2型糖尿病大鼠各組織及體液中鋅、鎂、銅、鐵、鈣五種元素的變化規(guī)律

龔 頻， 劉 萌， 李曉凡， 文 和

(陜西科技大學 食品與生物工程學院， 陜西 西安 710021)

0 引言

流行病學調(diào)查顯示，我國大約有1.14億糖尿病患者，糖尿病發(fā)病率已經(jīng)達到11.6%.2017年國務院辦公廳印發(fā)《中國防治慢性病中長期規(guī)劃(2017～2025年)》中指出糖尿病是我國慢性病中長期防治工作的重點領域.由于糖代謝障礙，2型糖尿病病人常常伴有微量元素鎂( Mg) 、鐵( Fe) 、鋅( Zn) 、銅( Cu) 、鈣( Ca) 的代謝紊亂，可能是由于這些元素在糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著特定的作用[1-4]，這些必需元素的缺乏或過量可能造成病情的加重[5,6].

本實驗以高脂高糖和鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病大鼠模型為研究對象，對大鼠各組織及體液中的鋅、銅、鎂、鈣、鐵五種元素進行含量測定，通過比較正常組及高脂高糖組大鼠各組織及體液中的元素含量，觀察其變化規(guī)律，闡明糖尿病必需元素變化的規(guī)律，從而為2型糖尿病的防治提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

1.1.1 實驗材料

清潔級SD大鼠30只，雄性(♂) ，體重約190～220 g，于西安交通大學醫(yī)學部實驗動物中心購買.

生理鹽水，購于西安雙鶴制藥有限公司；磷酸氫二鈉、ZnSO4·7H2O、磷酸二氫鈉,購于成都金山化工試劑廠；濃硝酸、CH3COONa,購于天津市河東區(qū)紅巖試劑廠；硫酸鐵銨、MgSO4·7H2O,購于天津市天力化學試劑有限公司；CuSO4·5H2O，購于天津市巴斯夫化工有限公司；CaSO4·2H2O，購于天津市科密歐化學試劑有限公司.

1.1.2 實驗儀器

TDL-40B型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；PHS-3C型精密PH計，上海雷磁儀器公司；Z-2000型塞曼偏振光原子吸收光譜儀，日本HITACHI公司；SX-4-10型馬弗爐，北京科偉永興儀器公司.

1.2 實驗動物模型建立

30只大鼠適應性喂養(yǎng)兩周，自由進水進食，兩周后將大鼠完全隨機分為3組，每組10只(K、G、S).K組為空白組，普通飼料喂養(yǎng)；G組為高脂高糖組，高脂高糖飼料喂養(yǎng)；S組為損傷組，高脂高糖飼料喂養(yǎng).高脂高糖飼料成分配比如表1所示.

表1 高脂高糖飼料成分配比(%)

六周后，S組大鼠一次性腹腔內(nèi)注射STZ 30 mg/kg(溶于0.1 mmol/L檸檬酸緩沖液pH 4.4)，K、G組大鼠注射檸檬酸緩沖液pH 4.4.兩天后，每日清晨對大鼠稱重，觀察大鼠生長情況，并進行血糖樣本采集.

一般在禁食12小時后，尾靜脈取血，采用羅氏血糖儀測其空腹血糖值(FBG )，驗證模型搭建是否成功.

1.3 檢測方法

1.3.1 組織中的元素含量檢測

采用火焰法原子吸收光譜儀檢測大鼠組織中各元素含量.

(1)組織中Zn2+含量檢測

①鋅標準曲線的繪制

準確稱取 ZnSO4·7H2O，用雙蒸水溶解成含 Zn2+為1 mg/L 的儲備液，使用前逐級稀釋為0.8、0.6、0.4、0.2 mg/L 的標準液，于-4 ℃冷凍保存.測量時，按照Zn2+濃度從小到大的梯度依次進樣，測定不同濃度下 Zn2+溶液的吸光值，繪制鋅溶液標準曲線.

②待測樣品制備

準確稱取一組，3份新鮮組織(包括空白組、高脂高糖組、損傷組)，置于坩堝內(nèi)，按順序置于馬弗爐中，500 ℃灰化6 h后，自然冷卻，用10 mL混酸分三次溶解樣品殘渣，過濾，最后將樣品組織的混酸溶液轉(zhuǎn)移集中，于-4 ℃冷凍保存.

③樣品鋅元素的測定按照硫酸鋅標準液中Zn2+濃度從小到大的順序依次進樣，取得標準曲線.當R2>0.99時，開始進行樣品測量.記錄數(shù)據(jù)，實驗重復3次，取平均值，繪制大鼠各組織Zn2+含量圖.

(2)組織中其余元素含量檢測

均與鋅元素相同.

