水溶性Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族合金量子點的制備及其應用研究

蘇丹璐 郭睿倩 張萬路

復旦大學電光源研究所 (上海 200433)

0 引言

量子點 (Quantum Dots,簡稱 QDs)是指三維尺寸都為1～10nm的納米材料。近年來，以CdSe(S/Te)為代表的Ⅱ-Ⅵ族量子點的合成及應用研究發(fā)展得最為成熟，而 Cd的毒性制約了量子點在生物領(lǐng)域的應用[1]。Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族合金量子點所含元素毒性較低，更加環(huán)境友好，可以作為替代Ⅱ-Ⅵ族元素的材料[2]。這種三元納米材料大多具有黃銅礦結(jié)構(gòu)，同時可以通過改變組分含量調(diào)控量子點的熒光特性，其發(fā)射光譜可以實現(xiàn)紫外到紅外的全覆蓋，且熒光壽命長，因此近年來得到廣泛的關(guān)注[3-5]。

目前制備量子點的方法可分為有機合成和水相合成兩大類，比起有機合成法，水相法操作簡便，成本低廉，更適用于生物醫(yī)藥等方面的應用。文章概述了Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族多元合金量子點的水相合成方法及其在離子檢測、生物熒光標記和細胞成像等領(lǐng)域的應用。

1 Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族合金量子點的水相制備及機理探究

Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族量子點包含一系列多元合金量子點，如AgInS2、CuInS2、CuInSe2等。2004年，Castro課題組[6]最先報道了三元黃銅礦CuInS2量子點的膠體制備方法，使用熱分解法，采用 (PPh3)2CuIn(SEt)4作為單一前驅(qū)體，溶于己硫醇溶劑中，在200℃條件下分解生成CuInS2量子點，該量子點粒徑分布在2～4nm，熒光發(fā)射峰可在662～673nm調(diào)諧。由有機金屬鹽溶于有機溶劑中反應生成的量子點具有疏水特性，因此不適于生物相關(guān)的應用。雖然可以通過表面修飾對量子點進行相轉(zhuǎn)換，使其能夠溶于水，但操作十分復雜，且通常會導致熒光量子產(chǎn)率和穩(wěn)定性的下降[7]。因此，直接在水中合成Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族量子點的方法開始受到廣泛關(guān)注，其中研究最多的是Ag-In-S和Cu-In-S量子點。

1.1 水溶性Ag-In-S合金量子點的制備及機理探究

2012年，Luo課題組[8]首次報道了在水相中制備AgInS2和AgInS2/ZnS核殼結(jié)構(gòu)量子點的方法，采用一鍋法 (熱回流法)，以谷胱甘肽 (GSH)為穩(wěn)定劑，制備出的AgInS2量子點沒有明顯的激子吸收峰，熒光發(fā)射光譜半高寬FWHM＞100 nm，且Stokes位移達到約1.44eV，說明該量子點的熒光發(fā)射機制并不是帶隙躍遷，而是帶隙內(nèi)缺陷態(tài)能級的施主-受主復合，如圖1所示。通過包覆 ZnS殼層可以將量子產(chǎn)率從3%提高至15%，同時導致熒光發(fā)射峰的藍移，這是由于Zn2+擴散進入其晶格結(jié)構(gòu)，導致禁帶寬度增加，施主-受主間的距離也隨之增加，電子躍遷釋放的能量升高。

圖1 AgInS2量子點熒光發(fā)射機理示意圖 [8]

Regulacio等[5]同樣采用一鍋法，以聚丙烯酸(PAA)和甲基丙烯酸 (MAA)作為雙穩(wěn)定劑，成功合成出AgInS2/ZnS量子點，其量子產(chǎn)率達到20%，熒光壽命可達170ns。通過改變Ag+和In3+的比例，可以實現(xiàn)525～640 nm 的熒光波長調(diào)諧，如圖2所示。隨著Ag元素的增加，熒光發(fā)射峰值產(chǎn)生紅移，這是因為AgInS2的最高價帶是由S的3p軌道和Ag的4d軌道雜化而成的[9]，由 Ag引入的軌道數(shù)增多會導致價帶頂部升高，從而使材料的禁帶寬度變窄。另外，雙穩(wěn)定劑的使用可以調(diào)節(jié)兩種陽離子的反應活性，根據(jù)Pearson的HSAB理論[10]，MAA中的硫醇基團是一種軟堿，更易與作為軟酸的 Ag+結(jié)合，而含有多個羧基的PAA則更易與In3+這類硬酸發(fā)生反應，同時可以保證反應生成物在水中有很好的穩(wěn)定性。

