體外法研究五株酵母菌對牛瘤胃代謝的復(fù)合效應(yīng)

趙亞軍，裴彩霞，劉強，鈔瑞敏，陳婧

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

近年來，活性酵母作為動物飼料添加劑應(yīng)用廣泛。據(jù)報道，反芻動物飼糧中添加活性酵母菌制劑對反芻動物瘤胃發(fā)酵、生產(chǎn)性能、產(chǎn)品質(zhì)量以及機體免疫水平等方面產(chǎn)生積極的作用[1～4]，在反芻動物添加劑領(lǐng)域具有非常大的潛力和發(fā)展空間。目前，關(guān)于酵母菌的研究很多，但研究結(jié)果存在一定差異。Dawson等[5]試驗發(fā)現(xiàn)奶牛日糧中添加酵母菌制劑可以增加瘤胃活菌的數(shù)量；Erasmus等[6]發(fā)現(xiàn)酵母添加劑使奶牛MCP合成有增加趨勢；張棋煒等[7]研究發(fā)現(xiàn)，添加復(fù)合酵母發(fā)酵飼料能夠增加發(fā)酵液的產(chǎn)氣量，提高NH3-N含量，促進乙酸、丁酸和TVFA的生成；李常瑞等[8]研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合酵母可以提高底物的干物質(zhì)降解率和氨氮、VFA濃度，對瘤胃發(fā)酵具有一定的促進作用。這些差異可能是由于菌株的不同引起的，而不同酵母菌間的復(fù)合效應(yīng)尚未見報道。

本試驗擬研究高精料條件下，通過研究5株單一酵母及其不同組合對牛瘤胃發(fā)酵液參數(shù)的影響，以探討不同酵母菌間的復(fù)合效應(yīng)，為反芻動物生產(chǎn)中優(yōu)質(zhì)、高效復(fù)合酵母菌株的篩選及其營養(yǎng)生理調(diào)控研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis,I)、釀酒酵母A(SaccharomycescerevisiaeA,Ⅱ)、釀酒酵母B(SaccharomycescerevisiaeB,Ⅲ)、釀酒酵母C(SaccharomycescerevisiaeC,IV)和熱帶假絲酵母(Candidatropicalis,V)等5株酵母菌均由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物營養(yǎng)實驗室提供。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理

試驗選取2頭體況良好安裝有永久性瘤胃瘺管(內(nèi)徑約8 cm)的晉南牛作為瘤胃液供體。試驗動物單欄飼養(yǎng)，試驗前分別進行免疫和驅(qū)蟲處理。飼糧按精粗比65:35配制(精料組成為玉米66.8%，豆粕30%，石粉1.6%，食鹽0.6%，預(yù)混料1%；粗料為青貯玉米秸稈)分別于每日08:00與20:00各飼喂一次，自由飲水。

1.3 試驗方法

1.3.1 人工瘤胃緩沖液配制

人工瘤胃緩沖液在厭氧條件下配制，其各組分參照Menke等[9]的方法配制，組成見表1。單株酵母添加劑活菌數(shù)為1×108CFU·30 mL-1，2株酵母及3株酵母組合添加劑分別按體積(V/V)1∶1、1∶1∶1配制，使各組合的活菌數(shù)達到1×108CFU·30 mL-1。

1.3.2 瘤胃液的采集

晨飼前2 h通過瘤胃瘺管采集2頭牛瘤胃液并按1∶1(V/V)的比例混合，混合好的培養(yǎng)液投入充滿CO2的保溫箱(39 ℃)，預(yù)熱迅速帶回實驗室。

表1 人工瘤胃緩沖液各組分組成Table 1 Composition of artificial rumen buffer

1.3.3 體外培養(yǎng)

試驗所用飼料與供體動物飼喂的飼料一致，飼料原料于65 ℃下烘干后粉碎并過2 mm目篩，每個發(fā)酵管及發(fā)酵瓶分裝300 mg培養(yǎng)底物。試驗設(shè)對照組(培養(yǎng)液)、單一酵母菌處理(單一酵母培養(yǎng)液)和復(fù)合酵母處理(復(fù)合酵母培養(yǎng)液)等多個處理，每個處理均設(shè)3個重復(fù)。將采集的瘤胃液測定pH值后經(jīng)4層紗布過濾，將瘤胃液與人工瘤胃緩沖液以1∶2(V/V)混合，制成人工瘤胃培養(yǎng)液。吸取培養(yǎng)液30 mL，注入已裝有樣品的發(fā)酵管及發(fā)酵瓶中，添加活性酵母，使活菌數(shù)達到1×108CFU·30 mL-1培養(yǎng)液，整個過程避免與空氣的直接接觸，在39 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，連續(xù)發(fā)酵48 h。

