法舒地爾保護(hù)小鼠腦缺血再灌流損傷的機(jī)制*

楊錫彤， 程建杰， 徐弘揚(yáng)， 王光明

大理大學(xué)第一附屬醫(yī)院基因檢測中心(云南大理 671000)

腦卒中(stroke)是一種突發(fā)的腦血液循環(huán)障礙性疾病，包括缺血性和出血性腦卒中兩種類型[1]。缺血性腦卒中約占腦卒中的85%以上，已出現(xiàn)年輕化的趨勢，并成為第一位致殘和致死原因[2]。在腦缺血過程中，缺血區(qū)神經(jīng)組織由于血管堵塞引起的營養(yǎng)缺乏導(dǎo)致神經(jīng)組織壞死，改善缺血區(qū)的側(cè)支循環(huán)可以改善營養(yǎng)供應(yīng)，從而保護(hù)或者減輕神經(jīng)組織的缺血損傷，血腦屏障可通過限制某些物質(zhì)在血液和腦組織之間自由交換，從而使腦組織少受甚至不受循環(huán)血液中有害物質(zhì)的損害，對維護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要意義[3-4]。有研究表明法舒地爾(Fasudil)通過抑制Rho激酶的活性，延長了治療時(shí)間窗，在治療遲發(fā)性神經(jīng)元死亡有較好的療效[5]。法舒地爾的神經(jīng)保護(hù)作用研究主要在細(xì)胞水平進(jìn)行，也有部分在動(dòng)物水平，但是法舒地爾保護(hù)神經(jīng)的機(jī)制并不清楚，而本研究利用小鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)模型，結(jié)果提示在腦缺血狀態(tài)下法舒地爾與過氧化物酶體激活受體α(PPARα)、超氧化物歧化酶(SODs)以及血管生成之間的關(guān)系，明確法舒地爾在腦缺血中神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制。因此，在2017年9月至2018年4月，本研究通過經(jīng)法舒地爾預(yù)處理的小鼠構(gòu)建腦缺血/再灌流(I/R)動(dòng)物模型，以闡明法舒地爾在小鼠腦缺血損傷的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 25只SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(湖南，長沙)，小鼠年齡6～8周，體重20～25 g。動(dòng)物的使用經(jīng)大理大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，其操作過程符合相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)指南。小鼠購買后，在大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)，小鼠以標(biāo)準(zhǔn)食物顆粒和自來水喂養(yǎng)，室內(nèi)溫度在20～25℃。

1.2 主要試劑 TTC，CMC，法舒地爾購自Sigma公司(St. Louis, MO)；引物合成，總RNA提取試劑盒和cDNA合成試劑盒由Invitrogen公司(Carlsbad, CA)提供；蛋白質(zhì)提取試劑盒購自Thermo Scientific公司(Waltham, MA)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒和蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自Bio-Rad公司(Richmond, CA)；SODs酶活性檢測試劑盒購自美國Wako 化學(xué)公司(Richmond, VA)；其余試劑未作特殊說明均來自Sigma公司。

1.3 動(dòng)物分組及藥物處理 小鼠隨機(jī)從1～25進(jìn)行編號(hào)，單號(hào)為對照組(CMC組)，雙號(hào)為治療組(法舒地爾)。藥物處理：CMC組用10 mL 0.5%的CMC混懸液/kg體重處理(13只)，法舒地爾組用10 mg/kg體重的法舒地爾處理(12只)。小鼠藥物處理后，按照編號(hào)順序取CMC組6只和法舒地爾組5只進(jìn)行I/R模型制備以檢測腦壞死體積；其余小鼠經(jīng)法舒地爾或者CMC處理后直接用于下列檢測：PPARα的表達(dá)(CMC和法舒地爾各4只)；SODs酶活性(CMC組和法舒地爾組各7只)；SOD1、SOD2、SOD3 mRNA檢測(CMC組和法舒地爾組各5只)。

