薄層數(shù)碼成像法檢測酒中氨基甲酸乙酯

黃秋婷，王 浩，黃惠華

（1.廣州市食品檢驗所（廣州市酒類檢測中心），廣東廣州511400；2.華南理工大學輕工與食品學院，廣東廣州 510641）

氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是食品在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的物質，在20世紀40年代，EC被發(fā)現(xiàn)具有致癌性，引起了各國對發(fā)酵食品中EC含量的重視[1]。酒中的EC主要是在發(fā)酵過程中，精氨酸的代謝物（尿素、瓜氨酸等氨基甲酰類化合物）與乙醇反應產(chǎn)生[2]?？紤]到酒類食品是人類攝入EC的主要來源，部分國家對酒類食品中的EC含量進行了限定，如加拿大、法國、捷克規(guī)定蒸餾酒中EC的限量為150 μg/L，德國、瑞士對白蘭地中EC的限量分別為800 μg/L和1000 μg/L。

目前國內外對酒中EC的檢測主要采取氣相色譜-質譜法。對于成分復雜、EC含量低的酒類樣品，需要采取不同的萃取和濃縮方式，以減少干擾，提高方法靈敏度[3-7]。此類分析方法準確度高，但存在設備昂貴、前處理復雜、檢測時間長、對人員要求高、檢測成本高等缺點。本實驗采用薄層層析的方法，樣品無需經(jīng)過前處理，直接點樣，結合數(shù)碼成像技術，使用MATLAB軟件[8]對斑點的灰度值進行定量計算，以達到快速測定、降低檢測成本、簡化分析流程的目的。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：40%vol白酒，購自超市。

試劑及耗材：氨基甲酸乙酯標準樣，純度99%，購自阿拉丁公司，實驗時用40%無水乙醇（體積比）作溶劑配制標準液；肉桂醛，色譜級，購自阿拉丁公司；其余試劑如磷酸、丙酮、甲基叔丁基醚、正己烷、甲醇、無水乙醇等，均為分析純。

儀器設備：實驗室自制浸板機；MATLAB軟件；ZF-90D暗箱式紫外分析儀，上海光豪分析儀器有限公司；尼康L330數(shù)碼相機；100×100 mm雙槽展開缸；50×100 mm GF254薄層硅膠板，青島譜科分離材料有限公司；10 μL微量進樣針，上海安亭微量進樣器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 展開條件

薄板層析展開劑的配制：甲基叔丁基醚∶正己烷∶甲醇（5∶7∶2），充分混合均勻后倒入展開缸的一側。在有展開劑的一側放入薄層板，當展開劑前沿到達標線后取出薄層板，在通風柜中晾干。

1.2.2 薄層數(shù)碼成像系統(tǒng)組裝及使用參數(shù)

將尼康L330數(shù)碼相機安裝在ZF-90D暗箱式紫外分析儀的固定支架上，構成一套用于獲取數(shù)字圖像的裝置，紫外燈波長為365 nm，數(shù)碼相機拍攝參數(shù)設置：尺寸2272×1704，曝光時間1 s，ISO速度ISO-200，焦距9毫米，最大光圈3.3，35 mm焦距52，場景為自動模式，白平衡為熒光燈，色彩選項為標準色彩。

1.2.3 薄層顯色實驗步驟

將新購置的薄層板在烘箱中105℃活化30 min后放于干燥器中冷卻備用。在距薄層板端部10 mm，距側面10 mm處點樣，在距另一端20 mm處劃線，作為展開結束的標線。點樣結束后按照1.2展開條件操作。使用實驗室自制浸板機，使薄層板與衍生液接觸。將完成浸板操作的薄層板置于溫度已達到125℃的烘箱中反應，10 min后取出薄層板。待薄層板冷卻后進行拍照，使用MATLAB軟件對獲取的數(shù)字圖像上的EC熒光斑點積分定量。

1.2.4 MATLAB積分定量操作步驟

打開MATLAB，使用imread命令讀取拍攝好的數(shù)字圖像；將數(shù)字圖像的紅色通道和藍色通道矩陣設置為零矩陣；使用imcrop命令截取有斑點部分的數(shù)字圖像，圖像像素大小為400×200；使用rgb2gray命令將截圖的綠色通道圖像轉化為灰度圖；使用wiener2命令去除灰度圖上的噪聲；使用imadjust命令，將圖像中1%的數(shù)據(jù)飽和至最低和最高亮度，保存變換后的圖像；使用im2bw命令，調整閾值，使得獲得的二值圖像的斑點輪廓足夠接近上一步變換后圖像的最高亮度區(qū)域，保存調整好的二值圖；將二值圖與去噪后的灰度圖矩陣點乘，得到需要定量的斑點；使用fliplr命令獲得去噪灰度圖的鏡面圖像，將該圖像與二值圖矩陣點乘，得到同樣斑點大小的背景圖像；將斑點灰度值積分減去背景灰度值積分之后除以斑點像素個數(shù)，得到平均灰度值（平均GL），該值作為后續(xù)的定量指標。

