黃粉甲儲(chǔ)存蛋白hexamerin基因的克隆及表達(dá)分析

徐志文 任雪敏 趙 滿 劉乃勇 吳國星 楊 斌 朱家穎

( 1. 西南林業(yè)大學(xué)云南省森林災(zāi)害預(yù)警與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650233；2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201)

儲(chǔ)存蛋白（SP）為昆蟲生長發(fā)育提供重要的營養(yǎng)，該蛋白首次于1969年從處于變態(tài)階段的麗蠅（Calliphora erythrocephala）體內(nèi)被提取并鑒定，命名為麗蠅蛋白（Calliiphorin）[1]。因其是由6個(gè)相同或者相似的亞基聚合而成的球形六聚體，通常被稱作hexamerin（六聚體蛋白）。Hexamerin是昆蟲體內(nèi)普遍存在的一種特異性血淋巴蛋白，其分子量在60～110 kDa之間，大多在80 kDa左右[2-5]。它與節(jié)肢動(dòng)物酪氨酸酶、甲殼綱的血藍(lán)蛋白、雙翅目芳基蛋白受體具有相同的起源，屬于血藍(lán)蛋白超家族，被認(rèn)為是由血藍(lán)蛋白的含銅載氧體失去載氧功能進(jìn)化而來[4，6-7]。它通常在幼蟲或若蟲的脂肪體中合成并釋放到血淋巴中，在老熟幼蟲的血淋巴中濃度及含量達(dá)到最大，待幼蟲化蛹時(shí)又以蛋白顆粒的形式重新被脂肪體選擇性吸收進(jìn)入脂肪體[8-9]。

儲(chǔ)存蛋白hexamerin是蛋白質(zhì)和氨基酸的儲(chǔ)存庫[1，8]。并且，hexamerin在昆蟲生長發(fā)育、免疫和雌性卵發(fā)育等過程中發(fā)揮著重要作用，還能直接參與表皮的形成、滯育、親脂性物質(zhì)運(yùn)輸、能量代謝以及變態(tài)[10-13]。如在紅頭麗蠅（C. uicina）、家蠅（Musca domestica）、煙草天蛾（Manducasexta）等昆蟲中，hexamerin參與幾丁質(zhì)表皮組織的構(gòu)建和蛋白質(zhì)組成[11，14]；在馬鈴薯甲蟲（Leptinotarsa decemlineata）[15]和始紅蝽（Pyrrhocoris apterus）[16]中，hexamerin與成蟲滯育有關(guān)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)hexamerin參與親脂性物質(zhì)運(yùn)輸[17]，特別是參與疏水的脂溶性殺蟲劑運(yùn)輸[18]，部分hexamerin還參與能量代謝[2]。雖然hexamerin有諸多功能，但是在完全變態(tài)昆蟲中，其最主要的功能是作為儲(chǔ)存蛋白為幼蟲變態(tài)發(fā)育提供營養(yǎng)物質(zhì)[19]，為成蟲生長發(fā)育提供氨基酸和能量[8]。

黃粉甲（Tenebrio molitor）作為飼養(yǎng)管氏腫腿蜂（Sclerodermus guani）的重要替代寄主，為人工繁蜂及釋放管氏腫腿蜂防治林木蛀干害蟲提供了重要的價(jià)值。同時(shí)，黃粉蟲也是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲和倉儲(chǔ)害蟲，而且能危害天然纖維，如藺草（Schoenoplectus trigueter）、蘆葦（Phragmites communis）等編織物，對我國藺草制品出口產(chǎn)業(yè)造成巨大威脅。因其具有容易飼養(yǎng)、適合遺傳雜交、易開展RNAi實(shí)驗(yàn)等優(yōu)點(diǎn)，所以可作為理想的模式昆蟲。目前，就黃粉甲貯藏蛋白的研究而言，僅在其幼蟲中發(fā)現(xiàn)了1個(gè)分子量為86 kDa的包囊蛋白與在滯育中起重要作用的儲(chǔ)存蛋白具有很高的相似性[20]。為此，本研究以黃粉甲為試驗(yàn)材料，克隆獲得了2個(gè)hexamerin基因（命名為TmolHex1和TmolHex2），并對其序列和表達(dá)特征進(jìn)行了分析，研究結(jié)果為今后揭示hexamerin的生物學(xué)功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

