進(jìn)境美國高粱種子中產(chǎn)黃色鐮孢菌的檢測與鑒定 王 藝 周密密 孫民琴 等（74）

王藝 周密密 孫民琴 郭曉駒 李彬 吳翠萍

摘要：從進(jìn)境的美國高粱種子中分離到一株疑似產(chǎn)黃色鐮孢菌（Fusarium thapsinum）的菌株A009。該菌株菌落形態(tài)和顯微特征均與產(chǎn)黃色鐮孢菌一致。基于雙基因位點（ITS、EF-1α）進(jìn)行最大似然分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果表明，菌株A009與Fusarium thapsinum（Gibberella thapsina）聚集在一個分支上，最大相似度為100%。致病性測試表明，菌株A009接種高粱幼苗葉片，4 d后在接種部位出現(xiàn)萎蔫癥狀。根據(jù)上述試驗結(jié)果，將進(jìn)境美國高粱種子中的菌株A009鑒定為產(chǎn)黃色鐮孢菌。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)黃色鐮孢菌（Fusarium thapsinum）;高粱病害;形態(tài)特征;系統(tǒng)發(fā)育分析;致病性測試

中圖分類號：S41-30? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2019）08-0074-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.08.017? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Abstract： The isolate A009 was obtained from Sorghum bicolor seeds imported from America. It was similar to Fusarium thapsinum in morphology. The results of phylogenetic analysis based on double gene（ITS and EF-1α） locuses showed the isolate A009 clustered within the type strain of Fusarium thapsinum （Gibberella thapsina）. The maximum likelihood was 100%. Pathogenicity test showed that it caused leaf spot and wilt on inoculated sorghum seedlings after 4 days. Based on all above results， the isolate A009 was identified as Fusarium thapsinum.

Key words： Fusarium thapsinum; sorghum diseases; morphological characters; phylogenetic analysis; pathogenicity test

高粱[Sorghum bicolor （L.） Moench]為禾本科一年生草本植物，全世界第五大作物，位于小麥、水稻、玉米和大麥之后，是重要的糧食作物和飼料作物[1]。目前，中國進(jìn)口的高粱主要來自美國和澳大利亞，主要用作飼料加工及釀酒原料等。2017年，中國從美國進(jìn)口高粱達(dá)476萬t，占總進(jìn)口量的94%，貿(mào)易額約為9.57億元。

鐮刀菌（Fusarium spp.）是一類世界性分布的重要植物病原真菌，侵染谷物可引起萎蔫、根腐、穗腐、莖腐等癥狀，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。同時，鐮刀菌產(chǎn)生的真菌毒素對人和動物的健康都存在潛在的威脅。據(jù)報道，以高粱為寄主的鐮刀菌主要包括產(chǎn)黃色鐮孢菌（Fusarium thapsinum）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）、甘蔗鐮刀菌（Fusarium sacchari）、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）、串珠鐮孢菌亞粘團(tuán)變種（Fusarium moniliforme var. subglutinans）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）、半裸鐮刀菌（Fusarium semitectum）、高粱鐮刀菌（Fusarium andiyazi）、擬輪生鐮刀菌（Fusarium verticillioides）、錯綜赤霉菌（Gibberella intricans）和玉蜀黍赤霉菌（Gibberella zeae）等[3，4]。

鐮刀菌種類繁多，形態(tài)各異，對這些真菌的鑒定大多基于形態(tài)學(xué)和雜交可育的標(biāo)準(zhǔn)，不僅費(fèi)時，還需要有非常專業(yè)的鐮刀菌分類學(xué)和生理學(xué)知識。同時，根據(jù)形態(tài)學(xué)建立的分類系統(tǒng)很難對其進(jìn)行準(zhǔn)確的分類鑒定。而基于DNA的分子檢測方法具有快速、靈敏和特異等優(yōu)點，其中多種基因位點已被廣泛用于鐮刀菌屬及種間的鑒定，這些基因位點包括內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）、β-微管蛋白（β-tubulin）、翻譯延伸因子（EF-1α）、線粒體小亞基核糖體（mtSSU）等[5-7]，目前應(yīng)用最多的是ITS和EF-1α基因[8]。

