C反應蛋白-757 T>C基因變異與缺血性腦卒中的關(guān)系

張羽凡，柴玉梅，張 斌

(榆林市第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，陜西 榆林 718000)

隨著中國人口老齡化程度的加劇，腦血管病的發(fā)病率、致死率、復發(fā)率呈現(xiàn)上升趨勢，對人類健康造成了非常大的威脅[1]。截止目前，仍沒有很好的方法來預防缺血性腦卒中的發(fā)生，且臨床療效有限，因此，探討其發(fā)病機制，并對其危險因素進行有效干預非常關(guān)鍵。缺血性腦卒中是多種因素共同作用的結(jié)果，包括遺傳因素和環(huán)境因素，從根本上識別腦卒中的易感基因，早期檢出易感患者并進行干預，將對腦卒中的預防產(chǎn)生重大影響[2-3]。CRP 是在感染和組織損傷時急劇升高的急性期時相蛋白，是全身炎癥反應的重要標志之一[4]。作為炎癥反應的標志物，CRP已被證實對動脈粥樣硬化的發(fā)病及預后均具有重要作用[5]，而動脈粥樣硬化是缺血性腦卒中的危險因素，因此，有必要對CRP在缺血性腦卒中發(fā)生中的作用進行深入探討。因此，本研究旨在對CRP基因啟動子區(qū)-757T>C基因變異與缺血性腦卒中的關(guān)系進行闡述，以期對缺血性腦卒中的發(fā)病機制提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

自2016年3月至2017年5月，榆林市第一醫(yī)院收治的155例缺血性腦卒中患者納入本研究，其中，男性102例，女性53例，年齡50～75(56.3±7.8)歲，該組患者的診斷標準參照全國第四屆腦血管病學術(shù)會議修訂的診斷標準，并經(jīng)頭顱MRI/CT檢測進一步確診，且需排除如下疾病引起的缺血性腦卒中，如腫瘤、外傷、動脈炎、血液病或藥物等。同時，選取同時期本院體檢健康者120例作為對照組，其中男性74例，女性46例，年齡52～67(59.3±5.6)歲，且需滿足如下條件：無腦卒中及腦血管病史、無肝、腎相關(guān)疾病、無自身免疫性疾病及血液病和妊娠。

1.2 標本的收集與rs3093059 -757 T>C基因多態(tài)性的檢測

每名參與者均抽取空腹外周血3 mL，采用基因組DNA抽提試劑盒(北京博大泰克生物基因技術(shù)有限公司)進行DNA提取，DNA的含量采用紫外分光光度計法檢測，并調(diào)整DNA濃度至5 ng/μL。PCR引物的設計由Primer premier 5.0軟件完成，引物序列如下，F(xiàn)orward TTTGGTTTTTTGCATGGACACA；Reverse TGTCAGGGCCGTCATTTAGTG。由深圳華大基因股份有限公司合成。PCR擴增體系組成成分如下(25 μL)：基因組DNA 0.5 μg，MgCl2溶液0.3 mM，dNTPs 0.2 mM，2 U Taq DNA酶，0.2 μM引物和1×PCR緩沖液。反應條件如下：95℃ 1 min；95℃ 30 s、61℃ 30 s、72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 5 min。PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定PCR產(chǎn)物確為目的片段且無非特異性擴增產(chǎn)物后，直接送廣州英韋創(chuàng)津生物科技有限公司進行測序分析。

1.3 生化指標的檢測

抽取患者及健康對照者靜脈血3 mL，離心分離血清，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。采用雅培c16000全自動生化分析儀測定各組血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)：其中TC、TG的檢測采用酶比色法；HDL-C的檢測采用沉淀劑沉淀法和酶法相結(jié)合的方法；LDL-C由Friedwald公式：LDL-C=TC-HDL-C-TG/2.2計算。血清hs-CRP含量的測定采用免疫比濁法(德國西門子BN-II蛋白分析儀)。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS13.0軟件，以均數(shù)±標準差表示，采用χ2檢驗進行Hardy-Weinberg平衡分析?；颊呓M及對照組間基因型及等位基因頻率的比較采用χ2檢驗，兩組間生化指標的比較采用t檢驗，等位基因頻率與臨床生化指標的相關(guān)性分析采用χ2檢驗。關(guān)聯(lián)強度分析采用優(yōu)勢比(Odds ratio,OR)和95%可信區(qū)間(CI)進行。P<0.05被認為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料的比較

