膠質(zhì)母細胞瘤切除術(shù)后128例預后因素分析

鄭宗泰， 尹雷， 王鵬， 陳嘉偉， 林翰， 李炎穩(wěn)， 周東△

1廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學科學院)神經(jīng)外科(廣東廣州 510080)； 2廣東省中醫(yī)院腦病六科(廣東廣州 510120)

膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma，GBM)是最常見的原發(fā)性惡性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(47.1%)和最常見的膠質(zhì)瘤(56.1%)[1]。目前針對GBM的標準治療方案為腫瘤盡可能最大范圍安全切除，術(shù)后以Stupp方案治療[2]。盡管通過積極的手術(shù)治療和術(shù)后輔助治療，GBM患者的預后仍然不容樂觀，5年生存率僅為5.5%[1]。根據(jù)2016年WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分類，分子生物學診斷技術(shù)已成為膠質(zhì)瘤診斷的重要內(nèi)容之一，并成為膠質(zhì)瘤精準分類的基礎(chǔ)，從而能更好地為患者制定個體化治療方案和判斷患者的預后[3]。我們應用免疫組織化學技術(shù)對GBM中O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、P53和Bcl-2進行檢測，結(jié)合患者的臨床特征和隨訪信息，探究GBM患者手術(shù)切除術(shù)后預后因素，為GBM治療方法的選擇提供客觀依據(jù)，具有一定的指導意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 入組標準：(1)所有患者皆為首次患??；(2)開顱手術(shù)前未接受其他治療；(3)術(shù)前無嚴重心、肝、腎臟等重要器官功能異常；(4)術(shù)后病理確診為GBM；(5)隨訪資料齊全。2008年1月至2017年3月廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學科學院)手術(shù)切除的GBM患者139例，其中失訪5例，術(shù)前外院接受伽馬刀治療3例，既往外院接受手術(shù)2例，最終128例符合入組標準納入研究。該樣本男88例，女40例，年齡13～77歲，平均(52.8±14.9)歲。所有患者采用全麻下開顱切除GBM，術(shù)前對患者行功能狀態(tài)標準評分(Karnofsky performance score，KPS)和術(shù)前有無癲癇狀態(tài)的評估，通過術(shù)前增強核磁共振判斷腫瘤部位、腫瘤大小。腫瘤全切的定義為患者術(shù)后72 h的核磁共振T1增強像無殘留的異常增強信號。

1.2 治療方法 術(shù)后開始行輔助性化療、放療或同步放化療。標準放療方案：放療總劑量為54～60 Gy，分割30次，每次劑量不超過2 Gy。標準化療采用Stupp方案：替莫唑胺第1周期150 mg/m2，D1-5，每28 d重復；如能耐受，從第2周期起劑量可增加至200 mg/m2，常規(guī)循環(huán)6個周期，化療期間附加減輕胃腸道反應藥物。同步放化療方案：采用標準放療方式，同時每天口服替莫唑胺75 mg/m2，持續(xù)42 d。

1.3 免疫組織化學方法 鼠抗人MGMT單克隆抗體(1∶100)和鼠抗人EGFR單克隆抗體(1∶100)購自O(shè)rigene公司，鼠抗人P53單克隆抗體(1∶1 000)和鼠抗人Bcl-2單克隆抗體(1∶200)購自Dako公司，鼠抗人VEGF多克隆抗體(1∶100)購自Biogenex公司。將GBM組織連續(xù)切片，免疫組織化學方法采用SP法，具體實驗步驟根據(jù)說明書在Benchmark XT staining module(Ventana Medical Systems)上全自動進行。PBS液代替一抗作為陰性對照。細胞漿和(或)細胞核為棕黃色至深棕黃色且明顯高于背景者為染色陽性細胞。所有指標高表達的評判標準：切片中5個高倍視野(×400)下陽性細胞率>10%(圖1)。

1.4 隨訪方法 所有患者出院后都接受電話隨訪。以手術(shù)當天至有確切的影像學資料且依據(jù)RANO標準[4]提示患者GBM復發(fā)或隨訪截止日期跨度定義為無進展生存期，以手術(shù)當天至患者因GBM死亡或隨訪截止日期跨度定義為總生存期。平均隨訪時間為16.2(95%CI13.6～18.8)個月。

