丁香總黃酮抗氧化活性研究

黃晶玲 江漢美 屠寒 孟佳敏 肖宇碩

摘要：以2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）對照品、槲皮素對照品和丁香（Eugenia caryophyllata Thunb.）揮發(fā)油為對照，對丁香總黃酮還原力、清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·自由基）能力進行了評價。結(jié)果表明，丁香總黃酮有較好的抗氧化活性，其還原力略低于陽性對照BHT而高于丁香揮發(fā)油，清除DPPH·自由基能力則隨濃度增大明顯增強，濃度達到0.15、0.20 mg/mL時，其DPPH·自由基清除率分別超過丁香揮發(fā)油和陽性對照BHT。

關(guān)鍵詞：丁香（Eugenia caryophyllata Thunb.）;總黃酮;抗氧化活性

中圖分類號：S567.1+9? ? ? ? ?文獻標識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）09-0117-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.09.028? ? ? ? ? ?開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Abstract： The antioxidant activity of total flavonoids from Caryophylli flos was studied with 2，6-tert butyl-4-methyl phenol （BHT）， quercetin， and essential oil from Caryophylli flos as reference， and the total reducing capacity and scavenging DPPH· free radical ability as evaluating indicator. The total flavonoids of Eugenia Cargophyllata Thunb. had better antioxidant activity，and its reducing power was slightly lower than that of positive control BHT and higher than that of essential oil from Caryophylli flos. The DPPH· free radical scavenging capacity increased obviously with the increase of concentration. When the concentration reached 0.15 and 0.2 mg/mL，DPPH· radical scavenging rate exceeded essential oil from Caryophylli flos and positive control BHT respectively.

Key words： Eugenia Caryophyllata Thunb.; total flavonoids; antioxidant activity

丁香又稱公丁香、丁子香等，系桃金娘科植物丁香（Eugenia Caryophyllata Thunb.）的干燥花蕾，花蕾由綠轉(zhuǎn)紅時采摘，為2015年版《藥典》收載品種。其味辛，性溫，歸肝、腎、脾、胃經(jīng)，有溫陽散寒、理氣止痛的功效[1]，為良好的芳香健胃劑[2]，主治呃逆、嘔吐、反胃等癥。丁香作為一種藥食兩用中藥[3]，已被收入《既是食品又是藥品的物品名單》，其資源豐富，是中國傳統(tǒng)進口“南藥”之一[4]，喜熱帶海洋性氣候，主要產(chǎn)于一些熱帶地區(qū)，如坦桑尼亞、印度尼西亞等地區(qū)[5]，因其具有極高的藥食兩用價值，中國海南、廣東、廣西、云南等沿海熱帶地區(qū)也相繼引種栽培，并獲得成功。丁香化學成分復雜，主要含有揮發(fā)油、黃酮、有機酸等成分[6]，黃酮類成分通常具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤以及增強免疫力等廣泛的藥理活性[7]。

目前，丁香的主要研究熱點是其揮發(fā)油[8]，尤其是丁香酚，其含量、藥理活性及其相關(guān)研究已較為透徹，對其他成分的研究報道則較少，現(xiàn)行《中國藥典》也僅對丁香酚這一活性成分作了定性和定量研究[1]，而作為一個復雜的整體，在活性成分上僅以一種成分來進行質(zhì)量控制，說服力不足，也不能較好詮釋中藥用藥特點。黃酮類成分通常有較好的抗氧化活性，而丁香總黃酮含量較高，含有槲皮素[9]、山奈酚、鼠李素[10]及苷類等黃酮類化合物，具有潛在的開發(fā)價值。對丁香總黃酮進行抗氧化活性研究，以期為丁香總黃酮更進一步的研究及應用奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 儀器

中藥材粉碎機（FW177，天津泰斯特儀器有限公司）;電子分析天平（CP225D，北京賽多利斯天平有限公司，d=0.01 mg）;恒溫水浴鍋（XMTD-2M，天津泰斯特儀器有限公司）;紫外-可見分光光度計（UV-3200，上海美譜達儀器有限公司）;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2? 試劑

