及優(yōu)化誘導(dǎo)策略后的最終結(jié)果進(jìn)行了比較分析(表2)。可以看出，與分批培養(yǎng)相比，兩階段控制溶氧與對數(shù)前期進(jìn)行誘導(dǎo)的培養(yǎng)模式，更有利于菌體的生長和重組蛋白的表達(dá)，從而使單位時間、單位發(fā)酵液體積內(nèi)細(xì)胞的得率以及TPL酶活有較大幅度的增加。因此，在菌體生長階段和酶的表達(dá)階段，通過補(bǔ)加營養(yǎng)成分從而控制不同的溶氧水平，可實現(xiàn)菌體的高密度生長以及蛋白的高水平表達(dá)，從而實現(xiàn)L-DOPA的高產(chǎn)量合成。

表2 不同高密度發(fā)酵策略的參數(shù)對比Table 2 Comparison of related parameters in high cell density cultivation for production of recombinant TPL in different stages

3 結(jié)論

目前國內(nèi)市場上的L-DOPA藥物主要靠進(jìn)口，隨著中國老齡化現(xiàn)狀的加劇，如何實現(xiàn)微生物酶法合成L-DOPA在國內(nèi)的工業(yè)化生產(chǎn)已經(jīng)成了亟待解決的問題。國內(nèi)主要通過基因工程技術(shù)對不同來源的TPL進(jìn)行定向改造以及對TPL催化合成L-DOPA的過程進(jìn)行優(yōu)化[25-26 ]，通過提高TPL酶活最終達(dá)到L-DOPA 的高效合成。關(guān)于TPL的高密度培養(yǎng)鮮有報道。本文考察了溶氧和誘導(dǎo)策略等因素對異源表達(dá)TPL蛋白的重組大腸桿菌生長及目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-DOPA產(chǎn)量的影響。通過確立兩階段控制溶氧策略和起始誘導(dǎo)時間，在5 L發(fā)酵罐上實現(xiàn)了重組菌株E.coliBL21 (DE3)的高密度發(fā)酵生長，并建立了分批補(bǔ)料培養(yǎng)工藝，使得TPL重組蛋白高效表達(dá)。最終得到細(xì)胞51.2 g/L，TPL酶活2.43 U/mL，結(jié)合連續(xù)流加底物策略，多巴最終產(chǎn)量達(dá)56.58 g/L，較分批發(fā)酵分別提高了64.1%、170%和209.2%。有關(guān)高密度培養(yǎng)生產(chǎn)TPL的優(yōu)化策略對左旋多巴酶法合成的放大實驗具有一定的參考意義。