前列腺癌移植瘤近紅外熒光成像最佳成像時(shí)間的實(shí)驗(yàn)

薛亞洲，李虹君，趙家紅，張瑞，李曉慧，龐建智，楊曉峰

0 引言

前列腺癌（prostate cancer, PCa）是中老年男性常見(jiàn)的惡性腫瘤，在美國(guó)，其發(fā)病率位居男性惡性腫瘤的首位。近年來(lái)，隨著老齡化時(shí)代的到來(lái)、飲食習(xí)慣的改變，我國(guó)前列腺癌的發(fā)病率和死亡率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)，其增長(zhǎng)速度甚至超過(guò)歐美[1]。治療局限性PCa最有效的外科方式是根治性前列腺切除術(shù)（radical prostatectomy, RP），同期進(jìn)行的盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)（pelvic lymph node dissection, PLND）是診斷PCa有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移最準(zhǔn)確的方法[2]。

吲哚菁綠（indocyanine green, ICG）是一種暗青色的近紅外熒光染料，其發(fā)射光在組織中的穿透深度達(dá)1～5 cm，且受生物組織本底的影響較小，可在近紅外區(qū)域呈現(xiàn)熒光，目前常用于血管、視網(wǎng)膜、肝臟腫瘤的診斷和治療[3]。近十余年來(lái)逐漸應(yīng)用于熒光引導(dǎo)的手術(shù)操作及臨床研究。有研究報(bào)道ICG腫瘤局部注射時(shí)，染料外溢影響觀察效果[4-6]。

2015年Jiang等[7]報(bào)道了一種通過(guò)靜脈注射ICG顯影實(shí)體腫瘤的新型注入技術(shù)，該技術(shù)能夠使ICG在實(shí)體腫瘤中聚集。其他機(jī)構(gòu)的研究證實(shí)ICG在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、肺癌及其前哨淋巴結(jié)中也有良好的顯影效果[8-10]。

為此，本實(shí)驗(yàn)在前期研究的基礎(chǔ)上，建立了前列腺癌皮下移植瘤裸鼠模型，通過(guò)尾靜脈注射ICG，進(jìn)一步研究靜脈注射ICG體外近紅外熒光成像前列腺癌移植瘤顯像的動(dòng)態(tài)特征，最佳顯影時(shí)間及成像機(jī)制，為臨床應(yīng)用ICG近紅外熒光成像、術(shù)中引導(dǎo)前列腺癌根治提供明確的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人前列腺癌細(xì)胞系PC3細(xì)胞購(gòu)于上海中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。SPF級(jí)BALB/c-BU雄性裸鼠10只[許可證號(hào)：SCXK(蘇)2016-0010]，3～4周齡，體質(zhì)量15～18 g，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供并給予品系來(lái)源證明。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，籠具、墊料、飼料及飲用水均經(jīng)過(guò)嚴(yán)格滅菌處理。

1.1.2 設(shè)備 近紅外熒光顯影儀器為多光譜分光融合外科手術(shù)引導(dǎo)系統(tǒng)（multispectral separatemerge guided surgery device，MGS），由太原賽恩思科技發(fā)展有限公司提供，型號(hào)SENA1-001，激發(fā)光波長(zhǎng)（760±10）nm。

1.1.3 試劑 近紅外熒光染料選用國(guó)產(chǎn)注射用吲哚菁綠，丹東醫(yī)創(chuàng)藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H20045514，25 毫克/支。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

PC3細(xì)胞株培養(yǎng)在含10%標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清（北京賽澳美細(xì)胞技術(shù)有限公司）的DMEM/F12培養(yǎng)基（武漢博士德公司）中，0.25%胰蛋白酶消化，傳代。

1.3 建立裸鼠前列腺癌移植瘤模型

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC3細(xì)胞株消化，1200 r/min離心5 min，以完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞數(shù)量至1×107個(gè)，1200 r/min再次離心5 min，棄上清液。在0℃冰上將PC3細(xì)胞重懸浮于200 μl的Matrigel基質(zhì)膠（美國(guó)BD公司）中。用經(jīng)過(guò)預(yù)冷的1 ml注射器抽取細(xì)胞懸液，接種至裸鼠右前肢腋窩皮下，飼養(yǎng)溫度為25℃±1℃。約2周后，移植瘤長(zhǎng)至約15 mm×15 mm時(shí)進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究[11]。