圖2 不同Ag/In比例的AgInS2-ZnS量子點 (a)熒光發(fā)射圖譜以及(b)受自然光照射 (上)和紫外激發(fā) (下)的圖像 [5]

Song等[11]采用水熱法，以L-半胱氨酸為穩(wěn)定劑，在110℃條件下合成Zn：AgIn5S8/ZnS量子點，其量子產(chǎn)率達到35%。通過控制Ag/Zn比例，可以實現(xiàn)560～650 nm熒光波長調(diào)諧。

除了傳統(tǒng)的一鍋法、水熱法以外，微波輔助水相合成法可以看作水相法的改良，具有反應迅速高效、加熱均勻等優(yōu)點。Xiong等[7]采用微波輔助法成功制備AgInS2/ZnS量子點，反應時間由幾小時縮短至10min，量子產(chǎn)率高達40%，熒光壽命超過400 ns，且具有很低的生物毒性，有望作為生物探針應用。

1.2 水溶性Cu-In-S合金量子點的制備及機理探究

與Ag-In-S量子點相比，Cu-In-S量子點水相合成方法的研究最早出現(xiàn)于相似的時間，但發(fā)展更快。2012年，Liu等[12]首先采用水熱法，以巰基丙酸 (MPA)為穩(wěn)定劑，在150℃條件下反應21h得到具有黃銅礦結(jié)構(gòu)的CuInS2三元合金量子點，產(chǎn)生近紅外的熒光發(fā)射，但量子產(chǎn)率僅為3.3%。

一年后，Chen等[13]報道了采用一鍋回流法95℃反應40 min制備水溶性Cu-In-S/ZnS核殼結(jié)構(gòu)量子點的方法。文章提出，在水相合成Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族合金量子點的過程中最重要的是避免陽離子的相分離，GSH、MPA等含有巰基(-SH)的分子都只能在反應中提供軟堿官能團，無法對作為硬酸的 In3+起到很好的穩(wěn)定作用，因此采用GSH和檸檬酸鈉作為雙穩(wěn)定劑來控制兩種不同陽離子的反應活性，并通過包覆三層ZnS殼層，使該量子點量子產(chǎn)率達到38%。如圖3所示，通過提高 Cu/In摩爾比可以使量子點吸收和熒光發(fā)射都產(chǎn)生紅移，從而實現(xiàn)543～625 nm 的熒光波長調(diào)諧。2015年，Zhang等[14]又用同樣的方法合成了 Zn-Cu-In-S/ZnS四元合金量子點，發(fā)現(xiàn)隨著Zn的加入，量子點的熒光發(fā)射波長可從709 nm藍移至594 nm，光譜半高寬由158nm減小至105nm，并且由EDS表征得到的Cu/In比例下降，說明 Zn2+更傾向于取代結(jié)構(gòu)中的 Cu+而不是In3+，這是因為Cu-S鍵比In-S鍵更弱。

圖3 不同Cu/In摩爾比的Cu-In-S/ZnS核殼量子點

微波輔助法對于CuInS2量子點合成同樣適用且高效，Xiong等[15]通過微波水相法反應 10 min制得CuInS2/ZnS量子點，可實現(xiàn)470～640nm范圍內(nèi)的熒光發(fā)射，量子產(chǎn)率達24%。通過XPS分析證明了Cu-In-S量子點中的Cu元素為+1價，這是由于前驅(qū)體中的Cu2+在反應過程中被穩(wěn)定劑還原了。

為了便于應用，Chen等[16]又在2014年報道了低成本大規(guī)模量產(chǎn) Cu-In-S/ZnS核殼量子點的方法。采用家用的電壓力鍋，并以廉價的巰基乙酸 (TGA)和檸檬酸鈉為穩(wěn)定劑，一次可制備出3 g量子點，熒光波長范圍545～610nm，量子產(chǎn)率高達40%，可以滿足生物熒光標記等應用的需求。

2 水溶性Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族合金量子點的應用

由于水溶性的Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族量子點不含有毒重金屬元素，有很好的生物相容性，且便于實現(xiàn)可見光-近紅外的熒光波長調(diào)諧，因此在離子和生物大分子檢測、生物熒光標記和成像等方面具有廣闊的應用前景。

2.1 生物化學傳感器

水溶液中的量子點會受到周圍溶液中分子或離子的影響產(chǎn)生熒光強度的變化，利用這一特性，可以做成化學傳感器。如果對其進行一定表面修飾，可以應用于生物血液中某種離子或者生物大分子的靈敏檢測。