1.3.4 樣品的采集和測定

分別于發(fā)酵培養(yǎng)后3、6、9、12、18、24、36、48 h通過讀發(fā)酵管刻度記錄產(chǎn)氣量，并收集氣體，同時采用pH計(EC-pH510標(biāo)準(zhǔn)智能型臺式)測定發(fā)酵瓶收集的培養(yǎng)液pH值，并計算其平均值。發(fā)酵48 h后，測定pH值并分裝。置于-40 ℃冷凍保存。其中，用于測定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)的5 mL樣品中加入1 mL的25%偏磷酸巴豆酸；用于測定氨態(tài)氮濃度(NH3-N)的5 mL樣品中加入1 mL 20 g·L-1的硫酸。VFA、甲烷濃度采用TRACE-1300氣相色譜儀(Thermo Fisher Scientific，美國)進行測定，微生物蛋白(MCP)[10]、NH3-N濃度[11]采用比色法測定，總產(chǎn)氣量為各不同時間點產(chǎn)氣量之和[9]。

所有體外發(fā)酵試驗均設(shè)2次重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件中的One-way-Anova進行方差分析，用P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 5株酵母菌及其組合對體外發(fā)酵pH、飼料降解率、NH3-N濃度、MCP、產(chǎn)氣量和甲烷的影響

由表2可知，添加不同組合酵母菌對培養(yǎng)液pH值產(chǎn)生了不同影響。2株酵母組合中，I分別與Ⅱ、Ⅲ、IV、V組合后，Ⅲ分別與Ⅱ、IV、V組合后的pH值高于其中一株單菌，而與另一單菌無顯著差異；Ⅱ分別與IV、V組合后極顯著高于Ⅱ(P<0.01)，顯著高于IV、V(P<0.05)。3株酵母Ⅱ+Ⅲ+IV組合pH值顯著低于Ⅱ+Ⅲ(P<0.05)，Ⅱ+Ⅲ+V顯著低于Ⅲ+IV、Ⅲ+V(P<0.05)，Ⅱ+Ⅲ+IV、Ⅱ+IV+V極顯著低于Ⅱ+IV(P<0.01)。

降解率方面，2株復(fù)合酵母較單菌變化較小，僅IV+V顯著高于V(P<0.05)；3株復(fù)合菌中，Ⅱ+Ⅲ+IV顯著高于IV、Ⅲ+IV(P<0.05)，Ⅱ+IV+V顯著高于IV+V(P<0.05)。

NH3-N濃度方面，2株酵母組合中，I+IV、Ⅱ+IV、Ⅱ+V、Ⅲ+IV組合高于其中一株單菌，而與另一單菌無顯著差異；Ⅲ+IV、IV+V組合均顯著低于各單一菌株。3株菌中僅Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V組合NH3-N濃度顯著低于V(P<0.05)。MCP濃度方面，I、Ⅱ、Ⅲ、IV分別與V組合顯著高于V，而與另一單菌無顯著差異(P>0.05)；Ⅱ+Ⅲ+IV極顯著高于IV、Ⅱ+Ⅲ、Ⅲ+IV(P<0.01)；Ⅱ+IV+V極顯著高于IV、V(P<0.01)，顯著高于V、Ⅱ+V、IV+V(P<0.05)；Ⅱ+Ⅲ+V顯著高于V、Ⅱ+Ⅲ、Ⅱ+V(P<0.05)。

產(chǎn)氣方面，Ⅱ與I、Ⅲ組合低于其中一株單菌，而與另一單菌無顯著差異；Ⅱ分別與IV、V組合后極顯著低于Ⅱ(P<0.01)，顯著低于IV、V(P<0.05)；Ⅱ+Ⅲ+V顯著低于Ⅲ+V(P<0.05)。甲烷方面，I與Ⅱ、Ⅲ、IV、V組合后較各單菌均無顯著差異(P>0.05)；Ⅱ與Ⅲ、IV、V組合后甲烷含量低于其中一株單菌，而與另一單菌無顯著差異；3株菌Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V組合極顯著低于Ⅱ(P<0.01)。