法舒地爾與0.5%的CMC混合制成混懸液，用小鼠專用灌胃針灌胃給藥。CMC和法舒地爾均在每天8:00～8:30 am給藥1次，連續(xù)3 d；最后一次給藥后1 h內(nèi)進(jìn)行手術(shù)或者取腦組織進(jìn)行相關(guān)檢測。

1.4 小鼠大腦中動(dòng)脈I/R模型制備[6]手術(shù)過程用1.5%異氟醚氣體麻醉，用加熱墊維持小鼠直腸溫度在(37±1)℃，手術(shù)顯微鏡(蔡司，德國)下分離右側(cè)頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈并進(jìn)行結(jié)扎，將長度為11 mm、硅膠包被的8.0尼龍線經(jīng)頸總動(dòng)脈插入頸內(nèi)動(dòng)脈，當(dāng)腦血流值低于原始值的20%時(shí)開始計(jì)時(shí)。60 min后撤出尼龍線，進(jìn)行再灌流。手術(shù)期間用BD公司的腦血流監(jiān)測儀全程監(jiān)測左耳耳緣后缺血區(qū)顱骨表面的腦血流。再灌流30 min后用Laser Speckle圖像系統(tǒng)采集腦血流圖像。再灌流18 h后處死動(dòng)物，用于腦壞死體積分析。

1.5 壞死體積測定 用過量的異氟醚處死小鼠，斷頭后，剝離腦骨及腦膜等，腦組織用刀片切為厚度為2 mm的5片腦片，在室溫下用2%的TTC染色30 min，中間翻轉(zhuǎn)1次，腦片經(jīng)掃描后用MCID圖像分析軟件進(jìn)行腦壞死體積的分析。

1.6 SOD1、SOD2、SOD3 mRNA測定 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測定腦內(nèi)SOD1、SOD2、SOD3的表達(dá)水平。小鼠最后一次藥物處理后60 min內(nèi)處死小鼠，剝離腦組織，冷生理鹽水沖洗，按照Trizol說明書提取腦組織中總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，iQ SYBR Green試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增所用引物見表1。循環(huán)條件如下：起始變性95℃10 min，循環(huán)95℃10 s，55℃退火10 s，72℃延伸15 s，循環(huán)30次。應(yīng)用2ΔΔCT法處理數(shù)據(jù)，以CMC處理組的值為1并作為對照，法舒地爾組與之相比得出倍數(shù)變化，反映腦內(nèi)SOD1、SOD2、SOD3基因的表達(dá)水平。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析用引物

1.7 SODs酶活性檢測 小鼠最后一次藥物處理后，取部分腦組織，用預(yù)冷的50 mmol/L Tris-HCl(pH=7.0)進(jìn)行組織勻漿，離心取上清。按照SODs試劑盒說明測定腦組織中SODs活性。

1.8 免疫印跡檢測PPARα的表達(dá) 小鼠最后一次藥物處理后，取部分腦組織，用蛋白質(zhì)提取試劑盒提取總蛋白，蛋白濃度用Bio-Rad公司的蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒進(jìn)行檢測，以15 μg/5 μL的蛋白量進(jìn)行SDS-PAGE(分離膠濃度8%)，用Bio-Rad公司半干轉(zhuǎn)移系統(tǒng)轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用兔抗小鼠的PPARα多克隆抗體(Cayman, Ann Arbor, MI)和山羊抗小鼠的β-actin單克隆抗體(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)孵育，然后用抗兔和山羊的IgG(分別為IRDye 800CW和IRDye 680CW標(biāo)記)孵育，洗滌后用Bio-Rad公司的蛋白印跡檢測系統(tǒng)掃描，所獲得的圖像用Image J(pubmed)進(jìn)行分析，PPARα和β-actin灰度值的比值代表了PPARα表達(dá)的相對值。

2 結(jié)果

2.1 小鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注損傷的減輕 將小鼠的腦組織切片，可見腦冠狀切片左側(cè)組織出現(xiàn)明顯的白色梗死灶(圖1-A)，法舒地爾處理組小鼠其白色梗死灶明顯減小[(100.78±3.36)mm3、(47.36±2.29)mm3]，腦梗死體積差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。而兩組動(dòng)物在灌流前后體溫、腦血流方面沒有改變(P>0.05)，見表2。在腦壞死區(qū)域，法舒地爾處理組的小鼠其腦血流好于CMC處理組(圖1-B)。