Liu等[17]發(fā)現(xiàn)CuInS2量子點遇到Cu2+會發(fā)生不可逆的熒光淬滅，這是因為Cu2+會在量子點的表面反應生成CuS沉淀，造成量子點中S元素的缺失。同時，這種合金量子點遇到Cd2+會發(fā)生明顯的熒光增強，因為CuInS2量子點與CdS量子點具有相似的結(jié)構(gòu)，Cd2+的加入會在CuInS2量子點表面形成一層寬禁帶的CdS殼層，對量子點表面起到修飾缺陷的作用。在被Cd2+修飾之后，該量子點對 Cu2+會更加敏感，其反應過程如圖4所示。

Xiong等[7]發(fā)現(xiàn)溶液中的Cu2+也會使CuInS2/ZnS量子點發(fā)生熒光淬滅，這是因為Cu2+會取代量子點表面的Zn2+從而生成CuS，加速電子-空穴對的非輻射復合，而生物組織液中的其他離子如 Ca2+、Mg2+、Fe2+、Fe3+等并不會導致這樣的現(xiàn)象。利用這一特性，可以對生物細胞內(nèi)Cu2+濃度進行檢測，從而應用于醫(yī)學病理檢測。他們又將人的白介素抗體修飾在CuInS2/ZnS量子點表面，使其可以對白介素 (IL-6)進行特異性識別，從而制成生物探針，實現(xiàn)對癌癥及其他一些疾病的熒光免疫分析，檢測機理如圖5所示[15]。

圖4 CuInS2量子點應用于Cu2+和Cd2+離子檢測示意圖 [17]

圖5 IL-6的熒光免疫分析機理示意圖[15]

2015年，Lin等[18]將近紅外發(fā)光的 CuInS2量子點用 Zn2+激活，使其表面帶上正電荷，再加入帶負電的凝血酶適配體 (TBA)，量子點會發(fā)生熒光淬滅。然而，凝血酶 (thrombin)與其適配體之間存在特異性識別作用，兩者反應可生成結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的化合物，使量子點熒光恢復，其機理如圖6(a)所示，從而實現(xiàn)對凝血酶的高選擇性和高靈敏度的檢測。實驗證明，這種方法可以在人的血清環(huán)境中實現(xiàn)對凝血酶的靈敏檢測，而不受血清中其他生物大分子的干擾，實驗結(jié)果如圖6(b)所示，有望應用于與凝血異常相關(guān)的疾病診斷中。

圖6 (a)Zn2+激活的CuInS2量子點用于檢測凝血酶的反應機理；(b)CuInS2QDs-Zn(II)-TBA探針用血清中不同的生物大分子處理結(jié)果[18]

2.2 生物熒光標記與成像

由于量子點尺寸小，可以通過細胞的吞噬作用進入細胞，并且細胞毒性很低，不會影響生物的正常代謝，因此能夠作為一種熒光探針應用于細胞標記和成像。由于其優(yōu)異的生物相容性，可以在其表面修飾上多肽、蛋白質(zhì)和抗體等特定的生物大分子，從而對癌細胞進行靶向識別，在疾病診斷和治療中有廣闊的應用前景[19-23]。

2012年，Chang等[19]通過在AgInS2/ZnS量子點表面修飾葉酸分子，實現(xiàn)對人肝癌(HepG2)細胞的特異性識別，并發(fā)現(xiàn)其對細胞質(zhì)和細胞核都可以染色。2015年，Song等[11]證明通過氨基與量子點表面配體中羧基的脫水縮合反應能將甲種胎兒球蛋白(AFP)抗體與Zn摻雜的AgIn5S8/ZnS量子點相聯(lián)結(jié)，同樣可以實現(xiàn)對HepG2細胞進行特異性識別，對其細胞質(zhì)進行黃色熒光標記，實現(xiàn)細胞級別的靶向識別和細胞成像，有望應用于肝癌的臨床診斷和治療。一年后，Yang等[20]用同樣的方法制備了CuInS2-ZnS-AFP肝癌熒光探針，熒光標記結(jié)果如圖7所示。

圖7 HepG2細胞與CuInS2-ZnS-AFP probe共同培養(yǎng)(0.24 mg/mL,40 min)后的顯微圖像(a)亮視場；(b)暗視場；(c)被DAPI染料染色后加藍-黃雙色濾光片；(d)被DAPI染料染色后加藍色濾光片 [20]

Regulacio等[5]利用量子點表面配體的負電性，將尾部帶正電的桿狀病毒載體與AgInS2/ZnS量子點結(jié)合，實現(xiàn)對HeLa細胞的熒光標記，如圖8所示。