丁香藥材，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學生藥教研室鑒定為桃金娘科植物丁香的干燥花蕾;丁香總黃酮粉末為實驗室自制;2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚對照品（BHT），Sigma-Aldrich公司;槲皮素對照品、丁香揮發(fā)油、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·），Sigma-Aldrich公司;無水乙醇、二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸、六水合三氯化鐵為分析純，國藥集團;三重蒸餾水。

1.3? 方法

1.3.1? 供試品溶液的制備? 分別取丁香總黃酮粉末、BHT對照品、槲皮素對照品和丁香揮發(fā)油50 mg，精密稱定，加乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，配制成濃度為0.5 mg/mL的供試品溶液，分別作為總黃酮儲備液、BHT儲備液、槲皮素對照品儲備液和丁香揮發(fā)油儲備液。

1.3.2? 試劑的配制

1）磷酸鹽緩沖液。稱取十二水合磷酸氫二鈉7.16 g、二水合磷酸二氫鈉3.12 g，分別加三重蒸餾水溶解并定容至100 mL，再分別取適量磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉溶液，混合均勻，二者占比分別為62.5%、37.5%，即得pH為6.6的磷酸鹽緩沖液（PBS），備用。

2）鐵氰化鉀溶液。稱取1.00 g鐵氰化鉀粉末，加三重蒸餾水定容至100 mL，即得1%鐵氰化鉀溶液，備用。

3）三氯乙酸溶液。稱取10.00 g三氯乙酸樣品，加三重蒸餾水定容至100 mL，即得10%三氯乙酸溶液，備用。

4）三氯化鐵溶液。稱取0.17 g六水合三氯化鐵樣品，加三重蒸餾水定容至100 mL，即得0.1%三氯化鐵溶液，備用。

5）DPPH·溶液。取DPPH·標準品25 mg，精密稱定，加無水乙醇溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，配制成濃度為0.5 mg/mL的DPPH·溶液，避光冷藏備用。

1.3.3? 還原力測定? 取10 mL EP管，依次加入2.0 mL PBS溶液、2.0 mL不同濃度總黃酮溶液（以總黃酮儲備液稀釋，濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL）、2 mL 1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻，于50 ℃恒溫水浴中保持20 min，再向EP管中加入2 mL 10%三氯乙酸溶液，混勻并離心。吸取上清液4 mL于另一10 mL EP管中，依次加入4 mL三重蒸餾水、1 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混合均勻，10 min后用紫外-可見分光光度計于710 nm處測定反應液吸光度，并以三重蒸餾水替代總黃酮溶液作為空白對照，以BHT、槲皮素對照品和丁香揮發(fā)油為對照。

1.3.4? 清除DPPH·自由基能力測定? 取10 mL EP管，依次加入2.0 mL不同濃度的總黃酮溶液（以總黃酮儲備液稀釋，濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL）、2 mL DPPH·溶液，并用無水乙醇稀釋至10 mL，混合均勻測吸光度A1。再取10 mL EP管，加入2 mL DPPH·溶液，用無水乙醇稀釋至10 mL，混合均勻測吸光度A0。向另一EP管中依次加入2 mL不同濃度總黃酮溶液，用無水乙醇稀釋至10 mL，混合均勻，作為空白對照，靜置30 min后，用紫外-可見分光光度計于517 nm處測定反應液吸光度A2，并以BHT、槲皮素對照品和丁香揮發(fā)油為對照。DPPH·自由基清除率計算公式為：

2? 結(jié)果與分析

2.1? 還原力

反應液吸光度與丁香總黃酮還原力正相關(guān)，吸光度越大表明還原力越強（圖1）。從圖1可以看出，4種供試樣品均有一定的還原力，相比于陽性對照BHT，丁香總黃酮還原力與其相當，僅稍微低于BHT。槲皮素對照品還原力要遠高于丁香總黃酮，在4種供試樣品中還原力最強，丁香揮發(fā)油還原力則略低于丁香總黃酮，4種供試樣品還原力強弱順序為槲皮素對照品>BHT>丁香總黃酮>丁香揮發(fā)油。