1.4 腫瘤近紅外熒光顯影

10只荷瘤裸鼠，完全隨機(jī)編號(hào)1～10號(hào)，其中1～7號(hào)裸鼠使用2%（體積分?jǐn)?shù)）戊巴比妥鈉（2 ml/kg）腹腔注射麻醉后固定于動(dòng)物板上。通過(guò)尾靜脈將10 mg/kg的ICG注入裸鼠體內(nèi)，多光譜分光融合外科手術(shù)引導(dǎo)系統(tǒng)下進(jìn)行顯影，分別于1 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、18 h、24 h、48 h和72 h在近紅外熒光成像儀下觀察裸鼠腫瘤及全身顯影情況并采集圖片，使用ImageJ軟件（http://rsb.info.nih.gov/ij/，美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院）計(jì)算腫瘤及背景圖像的灰度值，選擇合適的感興趣區(qū)域（regions of interest, ROI），計(jì)算腫瘤與背景的比率（tumor-to-background ratio, TBR）。

通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)步驟獲得腫瘤最佳時(shí)間，8～10號(hào)裸鼠采用相同的實(shí)驗(yàn)方式注射10 mg/kg的ICG。于腫瘤最佳顯影時(shí)間點(diǎn)剖取腫瘤組織、肝臟、胃、小腸、大腸、腎臟及瘤旁脂肪組織行離體近紅外熒光成像，計(jì)算各臟器及組織的平均灰度值，并比較灰度值大小。

將獲得的腫瘤組織用福爾馬林固定，制成石蠟病理切片，熒光顯微鏡下觀察腫瘤組織的熒光顯影情況。

2 結(jié)果

1～7號(hào)裸鼠經(jīng)尾靜脈注射ICG后，肝臟、甲狀腺以及眼睛部位于注射后即刻顯影。隨著時(shí)間的推移，腫瘤部位熒光逐漸增強(qiáng)，瘤周背景熒光相對(duì)減弱，12 h起獲得良好的TBR，此時(shí)腫瘤顯影效果最佳，并延續(xù)至24 h，48 h腫瘤及背景熒光均明顯減弱，72 h腫瘤及瘤周背景熒光完全消失，見(jiàn)圖1～2。

圖1 裸鼠腫瘤及背景熒光強(qiáng)度和腫瘤背景比值隨時(shí)間推移的變化情況Figure1 Changes of tumor and background fluorescence intensity and tumor background ratio over time in nude mice

圖2 注射ICG 24h后裸鼠的全身顯影效果圖Figure2 Whole-body development effect of nude mice after ICG injection for 24 h

由以上結(jié)果知12～24 h為腫瘤最佳顯影時(shí)間區(qū)間，將8～10號(hào)裸鼠于24 h進(jìn)行解剖，觀察到肝臟、胃、大腸、小腸、腎臟、腫瘤顯影，瘤周脂肪組織未見(jiàn)明顯顯影，見(jiàn)圖3。計(jì)算各組織及器官的平均灰度值：腫瘤為69.93、肝臟為80.16、胃為210.18、小腸為105.89、大腸為166.23、腎臟為57.91、瘤周脂肪為21.43?？芍@影效果：胃＞大腸＞小腸＞肝臟＞腫瘤＞腎臟＞瘤周脂肪組織。

熒光顯微鏡觀察腫瘤組織的病理切片，可見(jiàn)明顯綠色熒光信號(hào)，見(jiàn)圖4，為ICG染料本身的顏色，從而說(shuō)明ICG積聚于腫瘤組織中。

3 討論

圖3 注射ICG 24h后裸鼠腫瘤組織、各臟器及周圍脂肪組織顯影效果Figure3 Imaging effect of tumor tissue, organs and surrounding adipose tissue in nude mice after injection of ICG for 24 h

圖4 PC3移植瘤病理(A)和熒光顯微鏡下(B) 檢查結(jié)果 (×200)Figure4 Pathological(A) and fluorescence microscopy(B)results of PC3 xenograft tumor (×200)

RP是治療局限性前列腺癌最常用的臨床手段，完整的切除腫瘤及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)對(duì)于PCa患者的預(yù)后至關(guān)重要[12]。目前關(guān)于PCa及盆腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的檢測(cè)手段主要有4種方式：常規(guī)的斷層掃描CT、MRI、腫瘤功能性成像膽堿PET/CT以及前列腺癌特異性成像前列腺特異性膜抗原（The prostate-specific membrane antigen, PSMA）PET/CT。最新的PSMA PET/CT可以將前列腺盆腔淋巴結(jié)檢出率提升至66%，但仍然有1/3的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移被漏診[13]。并且以上4種影像學(xué)檢查只能用于術(shù)前評(píng)估，無(wú)法實(shí)時(shí)指導(dǎo)手術(shù)操作，導(dǎo)致前列腺癌手術(shù)仍然難以避免陽(yáng)性切緣及陽(yáng)性淋巴結(jié)的遺漏。