圖8 用AgInS2/ZnS量子點標記桿狀病毒載體并傳輸進入HeLa細胞的 (a)示意圖和 (b)熒光圖像 [5]

Wang等[21]用聚乙烯亞胺 (PEI)對AgInS2量子點進行包覆，實現(xiàn)對 HeLa細胞進行標記，同時發(fā)現(xiàn)量子點的熒光強度會在遇到 H2O2和葡萄糖時發(fā)生下降，并且下降程度與濃度呈線性關(guān)系，因此可以實現(xiàn)生物成像和活體細胞中H2O2、葡萄糖分子檢測雙功能。2015年，Yang等[22]同樣用PEI對AgInS2/ZnS量子點進行表面修飾，制備出ZAIS@PEI量子點作為自示蹤的基因載體，可以對基因工程所用的質(zhì)粒進行熒光標記，在基因轉(zhuǎn)染的過程中進行實時的追蹤檢測，其過程如圖9所示。實驗表明其對 HeLa細胞的轉(zhuǎn)染效率達到40%，并且生物毒性低到可以忽略，有望作為一種新的基因載體。

2016年，Arshad等[23]將精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (RGD)多肽修飾在發(fā)紅光的 CuInS2量子點表面，利用RGD肽對癌細胞表面過度表達的v3蛋白的靶向識別，從而實現(xiàn)對癌細胞的特異性熒光標記，可以作為特異性的熒光探針用于癌癥的臨床診斷。

圖9 ZAIS@PEI量子點的合成和細胞標記過程 [22]

目前，量子產(chǎn)率最高的黃色和橙色熒光量子點可被方便地應用于生物體外的化學物質(zhì)檢測和細胞成像，但是應用到生物體內(nèi)標記和成像時，可見光存在一定限制，因為生物組織本身會對光產(chǎn)生吸收和散射作用，使標記的可見光熒光強度減弱，從而無法在生物組織中達到理想的滲透深度。同時，某些生物分子自身也會產(chǎn)生熒光，對光信號產(chǎn)生干擾[24]。生物組織光吸收和自身熒光發(fā)射強度最低值處于近紅外波段，因此600～950nm的熒光是用于生物體內(nèi)熒光標記和成像最合適的選擇[25]。Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族量子點的熒光波長調(diào)諧性能優(yōu)異，且與有機染料相比更加穩(wěn)定，不易產(chǎn)生熒光漂白，因此有很大的應用潛力，越來越多的研究開始關(guān)注近紅外波段的Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族量子點的水相制備和生物成像應用[12,16,26-27]。2017年，Zhu等[27]用麥胚凝集素(WGA)修飾熒光發(fā)射波長650nm左右的Cu-In-S/ZnS量子點，實現(xiàn)對CAL-27(舌鱗癌)細胞的近紅外標記，結(jié)果如圖10所示。

圖10 CAL-27(舌鱗癌)細胞的 (a,d)亮視場圖像 (b,e)熒光圖像和 (c,f)混合圖像；(a-c)與Cu-In-S/ZnS量子點共同培養(yǎng)后；(d-f)與WGA修飾的Cu-In-S/ZnS量子點共同培養(yǎng)后[27]

3 總結(jié)與展望

水溶性Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族合金量子點由于熒光波長便于調(diào)諧、穩(wěn)定性好、生物毒性低等特點，近年來得到廣泛研究，特別是關(guān)于Ag-In-S和Cu-In-S量子點的研究進展比較迅速，目前已初步實現(xiàn)低成本量產(chǎn)，且最高量子產(chǎn)率達到40%左右。通過表面修飾特定的生物分子，可以實現(xiàn)生物體外的病理監(jiān)測。今后，該量子點的發(fā)展還面臨著以下挑戰(zhàn)：(1)Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族合金量子點合成過程中的生長動力學及其熒光機理還需要更深入的研究，以進一步降低成本，提高量子產(chǎn)率，特別是在600～950nm波段的熒光量子產(chǎn)率；(2)目前對應用于生物特異性標記的表面修飾方法的研究還很不系統(tǒng)，需要開發(fā)標記某一類細胞(如癌細胞)的通用技術(shù)；(3)對于水相直接合成的Ⅰ-Ⅲ-Ⅵ族量子點，目前的生物應用研究還停留在體外實驗的階段，下一步需要增加生物活體成像的研究，以進一步拓展其應用范圍，為醫(yī)學臨床診斷和治療提供新的思路。