2.2 5株酵母菌及其組合對體外發(fā)酵VFA的影響

由表3可知，在高精料下，培養(yǎng)液中2株酵母組合在乙酸、丙酸和異丁酸的比例以及乙丙比方面較各單一菌株均無顯著差異(P>0.05)，而3株酵母組合則產(chǎn)生了不同影響，其中，乙酸比例方面，Ⅱ+Ⅲ+IV顯著低于IV、Ⅱ+Ⅲ，Ⅱ+Ⅲ+V顯著低于Ⅱ、V、Ⅲ+V，Ⅱ+IV+V顯著低于Ⅱ、IV、Ⅱ+V(P<0.05)；Ⅱ+Ⅲ+V極顯著低于Ⅱ+Ⅲ、Ⅱ+V，Ⅱ+IV+V極顯著低于IV+V(P<0.01)。丙酸比例方面，Ⅱ+Ⅲ+IV顯著高于Ⅱ、IV、Ⅱ+Ⅲ、Ⅱ+IV(P<0.05)；Ⅱ+Ⅲ+V顯著高于Ⅱ+V、Ⅲ+V(P<0.05)；極顯著高于Ⅱ、Ⅲ、V、Ⅱ+Ⅲ(P<0.01)。同樣，Ⅱ+IV+V除顯著高于Ⅱ+V外，均極顯著高于組內(nèi)各單一及2株組合菌(P<0.01)。乙丙比方面，Ⅱ+Ⅲ+IV顯著低于Ⅱ、Ⅱ+IV(P<0.05)，極顯著低于IV、Ⅱ+Ⅲ(P<0.01)；Ⅱ+IV+V除顯著低于Ⅱ+V外，均極顯著低于組內(nèi)其他各單一及2株組合菌(P<0.01)；而Ⅱ+Ⅲ+V均極顯著低于組內(nèi)各單一及2株組合菌(P<0.01)。丁酸比例方面，Ⅱ+V、Ⅲ+V顯著低于Ⅱ、Ⅲ(P<0.05)，而與V無顯著差異。戊酸比例方面，I+IV、Ⅱ+IV、V+I、Ⅲ+IV、V+Ⅱ組合低于其中一株單菌，而與另一單菌無顯著差異。Ⅱ+Ⅲ+IV、Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V組合均極顯著高于組內(nèi)各單一及2株組合菌(P<0.01)。異戊酸比例方面，I+IV、I+V、Ⅲ+V組合低于其中一株單菌，而與另一單菌無顯著差異。Ⅲ+IV組合均極顯著低于Ⅲ、IV(P<0.01)。TVFA方面，I+IV、I+V、Ⅱ+IV、低于其中一株單菌，而與另一單菌無顯著差異。Ⅲ+IV、Ⅲ+V組合TVFA含量均顯著低于Ⅲ，分別顯著低于IV(P<0.05)，極顯著低于V(P<0.01)；3株菌Ⅱ+IV+V組合顯著低于IV、V(P<0.05)。

表2 酵母菌及其組合對體外發(fā)酵pH、飼料降解率、NH3-N濃度、MCP、產(chǎn)氣量和甲烷的影響Table 2 Effects of yeasts and their combinations on pH,degradation rate,NH3-N,MCP,gas production and methane production in vitro

注：2株酵母(α+β)：分別與“α、β”相比差異極顯著(P<0.01)標(biāo)記為“A、B”，差異顯著標(biāo)記為“a、b”(P<0.05)。3株酵母(ɑ+β+θ)：分別與“α、β、θ、α+β、α+θ、β+θ”相比差異極顯著(P<0.01)標(biāo)記為“A、B、C、D、E、F”，差異顯著標(biāo)記為“a、b、c、d、e、f”(P<0.05)。下表同。
Note:Two kinds of yeast (α+β):marked “A,B” with significantly different from “α,β”(P<0.01),and marked “a,b” with significant difference (P<0.05).Three kinds of yeast (ɑ+β+θ):marked “A,B,C,D,E,F” with extremely significantly different from “α,β,θ,α+β,α+θ,β+θ”(P<0.01),and marked “a,b,c,d,e,f” with significant difference (P<0.05).The same as below.

3 討論

瘤胃pH是評價瘤胃發(fā)酵環(huán)境的一項重要指標(biāo)。高精料飼糧模式下，反芻動物咀嚼行為減少，唾液分泌量降低使唾液對瘤胃的沖作用下降[12]，伴隨著VFA在瘤胃的沉積，導(dǎo)致瘤胃pH降低[13]。大量研究表明，酵母菌對穩(wěn)定瘤胃pH具有積極作用，能夠預(yù)防瘤胃酸中毒[14～16]。其作用機制可能是酵母菌促進了乳酸利用菌的增長從而緩解瘤胃pH的降低[17]，或酵母菌與作用在植物細(xì)胞壁上的微生物相互作用促進了纖維的降解[18]。本試驗中，Ⅱ+IV、Ⅱ+V組合pH值均顯著高于各單一菌株，說明Ⅱ+IV、Ⅱ+V在促進瘤胃乳酸利用菌增長或促進纖維降解方面存在復(fù)合效應(yīng)，能夠進一步緩解瘤胃pH值的降低，對維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要作用。