光學(xué)分子成像技術(shù)的發(fā)展為解決以上問(wèn)題提供了新的思路。光學(xué)分子成像是一種采用光學(xué)儀器和設(shè)備在活體狀態(tài)下從微觀上顯示組織、細(xì)胞及亞細(xì)胞水平的影像技術(shù)，具有實(shí)時(shí)、無(wú)創(chuàng)、精準(zhǔn)及敏感等特點(diǎn)，可在細(xì)胞和分子水平進(jìn)行腫瘤早期篩查和診斷[14]。其原理為采用熒光報(bào)告集團(tuán)或熒光染料標(biāo)記的目的細(xì)胞，通過(guò)敏感的光學(xué)成像儀器，檢測(cè)活體生物體內(nèi)細(xì)胞生物學(xué)行為[15]。目前有多種光學(xué)成像方式可以在術(shù)中使用，例如可見(jiàn)光、紫外線和紅外線。與可見(jiàn)光相比，近紅外光具有組織穿透深度大、背景吸收散射度低、自發(fā)熒光少、信噪比高等優(yōu)點(diǎn)[16]。ICG作為目前最常用的一種近紅外熒光染料，已經(jīng)被用于諸多腫瘤以及前哨淋巴結(jié)（sentinel lymph node, SLN）的檢測(cè)。2008年Kusano等[17]進(jìn)行了胃腸道惡性腫瘤ICG熒光成像引導(dǎo)的SLN可行性研究。該研究小組在術(shù)中為胃癌及直腸癌患者腫瘤周圍注射一定濃度的ICG，其中胃癌患者SLN的檢出率為90.9%，直腸癌患者的檢出率為88.5%，證明了ICG用于胃腸道SLN顯影的可行性。2010年Hojo等[18]對(duì)142例乳腺癌患者使用ICG標(biāo)記SLN，檢出結(jié)果為99.3%（140/142），平均檢出數(shù)量約為3.8個(gè)，證實(shí)ICG在乳腺癌的淋巴結(jié)清掃術(shù)中發(fā)揮著重要的臨床意義。2018年查小應(yīng)等[19]將ICG溶液注射至甲狀腺癌患者的腫瘤周圍，通過(guò)熒光示蹤標(biāo)記法對(duì)甲狀腺癌患者進(jìn)行SLN活檢，檢出率高于70%，且陰性率低于20%，局部注射ICG用于甲狀腺癌SLN活檢具有重要的臨床參考價(jià)值。為了探求ICG在前列腺癌手術(shù)中的使用效果，多家國(guó)外機(jī)構(gòu)試圖在前列腺內(nèi)注射ICG，以期望觀察到前列腺腫瘤及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)[4-6]。然而，與胃腸道手術(shù)相比，前列腺體積較小且質(zhì)韌。此外，由于骨盆的限制，RP手術(shù)操作空間常常受限。以上原因?qū)е铝司植孔⑸銲CG的難度較大，容易出現(xiàn)腫瘤周圍的ICG染料溢出，使血管及臨近組織均產(chǎn)生了不同程度的與轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)同等的高背景干擾信號(hào)。此外，前列腺淋巴系統(tǒng)的引流模式非常復(fù)雜，并顯示出不同的途徑，進(jìn)一步阻礙了在前列腺內(nèi)注射ICG的使用[4,20]。

1986年Matsumura等[21]將伊文思藍(lán)溶液通過(guò)尾靜脈注射至荷瘤小鼠體內(nèi)，觀察到伊文思藍(lán)-血漿蛋白大分子結(jié)合物具有明顯的腫瘤蓄積作用以及很強(qiáng)的滯留性，并提出了實(shí)體腫瘤組織的高通透性和滯留效應(yīng)，簡(jiǎn)稱EPR（enhanced permeability and retention effect）效應(yīng)。EPR效應(yīng)是指當(dāng)腫瘤細(xì)胞增殖、聚集直徑達(dá)2～3 mm時(shí)，自發(fā)誘導(dǎo)形成新生血管系統(tǒng)，其血管形狀不規(guī)則，血管擴(kuò)張；內(nèi)皮細(xì)胞排列疏松、細(xì)胞間隙大。同時(shí)，腫瘤組織中淋巴回流受阻。這些特殊結(jié)構(gòu)可導(dǎo)致分子量大于40 kDa的大分子藥物和膠粒載體廣泛滲入腫瘤組織，蓄積并長(zhǎng)時(shí)間滯留[22]。2015年Jiang等[7]將ICG溶液以5 mg/kg的劑量通過(guò)尾靜脈注射至荷瘤裸鼠體內(nèi)，證實(shí)了腫瘤對(duì)ICG染料的EPR效應(yīng)。