2018年5月，從一批南通口岸進(jìn)境美國的高粱種子樣品中分離獲得了一株疑似產(chǎn)黃色鐮孢菌菌株A009，通過形態(tài)觀察、多基因位點系統(tǒng)發(fā)育分析，并運(yùn)用柯赫氏法則（Kochs postulates）進(jìn)行了致病性測定，對該批高粱攜帶的病菌進(jìn)行了檢測和鑒定。

1? 材料與方法

1.1? 材料與試劑

供試材料為2018年1月進(jìn)境的美國高粱種子，樣品編號為18P0505。致病性測定的寄主為健康的美國高粱幼苗，接種苗齡為三葉期。

試劑主要包括植物總DNA提取試劑盒（Tiangen）、Tris-HCL（pH 8.0）、2% CTAB提取液、TE緩沖液、PCR反應(yīng)試劑、瓊脂糖、PDA培養(yǎng)基、次氯酸鈉消毒液。

1.2? 病原菌的分離與純化

在體視顯微鏡下用鑷子挑取高粱種子中呈黑褐色的病變樣品，用于病原菌分離。將樣品在次氯酸鈉溶液中表面消毒3～5 min，再用無菌水漂洗3次，以去除表面殘留的次氯酸鈉，用滅菌后的吸水紙吸干種子的水分，風(fēng)干后加入含抗生素（青霉素和硫酸鏈霉素，100 μg/mL）的PDA培養(yǎng)基中。每皿放入7～8顆樣品種子，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。觀察真菌菌落生長情況，將長出的菌落及時轉(zhuǎn)移到新的PDA培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。用滅菌后的打孔器（直徑5 mm）打取菌絲塊，置于PDA平板上繼續(xù)培養(yǎng)，觀察并測量病菌的生長情況。

1.3? 病原菌的形態(tài)鑒定

觀察和記錄PDA平板上的真菌菌落形態(tài)、顏色及氣生菌絲的疏密程度，測量菌落的生長速度，用高清數(shù)字成像設(shè)備（D810，日本尼康公司）拍攝菌落形態(tài)特征。在全自動萬能顯微鏡（Axio Imager M1，德國Zeiss公司）下觀察其顯微形態(tài)特征，使用AxioVision Rel.4.5軟件測量其分生孢子的大小，根據(jù)病菌的形態(tài)特征進(jìn)行鑒定。

1.4? 分子鑒定

1.4.1? 基因組DNA提取? 采用CTAB法提取病菌基因組DNA。將獲得的菌株接種于PDA平板上培養(yǎng)7 d，用解剖刀刮取適量菌絲于2 mL Eppendorf離心管內(nèi)，加入兩顆直徑3 mm的鋼珠，在低溫破碎儀（Retsch，MM400）上以30 f/s速度研磨5 min，研磨后加入500 μL CTAB，振蕩后12 000 r/min離心10 min，65 ℃孵育1～2 h。加入酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），振蕩混勻后12 000 r/min離心10 min，取400 μL上清，加400 μL氯仿，振蕩混勻后12 000 r/min離心10 min，取上清約400 μL，加280 μL異丙醇，-20 ℃放置30 min，振蕩混勻后12 000 r/min離心10 min，棄上清，加300 μL 75%乙醇，振蕩混勻后12 000 r/min離心5 min，棄上清，晾干后加50～200 μL TE緩沖液溶解DNA，獲得病菌基因組DNA工作液用于PCR擴(kuò)增。

1.4.2? 基因組序列擴(kuò)增? ITS擴(kuò)增引物為ITS1和ITS4[9]，EF-1α擴(kuò)增引物為EF-1和EF-2[10]（表1）。反應(yīng)體系包括Premix Taq 25 μL，DNA 2 μL，上下游引物各1 μL，去離子水補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，52 ℃/56 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)，72 ℃延伸7 min后4 ℃保存。