項(xiàng)目CMC組(n=6)法舒地爾組(n=5)局部腦血流(%) 缺血手術(shù)前100100 缺血期間9.78±3.759.33±3.96 再灌注98.57±5.34 99.67±5.87 體溫(℃) 缺血手術(shù)前36.4±0.4936.6±0.46 缺血期間36.3±0.3536.5±0.43 再灌注36.3±0.3436.5±0.41

2.2 PPARα、SOD1、SOD2、SOD3的表達(dá)及使SODs活性的改變 提取小鼠腦組織，結(jié)果發(fā)現(xiàn)法舒地爾處理后腦組織中PPARα的相對含量明顯升高(1.601±0.051vs1.124±0.046)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。取小鼠腦組織發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)法舒地爾處理后，其腦組織中SOD1、SOD2、SOD3的表達(dá)明顯升高(P<0.05)，SODs的檢測結(jié)果表明法舒地爾處理能夠使組織中SODs的活性升高(P=0.000)。見表3。

3 討論

法舒地爾是一種RHO激酶抑制物，在機(jī)體中具有擴(kuò)張血管、改善腦微循環(huán)等作用[7],在大鼠缺血模型中，用法舒地爾處理后，可以改善缺血損傷，其機(jī)制是降低缺血區(qū)MMP-9的活性及減少中性粒細(xì)胞的浸潤，以改善血腦屏障(blood-blood barrier，BBB)的功能[8]，在法舒地爾對大鼠I/R損傷的研究中認(rèn)為其保護(hù)作用與脂質(zhì)化的法舒地爾顆粒大小有關(guān)[5]，在大鼠肺缺血再灌注動(dòng)物模型中給予法舒地爾處理，可以減輕I/R損傷，但是在機(jī)制方面的闡述上僅僅認(rèn)為與Rho激酶相關(guān)[9]，有研究認(rèn)為法舒地爾處理少突膠質(zhì)細(xì)胞后可以促進(jìn)PPARα的表達(dá)[6]，PPARα激活后可以促進(jìn)SODs的表達(dá)[10]，激活的SODs可以促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)血管的生成[11-12]。組織中血管再生并改善側(cè)支循環(huán)，從而使由于某種原因?qū)е碌哪X組織缺血缺氧引起的壞死、損傷得到改善[11,13]，因此在研究I/R引起的腦組織損傷時(shí)，改善腦組織的側(cè)支循環(huán)有可能是保護(hù)I/R損傷的部分機(jī)制。

在急性腦卒中，腦損傷的主要原因是腦血流的減少和二次損傷，例如炎癥過程。而法舒地爾能夠減少缺血性腦損傷，這種效果似乎由以下的效應(yīng)所介導(dǎo)的：(1)可增加rCBF(區(qū)域性腦血流)；(2)通過抑制中性粒細(xì)胞浸潤從而阻止炎癥反應(yīng)。繼發(fā)損傷是指壞死區(qū)域的組織受到進(jìn)一步的破壞，這是由大量的血管，生化和細(xì)胞的級(jí)聯(lián)包括脊髓屏障的破裂和水腫的形成、缺血、缺氧、血管活性物質(zhì)的釋放導(dǎo)致脊髓灌注的改變，與谷氨酸相關(guān)的神經(jīng)元細(xì)胞的死亡，形成自由基和一氧化氮，損傷線粒體能量耗盡，炎性細(xì)胞的侵襲和激活(例如中性粒細(xì)胞、小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞)，分泌裂解酶和細(xì)胞因子導(dǎo)致組織的進(jìn)一步損傷，少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡和神經(jīng)退行性變[6-7]。法舒地爾對抑制缺血后的繼發(fā)性損傷起到重要作用，法舒地爾通過增加局部腦血流量改善血流動(dòng)力學(xué)功能，阻止血液黏滯性過高，并在內(nèi)皮細(xì)胞中上調(diào)內(nèi)皮一氧化氮合酶的活性。法舒地爾也能在大腦缺血后通過抑制中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的浸潤，抑制中性粒細(xì)胞和血管中O2-的產(chǎn)生防止炎癥反應(yīng)的繼續(xù)發(fā)展。