2.2? 清除DPPH·自由基能力

DPPH·自由基清除率結(jié)果見圖2。由圖2可以看出，4種供試樣品均有一定清除DPPH·自由基的能力，樣品濃度越大，其DPPH·自由基清除能力越強，隨樣品濃度的增大，4種供試樣品清除DPPH·自由基能力逐漸接近。當樣品濃度為0.05 mg/mL時，4種供試樣品清除DPPH·自由基能力差異較大，丁香總黃酮清除率最低，僅為27.73%，其次為丁香揮發(fā)油36.41%、BHT 56.44%，清除率最大的為槲皮素對照品79.03%。樣品濃度對丁香總黃酮清除DPPH·自由基的影響較大，當濃度達到0.15 mg/mL時，丁香總黃酮對DPPH·自由基的清除率超過丁香揮發(fā)油，二者清除率分別為74.82%、72.13%;而當濃度達到0.20 mg/mL時，丁香總黃酮對DPPH·自由基的清除率與陽性對照BHT相當，濃度高于0.20 mg/mL后，清除率比BHT高，并逐漸與槲皮素對照品的清除率相當，當樣品濃度達到0.30 mg/mL時，丁香總黃酮與槲皮素對照品對DPPH·自由基的清除率分別為94.39%、94.81%。

3? 小結(jié)與討論

試驗對丁香總黃酮的還原力和清除DPPH·自由基的能力進行了測定、評價，還原力的測定主要依據(jù)文獻條件[11]，并在此條件下對樣品濃度進行了考察，發(fā)現(xiàn)總黃酮濃度為1.0、0.5 mg/mL時，最終測出的吸光度過大，且此時槲皮素對照品吸光度已超出量程，故進一步減小濃度至0.3 mg/mL，吸光度在量程范圍內(nèi)且保持較高水平，因此最終選定樣品濃度梯度在0.05～0.30 mg/mL。在測定DPPH·自由基清除能力時，為保證樣品濃度梯度與測定還原力時一致，考察了DPPH·自由基的濃度，當其濃度為0.079 mg/mL時，在濃度梯度范圍內(nèi)樣品均有很強的清除能力（測定方法為2 mL樣品溶液與2 mL DPPH·溶液混勻測定），進一步查閱文獻加大濃度至0.50 mg/mL，以同樣方法測定，發(fā)現(xiàn)在一定濃度下其吸光度超過儀器量程，即清除率極低，故將反應液稀釋（測定方法為2 mL樣品溶液與2 mL DPPH·溶液混勻，并用無水乙醇稀釋至10 mL），結(jié)果較好，因此最終采用所選方法進行測定。

試驗以BHT為陽性對照，對比槲皮素對照品、丁香揮發(fā)油，對丁香總黃酮還原力、清除DPPH·自由基能力進行測定，并以此評價其抗氧化活性。在所用條件范圍內(nèi)，丁香總黃酮有較好的抗氧化活性，其還原力略低于陽性對照BHT而高于丁香揮發(fā)油，清除DPPH·自由基能力則隨濃度增大有明顯的增強趨勢，濃度達到0.15、0.20 mg/mL時，其DPPH·自由基清除率分別超過丁香揮發(fā)油和陽性對照BHT。本研究對丁香總黃酮抗氧化活性進行了評價，將為丁香作為一種天然抗氧劑的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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收稿日期：2018-10-25

基金項目：湖北省技術(shù)創(chuàng)新重大項目（2016ACA146）

作者簡介：黃晶玲（1995-），女，湖北潛江人，在讀碩士研究生，研究方向為中藥及其制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究，（電話）13554673864（電子信箱）893157438@qq.com;通信作者，江漢美（1964-），教授，主要從事中藥及其制劑的物質(zhì)基礎(chǔ)研究，（電子信箱）13807186811@163.com。