1.4.3? 序列分析? 對A009菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙向序列測定，并將得到的序列在GenBank中進(jìn)行BLAST分析。同時，從GenBank中下載13個鐮刀菌ITS、EF1-α基因序列（表2），采用Clustal X進(jìn)行序列比對[11]，并用軟件MEGA 7.0采用最大似然法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析[12]。

1.5? 致病性測試

采用針刺接種法進(jìn)行致病性測試。菌株A009在PDA上培養(yǎng)14 d后產(chǎn)生大量分生孢子，用解剖刀刮取分生孢子，用無菌水配制成5×105個孢子/mL的懸浮液。在營養(yǎng)缽中生長至3～4片真葉期的健康高粱幼苗，用接種針在葉片中間和邊緣部位穿刺傷口，用少量脫脂棉蘸取菌懸液覆蓋在傷口部位，并用無菌水接種作為對照。將接種后的幼苗用塑料薄膜保濕48 h，之后在室溫（25 ℃）下培養(yǎng)，觀察記錄發(fā)病情況。對發(fā)病幼苗進(jìn)行病菌的再分離。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 病原菌形態(tài)特征

在PDA培養(yǎng)基上，菌株A009從高粱種子表面長出時，菌落呈風(fēng)輪狀，氣生菌絲白色，絨毛狀;菌落從上而下呈黃色或褐色，色素沉著不均勻（圖1A、圖1B）。經(jīng)繼代培養(yǎng)后，菌落正面變?yōu)榈S色，上面有深褐色斑點，反面呈黃褐色（圖1C、圖1D）。菌株在PDA培養(yǎng)基上生長速度很快，25 ℃培養(yǎng)6 d后菌落直徑達(dá)57～76 mm，平均以10 mm/d的速率生長。菌株以假頭狀方式產(chǎn)生大量的小型分生孢子，分生孢子無色，橢圓形或卵圓形，無隔膜或1～2個分隔，平均大小為12 μm×2.4 μm（圖1E，圖1F）。在PDA培養(yǎng)基上，菌株A009未產(chǎn)生大型分生孢子。菌株A009以上特征與Klittich等[13]描述的產(chǎn)黃色鐮孢菌（Fusarium thapsinum）形態(tài)特征一致。

2.2? 序列分析

對菌株A009采用EF-1α和ITS相應(yīng)的引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙向測序，將獲得的序列與其他參試鐮刀菌相關(guān)序列（表2）采用CLustal X進(jìn)行序列比對，并用軟件MEGA 7.0進(jìn)行最大似然分析，發(fā)現(xiàn)基于EF-1α基因構(gòu)建的最大似然樹A009與Fusarium thapsinum聚集在一個分支的支持率為68%（圖2a），基于ITS基因構(gòu)建的最大似然樹A009與Fusarium thapsinum聚集在一個分支的支持率為65%（圖2b），說明此病原菌與Fusarium thapsinum的親緣關(guān)系比較近，但由于病原菌與近緣種在系統(tǒng)進(jìn)化樹上同在一個分支且無法再分，單獨(dú)根據(jù)EF-1α或ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹尚無法準(zhǔn)確判斷病原菌的種級分類水平，因此采用雙基因位點進(jìn)行最大似然分析。結(jié)果表明，菌株A009與Fusarium thapsinum（Gibberella thapsina）聚集在一個分支上，支持率為100%。

2.3? 致病性測定

運(yùn)用柯赫氏法則對分離的菌株進(jìn)行致病性測定。結(jié)果（圖3）表明，接種的高粱幼苗葉片上，2 d后葉片接種部位呈現(xiàn)水漬狀;接種4 d后，水漬病斑從葉片中間向兩端發(fā)展迅速，接種部位縊縮，呈萎蔫狀，并出現(xiàn)少量菌絲體。而用無菌水接種的對照葉片未出現(xiàn)發(fā)病癥狀（圖3）。對上述接種植株的發(fā)病組織進(jìn)行病原菌的再分離，所獲得的菌株與原始菌株A009菌落形狀、形態(tài)特征及序列分析結(jié)果均一致。