在此基礎(chǔ)上，Zeh等[8]通過(guò)建立神經(jīng)膠質(zhì)瘤的荷瘤裸鼠模型，將5 mg/kg ICG通過(guò)尾靜脈注射入裸鼠體內(nèi)，腫瘤于6～48 h產(chǎn)生了一個(gè)弱于1 h但是持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)并穩(wěn)定的顯影效果。并將這段較長(zhǎng)時(shí)間的穩(wěn)定顯影平臺(tái)期稱之為ICG的“第二時(shí)間窗口”。隨后該研究組在10名膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者身上進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，患者于術(shù)前1天注射5 mg/kg的ICG試劑，手術(shù)時(shí)通過(guò)近紅外儀器顯示：所有患者均出現(xiàn)了腫瘤的顯影，并顯現(xiàn)出明顯的腫瘤邊界。摘除瘤體后行病理檢查，證實(shí)腫瘤邊緣的可靠性，并得出結(jié)論：術(shù)前24 h靜脈注射ICG，能夠達(dá)到良好的手術(shù)顯影效果。隨后，Xia等[20]將此技術(shù)應(yīng)用于4名前列腺癌患者，對(duì)其行機(jī)器人輔助下的RP手術(shù)，并行擴(kuò)大的PLND。在近紅外儀器的輔助下，術(shù)者完整地摘除了前列腺及腫瘤組織，并從3例患者中獲得了額外顯影的淋巴結(jié)，經(jīng)病理證實(shí)為前列腺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)，從而得出結(jié)論：該技術(shù)在前列腺癌患者身上具有可行性。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立前列腺癌荷瘤裸鼠皮下移植瘤模型著重研究了隨著時(shí)間的變化ICG在前列腺腫瘤及全身代謝的情況。通過(guò)尾靜脈將ICG試劑注射至前列腺癌皮下移植瘤體內(nèi)，于12～24 h獲得了最佳的腫瘤顯影效果，此時(shí)腫瘤背景比率最高，為1.40～1.47，并且肉眼可見(jiàn)明確的腫瘤及背景組織分界。這與上文提到的ICG“第二時(shí)間窗口”技術(shù)有時(shí)間上的重疊。但是，本項(xiàng)目組通過(guò)實(shí)驗(yàn)并沒(méi)有于1 h左右觀察到明顯的腫瘤顯影，由于自體熒光的存在，甚至在3 h之前，瘤周的背景熒光強(qiáng)度會(huì)略強(qiáng)于腫瘤本身。我們認(rèn)為此現(xiàn)象與ICG濃聚于前列腺癌腫瘤部位需要一定時(shí)間有關(guān)，故靜脈注射ICG用于前列腺癌荷瘤裸鼠模型，其顯影效果并不完全與Zeh等[8]的“第二時(shí)間窗口”理論相吻合。

同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，由于ICG經(jīng)肝膽代謝進(jìn)入腸道等消化器官，故ICG除濃聚于腫瘤部位，直腸部位也有明顯的熒光信號(hào)。在24 h解剖可知，此時(shí)直腸部位的熒光強(qiáng)度甚至?xí)哂谀[瘤本身，由于前列腺與直腸在解剖關(guān)系上毗鄰，這種現(xiàn)象有可能導(dǎo)致前列腺部位的熒光與直腸部位的熒光重疊，影響RP手術(shù)中熒光導(dǎo)航的圖像效果，但是，由于目前ICG用于臨床RP手術(shù)的案例較少，具體的影響程度仍有待進(jìn)一步的研究和臨床驗(yàn)證。

另外，ICG靜脈注射后12～24 h移植瘤成像效果最佳，與腫瘤組織血管的EPR效應(yīng)有關(guān)。但是，由于單純注射ICG缺乏靶向特異性，其成像效果還有待進(jìn)一步提高。目前有研究小組將ICG與前列腺特異性膜抗原（PSMA）抗體J591相結(jié)合，制造出具有前列腺癌靶向作用的單克隆抗體-熒光團(tuán)綴合物：J591-ICG。在前列腺癌皮下移植瘤的裸鼠模型中，獲得了良好的腫瘤顯影效果[23]。但是該試劑仍然處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段，其藥物安全性仍需要進(jìn)一步的人體試驗(yàn)驗(yàn)證，且復(fù)雜的合成機(jī)制及昂貴的單克隆抗體價(jià)格限制了此試劑的臨床應(yīng)用。盡管如此，ICG與特異性抗體相結(jié)合仍然是未來(lái)腫瘤顯影的發(fā)展方向。

綜上，ICG經(jīng)靜脈注射后可以被前列腺癌腫瘤吸收，并產(chǎn)生良好的腫瘤熒光顯影的效果。腫瘤的最佳顯影時(shí)間是12～24 h，未來(lái)臨床應(yīng)用時(shí)，只需要于術(shù)前晚給患者注射ICG，即可于手術(shù)時(shí)獲得良好的顯影效果，此方式簡(jiǎn)單實(shí)用且安全性佳，將具有廣闊的應(yīng)用前景。