表3 酵母菌及其組合對體外發(fā)酵VFA的影響Table 3 Effects of yeasts and their combinations on VFA fermentation in vitro

2株酵母組合對底物降解率較單菌差異較小，這可能由于體外培養(yǎng)時間過短無法準(zhǔn)確評價酵母組合對底物纖維降解程度的影響[19]。Emmanuel等[20]、Gaafar等[21]試驗表明，酵母菌能夠刺激微生物生長，使瘤胃中的NH3大量轉(zhuǎn)化為微生物蛋白質(zhì)。本試驗中，2株酵母Ⅲ+IV、IV+V組合NH3-N濃度顯著低于各單一菌株，MCP含量顯著高于其中一株單菌，說明Ⅲ+IV、IV+V菌株組合在促進瘤胃微生物生長方面具有復(fù)合效應(yīng)，能夠使瘤胃中的NH3大量轉(zhuǎn)化為微生物蛋白質(zhì)，從而降低NH3-N濃度。

Lynch等[22]研究表明，在瘤胃微生物發(fā)酵苜蓿草的過程中添加活性酵母菌，能夠使甲烷產(chǎn)量降低20 %。Chaucheyras等[23]、Mwenya等[24]同樣發(fā)現(xiàn)，日糧中添加酵母可降低甲烷產(chǎn)量，并認(rèn)為其作用機制可能與氫利用的轉(zhuǎn)移有關(guān)。本試驗中，Ⅱ+IV、Ⅱ+V組合產(chǎn)氣量均顯著低于各單一菌株，甲烷產(chǎn)量顯著低于Ⅱ，與IV、V相比也有低的趨勢，說明菌株組合在減少甲烷產(chǎn)生方面存在復(fù)合效應(yīng)。

瘤胃VFA的產(chǎn)量和組成是評價瘤胃發(fā)酵方式和發(fā)酵能力的直接指標(biāo)。Erasmus等[25]在奶牛日糧中添加酵母制劑可以增加丙酸含量、降低乙丙比。同樣，鄧露芳[26]、Mutsvangwa等[27]研究發(fā)現(xiàn)，添加益生菌可促進丙酸比提高，乙酸比降低，乙丙比降低。本試驗中，2株組合酵母在乙酸、丙酸和異丁酸的比例以及乙丙比方面較單一菌株無顯著差異。3株酵母組合Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V較組內(nèi)各單一及2株組合菌存在極顯著降低乙酸比例、增加丙酸比例、降低乙丙比的現(xiàn)象，說明3株酵母組合Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V在調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵模式方面存在復(fù)合效應(yīng)。Thrune等[28]、周傳社等[29]研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加酵母培養(yǎng)物可使TVFA含量下降。本試驗中，Ⅲ+IV、Ⅲ+V組合TVFA含量顯著低于各單一菌株，存在復(fù)合效應(yīng)。此外，本試驗中，3株酵母Ⅱ+Ⅲ+IV、Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V組合戊酸比例極顯著高于組內(nèi)各單一及2株酵母菌組合，其來源一方面由碳水化合物合成；另一方面來自脯氨酸、精氨酸、賴氨酸和蛋氨酸的降解產(chǎn)物[30]，說明3株菌組合Ⅱ+Ⅲ+IV、Ⅱ+Ⅲ+V、Ⅱ+IV+V在促進戊酸形成方面存在復(fù)合效應(yīng)。

4 結(jié)論

本試驗發(fā)現(xiàn)，高精料條件下不同酵母組合對瘤胃發(fā)酵影響不同，在維持瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面，Ⅱ與IV和V存在復(fù)合效應(yīng)；Ⅲ和IV、IV和V在降低NH3-N濃度方面存在復(fù)合效應(yīng)。在調(diào)節(jié)瘤胃發(fā)酵模式方面，Ⅱ、Ⅲ和V以及Ⅱ、IV和V之間存在復(fù)合效應(yīng)，乙酸比例及乙丙比均顯著低于組內(nèi)各單一及2株組合菌，丙酸比例均顯著高于組內(nèi)各單一及2株組合菌；Ⅱ、Ⅲ和IV在戊酸形成方面存在復(fù)合效應(yīng)。其中，Ⅱ+IV、Ⅱ+V組合在維持瘤胃pH值、穩(wěn)定瘤胃內(nèi)環(huán)境方面效果顯著，是高精料條件下較為優(yōu)良的酵母組合菌株。