3? 小結(jié)與討論

通過對高粱種子中分離到的菌株A009培養(yǎng)性狀及形態(tài)學(xué)觀察、PCR產(chǎn)物序列比對、系統(tǒng)發(fā)育分析和致病性測試，將菌株A009鑒定為產(chǎn)黃色鐮孢菌。

產(chǎn)黃色鐮孢菌[有性態(tài)（Gibberella thapsina）]是1997年在鐮孢菌李瑟組中建立的一個新種[13]。該種在形態(tài)上雖然與同組的其他鐮刀菌相似，但是在產(chǎn)生的真菌毒素、同工酶多態(tài)性、電泳核型、對苯菌靈的敏感性以及在核糖體DNA的ITS區(qū)域序列等方面與其他種具有顯著差異。

目前，對于鐮刀菌屬及種間的鑒定，通常以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ)，并結(jié)合多種基因進(jìn)行分子檢測。ITS序列因其片段較短、物種間變異性強(qiáng)、易擴(kuò)增測序等優(yōu)點被廣泛用于真菌的分類研究，也是真菌鑒定的通用條形碼。但是對于親緣關(guān)系較近的鐮刀菌而言，ITS序列同源性很高，還是難以通過該基因準(zhǔn)確鑒定到種。

據(jù)柳鳳等[14]報道，EF-1α基因在鐮刀菌的系統(tǒng)發(fā)育和進(jìn)化水平上具有豐富的信息量，并且在該屬的真菌內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)該序列的非直系同源拷貝，可以應(yīng)用于鐮刀菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)的鑒定。另外，有很多學(xué)者已將此基因位點用于鐮刀菌的鑒定[15-17]。雷婭紅等[18]報道選擇nrDNA-ITS、EF-1α、mtSSU和β-tubulin 4個候選基因?qū)?1種57株鐮刀菌的基因序列進(jìn)行分析。結(jié)果表明，EF-1α基因PCR擴(kuò)增與測序成功率高，種間差異明顯大于種內(nèi)差異，構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示相同種聚集在同一分支，不同種劃分在不同分支，可作為鐮刀菌屬鑒定的DNA條形碼。Sampietro等[19]報道通過TEF1-a測序可以對Fusarium subglutinans、Fusarium andiyazi和Fusarium thapsinum 3個種進(jìn)行明確地鑒定。

鐮孢菌是農(nóng)作物上最重要的病原真菌類群之一，在高粱上可引起莖腐病、頂腐病、粒霉病等多種病害[20]，無論從植物病理學(xué)，還是從食品安全的角度分析，對高粱子粒上攜帶的鐮孢菌進(jìn)行分類鑒定都具有非常重要的意義。Fusarium thapsinum可以侵染高粱的莖稈、種子、根冠等部位，是高粱種子的主要致病菌之一。該病菌不僅導(dǎo)致產(chǎn)量大幅度下降，而且也使子粒品質(zhì)變劣，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。

參考文獻(xiàn)：

[1] DENDY D A V. Sorghum and millets：Chemistry and technology[J].Trends in food science & technology，1996，7（3）：101.

[2] 張向民.鐮刀菌屬分類學(xué)研究歷史與現(xiàn)狀[J].菌物研究，2005，? 3（2）：59-62.

[3] MARASAS W F O，RHEEDER J P，LAMPRECHT S C，et al. Fusarium andiyazi sp. nov.，a new species from sorghum[J].Mycologia，2001，93（6）：1203-1210.

[4] CAB International. Crop protection compendium[M].Wallingford，UK：CAB International，2007.