法舒地爾是一種RHO激酶抑制物，在機(jī)體中具有擴(kuò)張血管，改善腦微循環(huán)等作用[7]。在本研究中，我們利用法舒地爾預(yù)處理小鼠，然后進(jìn)行小鼠大腦中動(dòng)脈I/R模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠的腦壞死體積由對照組的(100.78±3.36)mm3減小到(47.36±2.29)mm3，說明法舒地爾可以減輕I/R損傷。培養(yǎng)的少突膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)法舒地爾處理后，其細(xì)胞中PPARα的表達(dá)升高[10]，而在我們的研究中，經(jīng)法舒地爾處理的小鼠腦組織PPARα的表達(dá)明顯高于CMC，說明在機(jī)體水平或者細(xì)胞水平法舒地爾具有促進(jìn)PPARα表達(dá)的作用。利用體外培養(yǎng)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，研究SOD3啟動(dòng)子活性時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)PPARα可以正向調(diào)控SOD3的表達(dá)[11]，在該研究中用法舒地爾處理后，小鼠腦組織中的SOD1、SOD2、SOD3的表達(dá)明顯升高，SODs的活性也高于CMC處理組，說明法舒地爾處理后，引起小鼠腦組織中PPARα的表達(dá)改變以調(diào)控SODs的表達(dá)；由于生理性、藥物性等原因使SODs激活，均對血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和血管的生成產(chǎn)生影響[12-14]，而在我們的研究中，在I/R過程中用Laser Speckle監(jiān)測缺血區(qū)腦血流時(shí)發(fā)現(xiàn)，與CMC組相比，法舒地爾組小鼠其缺血區(qū)的微血管分布明顯增多，腦血流增強(qiáng)，說明法舒地爾處理后，小鼠缺血區(qū)的腦組織側(cè)支循環(huán)得到改善，因此，我們認(rèn)為法舒地爾在小鼠的腦I/R損傷中的神經(jīng)保護(hù)作用可能是依賴于激活PPARα，然后促進(jìn)SOD1、SOD2、SOD3的表達(dá)，SODs的表達(dá)也明顯升高，表達(dá)升高的SOD1、SOD2、SOD3促進(jìn)血管的生成，從而導(dǎo)致側(cè)支循環(huán)的改善。

A：每組一只小鼠的腦組織，連續(xù)切為5片，TTC染色；B：法舒地爾處理對小鼠腦I/R后腦血流的影響

圖2 法舒地爾處理對正常小鼠PPARα表達(dá)的影響

組別CMC組(n=5)法舒地爾組(n=5)SOD1 mRNA1.000±0.1332.644±0.251SOD2 mRNA1.000±0.1561.816±0.174SOD3 mRNA0.998±0.1922.532±0.363SODs活性22.015±1.29438.311±1.318

腦I/R損傷的保護(hù)機(jī)制可能與改善腦血流、減輕炎癥反應(yīng)和減輕血腦屏障的損傷有關(guān)[15-17]。在本研究中，法舒地爾處理后，小鼠腦組織中的PPARα、SOD1、SOD2、SOD3的表達(dá)以及SODs的活性均明顯升高，小鼠腦組織缺血區(qū)的血管分布得到增強(qiáng)，因此法舒地爾在I/R中的神經(jīng)保護(hù)可能是通過促進(jìn)PPARα的表達(dá)，以影響SOD1、SOD2、SOD3以及SODs的表達(dá)及活性，從而促進(jìn)血管的生成以改善側(cè)支循環(huán)，達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用。

綜上所述，本研究表明，法舒地爾在腦I/R損傷中具有神經(jīng)保護(hù)作用，這一作用與改善側(cè)支循環(huán)密切相關(guān)。