1.3.2 血清中的元素含量檢測

采用火焰法原子吸收光譜儀進行檢測.采用65% HNO3和30% H2O2作為消解試劑，前處理方法為0.25 mL血清，加入0.8 mL 65% HNO3和0.2 mL 30% H2O2，水浴鍋中90 ℃加熱消解3 h后，用雙蒸水稀釋至10 mL，于-4 ℃冰箱冷凍保存待測.測量時依舊先繪制標準曲線，當R2>0.99時，開始進行樣品測量.記錄數(shù)據(jù)，實驗重復3次，取平均值.

1.3.3 尿液中的元素含量檢測

建立尿液中元素直接稀釋的火焰法原子吸收光譜進行分析.將待測量尿樣進行多次過濾，每個尿樣取量2 mL于10 mL的離心管稀釋至最高刻度，于-4 ℃冰箱冷凍保存待測.

測量時依舊先繪制標準曲線，當R2>0.99時，開始進行樣品測量.記錄數(shù)據(jù)，實驗重復3次，取平均值[7].

2 結果與討論

2.1 Zn元素各組織及體液中的含量變化

如圖1 所示，高脂高糖組大鼠及損傷組大鼠肝、腎、心、胰組織及血液中Zn2+的含量較空白組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05,p<0.01).高脂高糖組與損傷組大鼠尿液中Zn2+的含量較正常組顯著升高(p<0.01).

(a)Zn元素在各組織中的含量

(b)Zn元素在各體液中的含量圖1 Zn元素在不同組別各組織及體液中的含量

Zn2+與糖尿病的聯(lián)系十分緊密，其直接參與人體內(nèi)胰島素的生成、分泌、儲備、降解以及機體對胰島素的敏感性.Zn2+分布在β細胞顆粒中，能促進胰島素的結晶化，提高胰島素的穩(wěn)定性，并可調(diào)節(jié)胰島素的降糖作用，Zn2+同時也是糖代謝關鍵酶、3-磷酸甘油酸脫氫酶、乳酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶等的輔酶因子[8,9].葡萄糖誘導Zn2+細胞色素增加，這可能有利于胰島素的加工和儲存及其與Zn2+的共結晶，持續(xù)高血糖后Zn2+細胞因子的慢性增加可能導致某些形式的糖尿病中的β細胞功能障礙和死亡.

因而2型糖尿病大鼠肝、腎、心、胰組織及血液中的鋅含量減少可能與胰島細胞受損及數(shù)量減少相關，同時，尿液中的Zn2+含量上升，表明體內(nèi)流失的Zn2+主要通過尿液排泄，高脂高糖模型組Zn2+含量的變化介于正常組和損傷組之間，表明高脂高糖同樣也能夠引起體內(nèi)Zn元素的紊亂，最終誘導2型糖尿病的發(fā)生.

2.2 Cu元素在各組織及體液中的變化

如圖2所示，高脂高糖組大鼠及損傷組大鼠肝、腎、心、胰組織及血、尿液中Cu2+的含量較空白組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05,p<0.01,p<0.001).

銅是參與人體多種酶活性及代謝水平的微量元素，銅被吸收轉(zhuǎn)運后，主要以結合銅藍蛋白形成存在,可影響體內(nèi)代謝水平.

本研究中糖尿病大鼠血清中銅元素明顯高于正常組，與血漿銅藍蛋白減少及其結合活性降低有關，從而導致血漿中游離的銅增加.銅引起糖尿病的發(fā)病機制尚不明確，可能是由于鋅和銅在腸道吸收過程中競爭同一載體蛋白-金屬硫蛋白.銅增多時則會影響鋅的吸收，使得體內(nèi)鋅大量丟失，而鋅的減少會促使糖尿病的發(fā)生[10].通常糖尿病患者體內(nèi)銅含量增高，銅、鋅比值增大，機體出現(xiàn)高銅低鋅的狀態(tài)，銅的體內(nèi)平衡代謝異常會加劇鋅元素的平衡的改變.Kiza T G等[11]觀察到銅在糖尿病患者血清中含量較高.這也與本研究結果一致.

(a)Cu元素在各組織中的含量

(b)Cu元素在各體液中的含量圖2 Cu元素在不同組別各組織及體液中的含量

2.3 Mg元素在各組織及體液中的變化

如圖3所示，高脂高糖組大鼠及損傷組大鼠肝、腎、心、胰組織及血液中Mg2+的含量較空白組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05，p<0.01，p<0.001).高脂高糖組與損傷組大鼠尿液中Mg2+的含量較正常組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.01，p<0.001).

(a)Mg元素在各組織中的含量

(b)Mg元素在各體液中的含量圖3 Mg元素在不同組別各組織及體液中的含量

鎂離子是Na+-K+-ATP酶的重要激活劑，與ATP能否發(fā)揮正常作用相關，因此鎂離子會影響糖代謝過程中許多限速酶和其他重要酶類的生理活性.其含量的變化會直接影響到肝糖原的合成，導致糖異生酶的活性增強，胰島素對葡萄糖的反應受到抑制，同時低鎂的狀態(tài)還會使胰島α細胞釋放更多的胰高血糖素，因此，糖尿病組大鼠組織與血清中鎂元素含量減少.