1.2.5 衍生顯色單因素實驗

實驗中使用的EC濃度為10 mg/L，點樣量為10 μL，即在斑點上的EC點樣量為100 ng/點。衍生液溶劑丙酮定為40 mL，肉桂醛250 μL，磷酸2.4 mL。實驗室自制浸板機的浸漬時間默認為3000 ms。

1.2.5.1 肉桂醛含量的優(yōu)化

分別向肉桂醛含量為50 μL、100 μL、150 μL、200 μL、250 μL、300 μL、350 μL、400 μL、450 μL、500 μL的10組燒杯中加入40 mL丙酮和2.4 mL磷酸，充分混合均勻后備用。按照步驟1.2.4操作，每個含量做3個平行樣，比較平均灰度值。

1.2.5.2 磷酸含量的優(yōu)化

分別向含有肉桂醛250 μL的丙酮溶液中加入1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL磷酸，充分混合均勻后備用。按照步驟1.2.3操作，每個含量做3個平行樣，比較平均灰度值。

1.2.5.3 浸板時間的優(yōu)化

配制的肉桂醛衍生液，更改實驗室自制浸板機的浸漬時間分別為 1000 ms、2000 ms、3000 ms、4000 ms、5000 ms。按照步驟1.2.3操作，每個含量做3個平行樣，比較平均灰度值。

1.2.5.4 反應溫度的優(yōu)化

配制肉桂醛衍生液，更改烘箱溫度分別為90℃、100℃、110℃、120℃、130℃。按照步驟1.2.3操作，每個含量做3個平行樣，比較平均灰度值。

1.2.5.5 反應時長的優(yōu)化

配制肉桂醛衍生液，更改薄層板加熱時間分別為 4 min、6 min、8 min、10 min、12 min。按照步驟1.2.3操作，每個含量做3個平行樣，比較平均灰度值。

1.2.6 方法學考察

根據(jù)單因素得出的最優(yōu)反應及操作條件，進行方法學上的考察。

1.2.7 精密度

使用5 mg/L的EC標準液，在5塊5×10 cm薄層硅膠板點樣，點樣量都為10 ng/點。按照上述實驗步驟和最優(yōu)的操作條件，得到斑點平均灰度值。

1.2.8 斑點穩(wěn)定性

在1塊5×10 cm薄層硅膠板上點樣，點樣量為50 ng/點。按照上述實驗步驟和最優(yōu)的操作條件，以薄層板從烘箱拿出立即拍照為0 min，每隔1 min拍照1次，計算斑點的平均灰度值。

1.2.9 標準曲線繪制

使用10 mg/L的EC標準液，在薄層板上點樣，分別為 8 ng/點、10 ng/點 ng/點、12 ng/點、14 ng/點、16 ng/點、18 ng/點。按照上述實驗步驟和最優(yōu)的操作條件，得到斑點平均灰度值。

1.2.10 加標回收率

在4塊5×10 cm薄層硅膠板點樣，點樣量分別為10 μL酒樣、10 μL酒樣+4 ng EC標品、10 μL酒樣+6 ng EC標品、10 μL酒樣+10 ng EC標品。按照上述實驗步驟和最優(yōu)的操作條件，得到斑點的平均灰度值，根據(jù)標準曲線計算EC含量的加標回收率。

1.2.11 檢出限的確定

對10 mg/L EC標準溶液進行6次測定，在5×10 cm薄層硅膠板上的點樣量都為8 ng/點，獲得測定結果的標準差S，查出相應的t，檢出標準=t空白S空白，按公式（檢出限=檢出標準+St）計算檢出限。

1.2.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗進行3次重復，取平均值并計算標準偏差，采用SPSS 18.0統(tǒng)計分析軟件進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 衍生顯色單因素實驗結果

2.1.1 肉桂醛含量的影響（圖1）

圖1 肉桂醛含量對灰度值的影響（n=3）

當衍生液中的肉桂醛含量為250 μL時，斑點的平均灰度值為最大，而隨著肉桂醛含量的增加，背景平均灰度值始終增加。當肉桂醛含量增加超過250 μL后，背景灰度值繼續(xù)增加，而此時斑點衍生反應已充分，亮度不再增大，且有可能影響斑點熒光產(chǎn)生，最終得到的平均灰度值下降，因此肉桂醛的最優(yōu)使用量為250 μL。