[5] YLI-MATTILA T，MACH R L，ALEKHINA I A，et al. Phylogenetic relationship of Fusarium langsethiae to Fusarium poae and Fusarium sporotrichioides as inferred by IGS，ITS，β-tubulin sequences and UP-PCR hybridization analysis[J].International journal of food microbiology，2004，95（3）：267-285.

[6] YLI-MATTILA T，PAAVANEN-HUHTALA S，BULAT S，et al. Molecular morphological and phylogenetic analysis of the Fusarium avenaceum/F. arthrosporioides/F. tricinctum species complex—A polyphasic approach[J].Mycological research，2002，106（6）：655-669.

[7] SCHROERS H J，ODONNELL K，LAMPRECHT S C，et al. Taxonomy and phylogeny of the Fusarium dimerum species group[J].Mycologia，2009，101（1）：44-70.

[8] 曹雪梅，李生兵，張惠玲，等.甘草根腐病病原菌鑒定[J].植物病理學(xué)報，2014，44（2）：213-216.

[9] WHITE T J，BRUNS T，LEE S，et al. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal rna genes for phylogenetics[A].INNIS M A，GELFAND D H，SNINSKY J J，et al. PCR protocols. A guide to methods and applications[C].San Diego：Academic，1990.315-322.

[10] ODONNELL K，KISTLER H C，CIGELNIK E，et al. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana：Concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies[J].Proceedings of the national academy of sciences，1998，95（5）：2044-2049.

[11] THOMPSON J D，GIBSON T J，PLEWNIAK F，et al. The Clustal_X windows interface： Flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools[J].Nucleic acids research，1997，25（24）：4876-4882.

[12] TAMURA K，NEI M. Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees[J].Molecular biology and evolution，1993，10（3）：512-526.

[13] KLITTICH C J R，LESLIE J F，NELSON P E，et al. Fusarium thapsinum （Gibberella thapsina）：A new species in section Liseola from sorghum[J].Mycologia，1997，89（4）：643-652.

[14] 柳? 鳳，詹儒林，韋繼光，等.現(xiàn)代生物技術(shù)在鐮刀菌分類學(xué)中的應(yīng)用[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（30）：166-170.

[15] KRISTENSEN R，TORP M，KOSIAK B，et al. Phylogeny and toxigenic potential is correlated in Fusarium species as revealed by partial translation elongation factor 1 a gene sequences[J].Mycological Research，2005，109（2）：173-186.

[16] 盧維宏，黃思良，陶愛麗，等.玉米穗腐病樣品中層出鐮刀菌的分離與鑒定[J].植物保護(hù)學(xué)報，2011，38（3）：233-239.

[17] 易? 銘，梁嘉俊，史? 建，等.采用EF-1α序列分析法對苜蓿根腐病病原菌——銳頂鐮刀菌的鑒定[J].草業(yè)學(xué)報，2017，26（2）：61-68.

[18] 雷婭紅，況衛(wèi)剛，鄭春生，等.基于DNA條形碼技術(shù)對鐮刀菌屬的檢測鑒定[J].植物保護(hù)學(xué)報，2016，43（4）：544-551.

[19] SAMPIETRO D A，MARIN P，IGLESIASA J，et al. A molecular based strategy for rapid diagnosis of toxigenic Fusarium species associated to cereal grains from Argentina[J].Fungal biology，2010，114：74-81.

[20] 胡? 蘭，姜? 鈺，徐秀德.基于形態(tài)學(xué)和EF-1α序列特征的我國高粱子粒寄藏鐮孢菌種群鑒定[J].作物雜志，2013（4）：129-132.

收稿日期：2018-09-17

基金項目：國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局科技計劃項目（2017IK155）;江蘇出入境檢驗檢疫局科技計劃項目（2017KJ08）

作者簡介：王? 藝（1996-），女，江蘇泰州人，在讀碩士研究生，研究方向為植物檢疫，（電話）18305176727（電子信箱）2017802155@njau.edu.cn;通信作者，李? 彬（1972-），男，主要從事植物檢疫工作，（電話）13815871522（電子信箱）libin_1103@163.com。