A：MGMT陽性；B：EGFR陽性；C：VEGF陽性；D：P53陽性；E：Bcl-2陽性；標尺= 50 μm

1.5 統(tǒng)計學方法 使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。首先使用Kaplan-Meier法進行單因素分析，以總生存期和無進展生存期為因變量，分別檢驗臨床變量和免疫組化指標對患者預后的影響，并制作生存曲線；同時使用Log-rank進行組間差異顯著性比較。對單因素分析有統(tǒng)計學意義的因素進行Cox比例風險模型分析(輸入法)，并計算每個變量的比值比(odds ratio，OR)及其95%CI。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基本資料 128例患者中術(shù)前出現(xiàn)癲癇有30例(23.4%)，術(shù)中完全切除腫瘤和完成Stupp治療方案的分別為76例(59.4%)和67例(52.3%)。到隨訪截止日期，腫瘤復發(fā)和因膠質(zhì)瘤死亡分別為81例(63.3%)和112例(87.5%)，見表1。中位總生存期為11.2(95%CI9.9～12.5)個月，平均總生存期為18.6(95%CI15.1～22.0)個月，中位無進展生存期為6.1(95%CI5.4～6.8)個月，平均無進展生存期為13.3(95%CI10.0～16.5)個月。截止至隨訪結(jié)束，共有112例患者因GBM死亡，他們的平均總生存期為13.5(95%CI11.2～15.8)個月。

2.2 單因素分析結(jié)果 患者年齡、術(shù)前KPS、腫瘤切除程度和術(shù)后是否同步放化療對總生存期和無進展生存期都有影響(P<0.05)；同時，腫瘤的MGMT和EGFR表達分別對患者的總生存期和無進展生存期有影響，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)?；颊咝詣e、術(shù)前有無癲癇、腫瘤部位、腫瘤體積以及VEGF、P53和Bcl-2的表達對患者的總生存期和無進展生存期無統(tǒng)計學意義上的影響(P>0.05)。見表2。

表1 128例GBM患者臨床特征

表2 GBM患者無進展生存期和總生存期的單因素分析結(jié)果

2.3 多因素分析結(jié)果 Cox比例風險模型分析結(jié)果顯示，患者年齡、術(shù)前KPS評分、腫瘤切除程度、術(shù)后是否進行同步放化療以及MGMT的表達是總生存期的獨立影響因素(P<0.05)；同時，患者年齡、腫瘤切除程度、術(shù)后是否進行同步放化療以及EGFR的表達是無進展生存期的獨立影響因素(P<0.05)。見表3。

2.4 MGMT在同步放化療患者的預后價值 本研究進一步探究MGMT的表達對術(shù)后完成放化療患者的預后價值。結(jié)果顯示，MGMT高表達的患者的總生存期比MGMT低表達的患者的總生存期更短，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.034)。然而，兩組在無進展生存期上無明顯差異(P=0.310)。

表3 GBM患者無進展生存期和總生存期的多因素分析結(jié)果

3 討論

本研究旨在分析GBM患者的臨床特征和免疫組化結(jié)果，探究這些變量尤其是免疫組化的結(jié)果對預后判斷的價值，從而指導臨床治療，最大程度延長患者生存期。本研究單因素和多因素生存分析皆提示患者的年齡越小、腫瘤全切、術(shù)后進行同步放化療皆有利于延長患者的總生存期和無進展生存期，另外術(shù)前KPS是無進展生存期的獨立影響因素。該結(jié)果與國內(nèi)外文獻[5-9]報道一致?；颊咝g(shù)前較好的身體狀況使其可以耐受手術(shù)尤其腫瘤全切的手術(shù)以及術(shù)后放化療帶來的不良反應。年齡方面，隨著患者年齡增長，其身體狀況越差，耐受手術(shù)的能力下降，接受腫瘤全切的可能性越小，本研究證實年齡較大組(≥ 53歲，53.5%)接受全切的比例相比年齡較小組(<53歲，66.7%)的低；并且術(shù)后恢復相對緩慢且效果不理想，接受術(shù)后放化療的可能性相對較小，本研究證實年齡較大組(≥ 53歲，47.8%)接受同步放化療的比例相比年齡較小組(<53歲，62.5%)的低。因此患者年齡越大，其預后相對越差，即無進展生存期和總生存期越短。術(shù)后接受放化療治療可以有效殺死殘余的腫瘤細胞，延長患者的無進展生存期，進而延長患者的總生存期。