兩組在性別、年齡方面無顯著性差異(P>0.05)。而在高血壓、血脂異常及糖尿病比例、有無冠心病及飲酒比例方面兩組間差異顯著，上述指標均在腦卒中組顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1)。

表1 一般臨床資料的比較 [n(%)]

2.2 兩組生化指標的比較分析

兩組生化指標的統(tǒng)計結(jié)果見表2，與對照組相比，腦卒中組患者hs-CRP、TG、TC、LDL-C水平明顯升高，而HDL-C水平明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

表2 兩組生化指標的統(tǒng)計結(jié)果

2.3 Logistic回歸分析

Logistic回歸分析結(jié)果見表3。以腦卒中為因變量,以高血壓、糖尿病、冠心病和血脂異常及CRP -757T>C為自變量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高血壓、糖尿病、冠心病及hs-CRP水平均是缺血性腦卒中發(fā)生的獨立危險因素。

表3 Logistic回歸分析結(jié)果

2.4 CRP -757 T>C基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性分析

對不同的CRP -757 T>C基因型和等位基因在兩組的分布情況進行統(tǒng)計(見表4)，結(jié)果可見，腦卒中組CC純合子或-757 C等位基因頻率(21.29%和36.45%)顯著高于對照組(12.50%和27.92%)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與攜帶CRP -757 TT純合子的患者相比，攜帶CRP -757 TC基因型的患者發(fā)生腦卒中的危險性無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

表4 CRP -757 T>C在患者組與對照組的分布情況 [n(%)]

2.5 CRP -757 T>C基因多態(tài)性與臨床生化指標的相關(guān)性分析

腦卒中組TT+TC、CC基因型的血清hs-CRP濃度分別為1.21(0.77～1.54)mg/L，2.11(1.16～2.77) mg/L，兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。對照組TT+TC、CC基因型的血清hs-CRP濃度分別為0.87(0.79～1.23)mg/L，1.07(0.66～1.60) mg/L，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3 討論

腦卒中的發(fā)生受遺傳因素和環(huán)境因素共同調(diào)控。腦卒中患者血清CRP濃度受多種炎癥(感染、腫瘤及其他炎性疾病)因素影響，而此類患者常合并肺炎、深部靜脈血栓等并發(fā)癥，使得血清CRP的濃度難于評價，因此，有必要研究CRP遺傳因素與CRP濃度、腦卒中的關(guān)系。多項研究結(jié)果表明[6]，CRP-717A>G，+2147C>T等與缺血性腦卒中有相關(guān)性，而關(guān)于CRP-757T/C與缺血性腦卒中的相關(guān)性研究較少。因此，本研究擬對CRP-757T/C基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的相關(guān)性進行深入探討。

很多研究[7]均對CRP的基因變異與血清CRP間的相關(guān)性進行探討，結(jié)果顯示缺血性腦卒中患者CRP基因變異與血清CRP水平的相關(guān)性并不一致，有研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦卒中患者CRP基因變異與血清CRP水平的升高呈正相關(guān)，但腦卒中與CRP基因變異則呈負相關(guān)關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，高血壓、糖尿病、冠心病及CRP均是缺血性腦卒中發(fā)生的獨立危險因素,CRP-757T/C CC純合子和-757 C等位基因均與缺血性腦卒中顯著有關(guān)，且與CRP水平有明顯相關(guān)性。總之，CRP的基因變異與CRP水平、缺血性腦卒中之間有明顯的相關(guān)性，提示CRP-757T>C基因多態(tài)性可能會影響血清CRP的水平，這可能與缺血性腦卒中的發(fā)生有關(guān)。

總之，血清CRP濃度與缺血性腦卒中獨立相關(guān)。CRP基因的變異會影響血清CRP的水平，并參與動脈粥樣硬化及心腦血管事件的發(fā)生、發(fā)展。由于缺血性腦卒中受遺傳因素及獲得性因素共同作用，而CRP水平亦受多種因素影響，這就需要加大樣本量，進行更嚴格的分組對比，對該結(jié)果進行進一步驗證。同時，開展多地區(qū)、多種族人群的大規(guī)模前瞻性研究和譜系對此分析，將有助于明確CRP基因變異在缺血性腦卒中發(fā)生中的作用。