糖尿病患者肝、腎、心、胰組織及血清鎂降低的機理可能為：(1)高血糖的滲透性利尿作用，造成鎂持續(xù)性地從尿中大量丟失；(2)大量的葡萄糖濾入原尿與鎂互相競爭，從而抑制了腎小管對鎂的重吸收；(3)糖尿病患者腎小管分泌鎂增多以及鎂被轉(zhuǎn)移到骨和細胞中；(4)外源性胰島素的應用可使尿鎂排泄增多及肌肉攝取鎂增加；(5)維生素D的代謝障礙影響腸道對鎂吸收.

2.4 Ca元素在各組織及體液中的變化

如圖4所示，高脂高糖組大鼠及損傷組大鼠肝、腎、心、胰組織及血液中Ca2+的含量較空白組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05,p<0.01,p<0.001).高脂高糖組與損傷組大鼠尿液中Ca2+的含量較正常組明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.01，p<0.001).

(a)Ca元素在各組織中的含量

(b)Ca元素在各體液中的含量圖4 Ca元素在不同組別各組織及體液中的含量

胰島素分泌是由胰島β細胞內(nèi)鈣離子的迅速升高直接觸發(fā)的，鈣代謝紊亂在糖尿病患者發(fā)病過程中也非常明顯[12].糖尿病大鼠胰島素降糖功能下降，所以鈣元素在組織與血液中的含量減少，但實驗中大鼠血液中鈣含量未出現(xiàn)明顯下降，其原因與骨鈣動員結果相關.如果血糖病情長期控制欠佳，即會導致鈣流失，最終則引起骨質(zhì)疏松.

2.5 Fe元素在各組織及體液中的變化

如圖5所示，高脂高糖組大鼠及損傷組大鼠肝、腎、心、胰組織及血液中Fe2+的含量較空白組明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義(p<0.05,p<0.01,p<0.001),而尿液中鐵元素含量極低，無法得到有效數(shù)據(jù)，推測鐵元素經(jīng)由尿液排泄量極少，沒有具有統(tǒng)計學意義的數(shù)據(jù).

(a)Fe元素在各組織中的含量

鐵元素在氧氣運輸和儲存方面有著重要作用，體內(nèi)鐵元素缺乏所導致的氧氣含量降低，使得有氧氧化進程受阻，影響TCA循環(huán)，糖異生及其他營養(yǎng)物質(zhì)的代謝[13,14]；同時氧氣含量低使胰島素分泌合成受阻，影響血糖穩(wěn)定.

3 結論

糖尿病是一種內(nèi)分泌紊亂引起的疾病，其發(fā)病機理尚不明確，已有研究表明微量元素與糖尿病發(fā)生存在一定關系.本實驗通過以高脂高糖飲食加鏈脲佐菌素誘導的2型糖尿病大鼠模型為研究對象，分析2型糖尿病大鼠模型肝、腎、心、胰組織及血、尿液中的必需元素含量，探討其變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠肝、腎、心、胰組織及血清中Zn2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+的含量顯著減少，Cu2+的含量顯著增加.同樣也發(fā)現(xiàn)糖尿病組大鼠尿液中Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ca2+、Fe2+的含量顯著增加.因此高脂高糖聯(lián)合STZ能夠加速體內(nèi)五種元素的紊亂，促進2型糖尿病的發(fā)生.

研究表明體內(nèi)銅增多導致大量鋅元素丟失，鋅元素不僅可以調(diào)節(jié)胰島素的降糖作用，同時也可提高胰島素的穩(wěn)定性，鋅的含量可直接影響胰島素的合成與活性.當體內(nèi)缺鋅時，胰島素原有的轉(zhuǎn)化率降低，使體液中胰島素水平降低，血糖濃度升高，兩種元素的紊亂更進一步加重糖尿病的病情；鈣通量的改變可能會影響β細胞分泌功能，使胰島素釋放異常，胞漿鈣穩(wěn)態(tài)變化將導致2型糖尿病的發(fā)生；鎂含量低會影響胰島α細胞釋放增高胰高血糖素，從而導致血糖升高；鐵元素的缺乏會產(chǎn)生過多自由基，增強氧化應激，促進糖尿病的發(fā)生.

綜上所述，糖尿病患者的必需元素代謝紊亂與糖尿病的發(fā)生與發(fā)展存在著一定的關系[15]，必需微量元素水平的慢性改變可能促進與長期糖尿病相關的繼發(fā)并發(fā)癥的發(fā)展.因此調(diào)節(jié)必需微量元素，有助于對糖尿病的預防和治療.