供試?yán)ハx飼養(yǎng)參照Zhu等[21]的方法，黃粉甲為在實(shí)驗(yàn)室以飼料飼養(yǎng)繁殖多代的種群。

1.2 基因克隆

利用TRIzol（Invitrogen）試劑，參照試劑盒說明書提取黃粉甲蛹總RNA?？俁NA經(jīng)分光光度法測定其含量和純度后，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性。以提取的高質(zhì)量RNA為模板，用SMARTTMRACE cDNA amplification kit （Clontech）合成cDNA模板。以實(shí)驗(yàn)室前期對黃粉甲cDNA文庫測序獲得的hexamerin基因3′端序列為依據(jù)，用Primer Premier 5.0分別設(shè)計(jì)TmolHex1的 5′ RACE（5′-CCGTAGTACTGTTGTTTGTACCTGT-3′）和TmolHex2的 5′ RACE（5′-CGTTGGCATAGTAGAACAACTT-3′）特異性引物。參照RACE試劑盒說明書，PCR擴(kuò)增獲得基因的5′端序列。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性 3 min；94 ℃ 變性 35 s，60 ℃ 退火 30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將獲得的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切取的目的條帶純化后送至上海杰李生物技術(shù)有限公司測序。

1.3 序列分析

將實(shí)驗(yàn)室前期對cDNA文庫測序得到的序列和克隆測序獲得的序列，拼接得到TmolHex1和TmolHex2的基因全長。利用在線軟件ORF Finder（www.ncbi.nlm.nih.Gov/gorf/gorf.html）預(yù)測基因的開放閱讀框，DNAMAN預(yù)測分子量及等電點(diǎn)，Genetyx軟件將其基因的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列并分析其組成成分，SignalP 4.1 Server （http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測，NetNGlyc 1.0 Server分析氨基酸序列N-糖基化位點(diǎn)，ClustalX 1.83軟件進(jìn)行多序列比對。

1.4 熒光定量PCR

選擇剛蛹化1 d的黃粉甲蛹，將蛹放置于冰上取其表皮、脂肪體和血細(xì)胞3種組織，同時(shí)收集黃粉甲低齡幼蟲（1～3齡幼蟲混合樣品）、高齡幼蟲（7～9齡幼蟲混合樣品）、老熟幼蟲（12～14齡幼蟲混合樣品）、蛹化1 d的蛹和羽化1 d的成蟲。每組樣品收取3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，收取的材料放置于盛有TRIzol試劑的1.5 mL離心管中，研磨后保存在-80 ℃超低溫冰箱中備用。

采用TRIzol（Invitrogen）試劑提取黃粉甲不同發(fā)育階段和蛹不同組織樣品的總RNA，提取的總RNA去除DNA后，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板。根據(jù)克隆獲得的TmolHex1和TmolHex2序列，設(shè)計(jì)TmolHex1的熒光定量正向引物（5′-AGTCATCCAGCAAGCATACAG-3′） 和 反 向引 物（5 ′-TAGAAGGAGTTGAGGCGTA-3′） 及TmolHex2的正向引物（5′-ATTACGCACAGAAGCAGAAAG-3′）和反向引物（5′-CAAATGGTAGTTGTGGGAGAT-3′），以 18S RNA基因（正向引物 5′-TTTCAAATGTCTGCCTTATC-3′和反向引物 5′-TGTGGTAGCCGTTTCTCA-3′）作為內(nèi)參，使用Rotor Gene-Q熒光定量PCR儀檢測2個(gè)基因在黃粉甲不同發(fā)育階段和蛹期不同組織的表達(dá)水平，每個(gè)處理重復(fù)3次。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，45個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT方法進(jìn)行計(jì)算[22]，同一處理下的基因相對表達(dá)量用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差（One-way ANOVA）統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及序列分析

克隆獲得的TmolHex1（GeneBank登錄號(hào)：KF734080） 和TmolHex2（ GeneBank登 錄 號(hào) ：KF734081）的開放閱讀框（ORF）的長度分別為2 133 bp和2 103 bp，可編碼氨基酸分別為710個(gè)和700個(gè)，5′端非編碼區(qū)分別為12 bp和28 bp，3′端非編碼區(qū)分別為125 bp和109 bp。其推導(dǎo)的氨基酸序列預(yù)測理論分子量分別為85.53 kDa和84.35 kDa，理論等電點(diǎn)分別為6.05和6.72。TmolHex1和TmolHex2均存在 2個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。SignalP分析發(fā)現(xiàn)，TmolHex1和TmolHex2的氨基酸序列中均存在信號(hào)肽序列，分別為MKLLVAILALGAFACTYPQVQI和MRLILVALLAGLCAVSA。對 TmolHex1和 TmolHex2的氨基酸組成進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（表1），TmolHex1蛋白中的甲硫氨酸和芳香族氨基酸含量分別為0.14%和22.25%（苯丙氨酸5.63%、酪氨酸16.20%、色氨酸0.42%），而TmolHex2蛋白中的甲硫氨酸和芳香族氨基酸含量分別為2.57%和21.86%（苯丙氨酸6.86%、酪氨酸13.86%、色氨酸1.14%），表明它們屬于芳香族儲(chǔ)存蛋白。

表 1 TmolHex1和TmolHex2氨基酸組成成分分析Table 1 Analysis of amino acid composition of TmolHex1 and TmolHex2