替莫唑胺作為一種烷化劑能將烷基引入DNA骨架多個位置從而阻礙DNA的復制，誘發(fā)凋亡。而MGMT編碼的一種DNA修復蛋白能迅速逆轉(zhuǎn)DNA的烷基化，修復DNA的堿基結(jié)構(gòu)從而阻止替莫唑胺誘導的細胞凋亡，最終導致腫瘤細胞對替莫唑胺耐藥。MGMT啟動子甲基化使其無法編碼DNA修復蛋白，提高膠質(zhì)瘤對替莫唑胺的敏感性，從而改善化療患者的預后[7，10]。本研究雖然沒有對MGMT啟動子甲基化的進行檢測，但已有研究證明MGMT基因啟動子甲基化狀態(tài)與MGMT蛋白低表達相關(guān)[11-12]，MGMT啟動子甲基化可能引起MGMT蛋白的表達受抑制，進而抑制DNA修復蛋白的作用使得腫瘤細胞對替莫唑胺敏感。有趣的是，也有報道說MGMT啟動子甲基化能增加膠質(zhì)瘤的放療敏感性[13]。MGMT啟動子甲基化能預測患者的預后已得到多項研究的支持[7-8，10，14]，但MGMT蛋白表達是否有同樣效應仍存在爭議[7，11，14]，這可能與MGMT蛋白的檢測方式、染色評分標準、樣本量有限和患者入組標準不同有關(guān)。本研究多因素生存分析結(jié)果表明，MGMT高表達的患者其總生存期較低表達患者明顯縮短，差異有統(tǒng)計學意義，說明MGMT的蛋白表達能有效預測GBM患者的預后。為了探索MGMT的免疫組化表達對同步放化療敏感性的預測能力，本研究還進一步對比MGMT高表達和低表達患者在術(shù)后接受同步放化療后的無進展生存期和總生存期。67(52.3%)例患者術(shù)后完成了同步放化療。在這類患者中，MGMT低表達的患者的總生存期比高表達患者明顯延長，說明MGMT的蛋白表達能預測膠質(zhì)瘤對同步放化療的敏感度以及患者的預后。因此，對于術(shù)后免疫組化提示MGMT低表達的患者，為有效延長其生存期，應當積極地進行同步放化療。

EGFR作為一種跨膜蛋白受體，既有調(diào)控正常細胞增殖、分化與凋亡的功能，也參與了腫瘤細胞的血管發(fā)生、侵襲和轉(zhuǎn)移等[15]。該基因的突變和擴增分別占GBM的9.2%和27%，說明其在GBM的形成和發(fā)展過程中有重要作用[16-17]。在本研究里，EGFR高表達的患者占了68%，并且EGFR高表達的患者(89.4%)相比低表達的患者有更大的比例出現(xiàn)腫瘤復發(fā)(75%)。多因素分析結(jié)果顯示，EGFR高表達是GBM患者手術(shù)切除術(shù)后復發(fā)的獨立危險因素。影響GBM患者預后的決定性因素是腫瘤的復發(fā)，而GBM術(shù)后復發(fā)的比例相當高，在本研究截止隨訪日期時達到了63.3%。國內(nèi)外的研究表明，GBM患者在腫瘤復發(fā)后進行二次手術(shù)甚至多次手術(shù)皆有利于延長患者的生存期[9，18]。因此，EGFR高表達的患者因為有更高的腫瘤復發(fā)風險，為延長腫瘤的復發(fā)時間以及改善預后，應定期影像學復查，醫(yī)生也應更為密切地隨訪此類患者，以早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的復發(fā)，為二次手術(shù)甚至多次手術(shù)爭取時間和空間。

P53基因包括野生型和突變型兩種形式。野生型P53是抑癌基因，在DNA損傷或缺氧時活化可通過阻斷細胞周期或者促使細胞凋亡來抑制癌癥，有利于腫瘤患者的預后。突變型P53基因失去了抑癌功能，導致細胞無限增生，最終形成惡性腫瘤，與腫瘤患者預后呈負相關(guān)。在蛋白表達方面，突變型的P53蛋白相比野生型的P53蛋白半衰期長，因此在免疫組化表達上呈現(xiàn)高表達[19]。并且P53蛋白表達水平與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān)[20-21]。然而，在本研究的單因素生存分析中，P53高表達患者相比低表達患者的總生存期和無進展生存期沒有明顯差異。我們認為可能本研究的樣本量相對有限，導致一些相對細小但有統(tǒng)計學意義的差異無法被檢驗出來，未來有必要擴大樣本量進一步驗證P53蛋白表達與患者預后的關(guān)系。在一篇涉及1322個中國膠質(zhì)瘤患者的Meta分析中，P53的免疫組化表達不僅被證實與膠質(zhì)瘤的WHO級別呈正相關(guān)，還與膠質(zhì)瘤患者的1年、3年和5年總生存期有關(guān)，P53的免疫組化表達能有效地預測患者的預后[21]。

同P53一樣，本研究也未能證明VEGF和Bcl-2在GBM患者存在預后價值，雖然已有Meta分析證實VEGF的免疫組化表達能預測患者的預后[22]。或許更多的樣本量、更為有效的檢測手法可以更好地探究它們的預后價值。

綜上所述，影響GBM患者預后的因素除了年齡、術(shù)前KPS、腫瘤切除程度、術(shù)后同步放化療外，MGMT和EGFR的表達也能預測患者的預后，并且MGMT高表達的患者接受同步放化療有利于延長生存期。為改善患者預后，對于MGMT低表達的患者，因其對放化療敏感，應積極地行同步放化療以改善預后；對于EGFR高表達的患者，因其有更高的腫瘤復發(fā)風險，應定期影像學復查并對其密切地隨訪以早期發(fā)現(xiàn)腫瘤的復發(fā)早期治療。