2.1.2 磷酸含量的影響（圖2）

當衍生液中的磷酸含量為3 mL時，斑點的平均灰度值為最大，而隨著磷酸含量的增加，背景平均灰度值增加且趨于穩(wěn)定。當磷酸含量超過3 mL后，可能多余磷酸的存在對熒光斑點亮度產(chǎn)生了抑制，最終得到的平均灰度值下降，因此磷酸的最優(yōu)使用量為3 mL。

2.1.3 浸板時間的影響（圖3）

圖2 磷酸含量對灰度值的影響（n=3）

圖3 浸板時間對灰度值的影響（n=3）

當接觸時間在3～4 s，斑點的平均灰度值為最大。隨著接觸時長的延長，背景平均灰度值增加，但當超過4 s后，灰度值下降。從3 s到4 s，背景的灰度值增加，而斑點的平均灰度值基本不變，說明在1 s內，增加了衍生液與薄層板接觸的機會，但4 s后，背景平均灰度值下降，可能是過長的接觸時間，使得薄層板的硅膠成分脫落，為了使衍生液充分接觸薄層板且不使硅膠脫落，因此選擇浸板操作的時間為4 s。

2.1.4 反應溫度的影響（圖4）

圖4 反應溫度對灰度值的影響（n=3）

當反應溫度在120℃時，斑點的平均灰度值為最大，反應溫度的提升超過120℃后，背景平均灰度值繼續(xù)增加，而斑點的平均灰度值下降，因此最優(yōu)的反應溫度是120℃。

2.1.5 反應時間的影響（圖5）

圖5 反應時間對灰度值的影響（n=3）

當反應時間在12 min時，斑點的平均灰度值為最大，繼續(xù)延長時間對背景亮度產(chǎn)生有反作用，在實測中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)14 min加熱后，365 nm下薄層硅膠板整體紅色最為明顯，可能是過長時間的加熱使硅膠板表面氧化加劇，因此，選擇最優(yōu)的反應時間為12 min。

2.2 方法學考察實驗結果

2.2.1 精密度和斑點穩(wěn)定性（圖6、圖7）

圖6 精密度結果（n=5）

圖7 斑點穩(wěn)定性結果

圖6為10 ng/點樣品在5塊不同的5×10 cm薄層硅膠板按相同最佳操作得到的結果，其中平均GL的RSD為9.70%（n=5），平均背景GL的RSD為2.42%（n=5）?？梢姺椒ㄔ诓煌庸枘z板上的重復性較好，造成點樣量相同但結果不同的原因可能是在點樣時，由于人工的操作失誤，斑點點樣不是非常均勻，也可能是購買的薄層板不是每一塊都均勻等因素導致。

圖7為50 ng/點的樣品每隔1 min拍照分析得到的斑點灰度值，可見在2 min后50 ng含量的EC斑點的平均GL趨于穩(wěn)定，灰度值為18。

2.2.2 相關性、加標回收率和檢出限的確定

在最佳實驗條件下，在薄層板上點不同含量的EC，將實驗結果作圖，獲得相應的工作曲線，方法的線性擬合方程為y=0.742x-3.3248，相關系數(shù)R2=0.992。

加標回收率實驗中，進行分別加入0、4 ng、6 ng、10 ng的實驗。實驗測得的平均GL值分別為2.4877、5.0015、5.7005、6.9492。4 ng、6 ng、10 ng的加標回收率分別為84.70%、72.17%、60.12%。

由于本方法是通過肉眼確定斑點是否存在，再用軟件積分計算，當不可見斑點時，空白SD值即為0，則檢出限為0.595 mg/L。檢出限的實驗結果見表1。

表1 DE-TLC方法測定氨基甲酸乙酯的檢出限

3 結論

使用薄層數(shù)碼成像技術實現(xiàn)了對氨基甲酸乙酯定量分析，通過研究衍生顯色中的單因素，確定了方法的最優(yōu)衍生條件，40 mL丙酮中，肉桂醛含量250 μL、磷酸含量3 mL、浸板時間4 s、加熱溫度120℃，加熱時間12 min。采用最優(yōu)條件對薄層成像法定量EC進行了方法學上的考察，不同薄層板上斑點的RSD=9.70%（n=5,10 ng）；烤板結束2 min后，斑點的平均灰度值趨于穩(wěn)定；當EC含量在8～18 ng/點的范圍內，其含量與平均GL呈線性關系，相關系數(shù)R2=0.992，檢出限為0.595 mg/L，樣品加標回收率在60.12%～84.70%。