多序列比對分析發(fā)現(xiàn)，TmolHex1與赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、柞蠶（Antheraea pernyi）、黑帶二尾舟蛾（Cerura vinula）的hexamerin氨基酸一致性分別為58%、32%、32%和32%（圖1），而TmolHex2與這些昆蟲hexamerin氨基酸一致性分別為72%、31%、31%和32%（圖1）。Tmol-Hex1和TmolHex2具有保守的芳香貯存蛋白家族特征序列，其中TmolHex1的為YFTEDVRLNSFYYYYNIYYP和 TSLRDPAFY，TmolHex2的為YYMEDVGLNSFYYYYNLYYP和TSLRDPAFY。

2.2 表達(dá)特征

在不同發(fā)育階段，TmolHex1基因在高齡幼蟲和老熟幼蟲中的表達(dá)量明顯高于其他發(fā)育階段的表達(dá)量，蛹中的表達(dá)量次之，低齡幼蟲和成蟲期的表達(dá)量最低（圖2）。TmolHex2基因在老熟幼蟲和蛹期的表達(dá)量明顯高于其他發(fā)育階段的表達(dá)量，高齡幼蟲的表達(dá)量次之，低齡幼蟲和成蟲期的表達(dá)量最低（圖2）。在蛹期不同組織中，TmolHex1和TmolHex2基因在脂肪體中的表達(dá)量最高，血細(xì)胞中的表達(dá)量次之，而表皮中的表達(dá)量最低（圖3）。

圖 2 TmolHex1和TmolHex2基因在不同發(fā)育階段的相對表達(dá)量Fig. 2 Relative expression levels of TmolHex1 and TmolHex2 genes of T. molitor at different developmental stages

圖 3 TmolHex1和TmolHex2基因在蛹期不同組織中的相對表達(dá)量Fig. 3 Relative expression levels of TmolHex1 and TmolHex2 genes in different tissues of T. molitor pupae

3 結(jié)論與討論

在現(xiàn)今的研究報(bào)道中，研究者以hexamerin中芳香族氨基酸、甲硫氨酸、酪氨酸等重要氨基酸的含量為依據(jù)，可將其劃分為4類：1）芳香蛋白，酪氨酸和苯丙氨酸的總含量為16%～25%，而甲硫氨酸的含量少于3%[23]；2）富甲硫氨酸蛋白，甲硫氨酸的含量為4%～11%，而芳基氨基酸含量小于15%[24]；3）雙翅目幼蟲血清蛋白（Larval serum protein 2， LSP-2），芳香氨基酸和甲硫氨酸的含量比麗蠅蛋白（calliphorin）中的含量少[25]；4）其他，如高甲硫氨酸和酪氨酸含量的芳基蛋白、核黃素結(jié)合蛋白和保幼激素抑制蛋白等[2，26]。 基 于 hexamerin 的 分 類 ， TmolHex1 和TmolHex2富含芳香族氨基酸，且氨基酸序列中存在芳香家族貯存蛋白的保守序列[12，27]，表明TmolHex1和TmolHex2隸屬于芳香族類。這一結(jié)果與目前報(bào)道的鞘翅目hexamerin均為芳香族氨基酸的結(jié)果相符[28-29]。

TmolHex1和TmolHex2基因在老熟幼蟲和蛹期的脂肪體中表達(dá)量高，該研究結(jié)果與在桔小實(shí)蠅（Bactrocera dorsalis）、米蛾（Corcyra cephalonica）、大豆食心蟲（Leguminivora glycinivorella）、家蠅等昆蟲中的報(bào)道相似[30-32]。同時(shí)，研究還發(fā)現(xiàn)TmolHex1和TmolHex2基因在黃粉甲蛹期和成蟲期的表達(dá)量相對于老熟幼蟲中的表達(dá)量顯著較低，且在成蟲期的表達(dá)量相對于蛹期也明顯下降?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，貯存蛋白一般由取食的幼蟲合成，在蛹期以蛋白質(zhì)晶體儲(chǔ)存在脂肪體細(xì)胞中，到成蟲期幾乎全部降解為氨基酸，從而認(rèn)為它的功能可能為蛋白質(zhì)和氨基酸的儲(chǔ)存庫，并參與成蟲蛋白質(zhì)的合成，被降解得到的肽類或氨基酸可為成蟲發(fā)育和生殖所利用[2，5，33-35]。TmolHex1和TmolHex2基因在不同發(fā)育階段和蛹組織中的表達(dá)特征表明，它們可通過高表達(dá)得以在老熟幼蟲的血淋巴中大量積累，并可在幼蟲化蛹過程中又以蛋白顆粒的形式重新被脂肪體選擇性的吸收進(jìn)入脂肪體[8-9]。為此，推測認(rèn)為，它們的主要功能應(yīng)該是作為儲(chǔ)存蛋白為昆蟲提供所需的氨基酸和能量，參與黃粉甲的變態(tài)發(fā)育。and Physiology， 1990， 15(1): 33-41.