小麥內(nèi)生耐鹽菌株YN1的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

李星志 王虹 趙丹 石運(yùn)幸 劉愛(ài)新

摘要：本試驗(yàn)從山東無(wú)棣縣鹽堿地健康小麥莖基部分離到1株內(nèi)生細(xì)菌YN1，對(duì)其進(jìn)行菌落形態(tài)觀察和16SrDNA分子鑒定，并分析其固氮能力、產(chǎn)鐵載體能力和產(chǎn)IAA能力，測(cè)定了150mmol/LNaCl脅迫下經(jīng)菌株處理后小麥的耐鹽能力。結(jié)果表明，該菌株為成團(tuán)泛菌（Pantoeaagglomerans），具有固氮和產(chǎn)鐵載體能力，其在0、100mmol/LNaCl條件下IAA產(chǎn)量分別為112.06、153.81μg/mL。與CKI相比，YN1處理的小麥幼苗在150mmol/LNaCl脅迫下株高、根長(zhǎng)等顯著增加，葉綠素、類胡蘿卜素、脯氨酸含量分別提高77.23%、78.55%、47.90%，CAT、POD和SOD活性分別提高74.7%、27.1%和64.2%，而丙二醛含量下降35.3%，表明YN1處理可提高小麥的耐鹽能力。

關(guān)鍵詞：小麥;鹽堿地;內(nèi)生細(xì)菌;成團(tuán)泛菌;耐鹽能力

中圖分類號(hào)：S476.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2019）05-0063-06

我國(guó)鹽堿地面積大、分布廣泛，僅環(huán)渤海地區(qū)就有266.7萬(wàn)公頃中低產(chǎn)田鹽堿地和66.7萬(wàn)公頃鹽堿荒地，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)潛力巨大，是我國(guó)今后農(nóng)業(yè)科技開(kāi)發(fā)的重要領(lǐng)域，也是保障國(guó)家糧食安全的重要發(fā)展區(qū)域。近年來(lái)研究人員在耐鹽品種選育方面進(jìn)行了大量研究，為開(kāi)發(fā)利用鹽堿地提供了可能[1，2]。

除培育抗、耐鹽品種外，利用植物內(nèi)生細(xì)菌提高其耐鹽能力也越來(lái)越受到重視。許多鹽堿地生長(zhǎng)的植物內(nèi)生細(xì)菌本身具有耐鹽能力，對(duì)促進(jìn)寄主植物生長(zhǎng)發(fā)育、抵抗逆境等具有重要作用[3]。研究表明PGPR菌株除通過(guò)固氮、分泌鐵載體和生長(zhǎng)素（IAA）等方式促進(jìn)植物根系發(fā)育[4]，還可通過(guò)分泌信號(hào)調(diào)節(jié)物質(zhì)或誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗逆代謝物質(zhì)等提高抗逆性[5]。張磊等[6]證實(shí)某些PGPR（plantgrowth-promotingrhizobacteria）菌株可以促進(jìn)植物對(duì)鹽害的抵抗力。本研究從山東省無(wú)棣縣鹽堿地小麥健株中分離到一株耐鹽菌株YN1，對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性研究，并分析其對(duì)小麥耐鹽能力的影響，以期為鹽堿地開(kāi)發(fā)中利用該菌株提供參考。

1材料與方法

1.1材料

2016年4月，于山東省無(wú)棣縣山東農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)鹽堿地小麥田采集小麥健株，用于耐鹽菌株分離。供試小麥品種為山農(nóng)22。

供試培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基用于細(xì)菌的培養(yǎng);TSA培養(yǎng)基用于菌株的篩選;Hoagland半固體培養(yǎng)基用于小麥幼苗的培養(yǎng);阿貝無(wú)氮培養(yǎng)基用于檢測(cè)菌株的固氮能力;MSA培養(yǎng)基用于檢測(cè)鐵載體的產(chǎn)生。

1.2主要試劑

Salkowski試劑用于檢測(cè)IAA含量;CAS染劑用于鐵載體檢測(cè);抗氧化酶活性測(cè)定試劑盒，購(gòu)自蘇州科銘生物技術(shù)有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1菌株的分離及鑒定菌株分離：將小麥植株表面消毒，剪取莖基部1g研磨，用無(wú)菌水稀釋至不同濃度，采用平板稀釋法用TSA培養(yǎng)基進(jìn)行分離。

菌落形態(tài)觀察：將分離獲得的菌株于NA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)48h，觀察菌落形態(tài)、大小、顏色等。

分子鑒定：菌株YN1于28℃、NB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8000r/min離心收集菌體，CTAB法提取基因組DNA。用16SrDNA通用引物（27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物送上海生工測(cè)序。用DNAMAN軟件將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的細(xì)菌序列進(jìn)行比對(duì)，使用MAGE5.0制作進(jìn)化樹(shù)，分析其所屬類別。

1.3.2菌株固氮能力測(cè)定將菌株YN1（于NB培養(yǎng)基培養(yǎng)）用無(wú)菌水稀釋至OD600=1.0，取10μL菌液滴于阿貝無(wú)氮培養(yǎng)基中央，于28℃培養(yǎng)5d后，根據(jù)透明圈的有無(wú)和大小，確定菌株的固氮能力[7]。重復(fù)3次。

1.3.3菌株產(chǎn)鐵載體能力測(cè)定參照Chen等[8]的方法。將50mLCAS試劑與等量1mol/L磷酸緩沖液混合后，加入到200mLMSA培養(yǎng)基中，制成MSA平板。將培養(yǎng)的菌株YN1用無(wú)菌水稀釋至OD600=1.0，取10μL菌液滴于MSA平板中央，28℃培養(yǎng)5d，觀察菌株周圍是否出現(xiàn)橘紅色，以無(wú)菌水為對(duì)照。重復(fù)3次。

1.3.4菌株分泌IAA能力測(cè)定參照文獻(xiàn)[9]的方法。菌株YN1用無(wú)菌水稀釋至108cfu/mL，以3%（V/V）的接種量接種于含有50mLNB培養(yǎng)液的三角瓶中，培養(yǎng)液中NaCl濃度分別為0mmol/L和100mmol/L;隨后向各瓶培養(yǎng)基中加入色氨酸，使瓶中色氨酸濃度達(dá)到10-4mg/L，28℃、180r/min振蕩培養(yǎng)3d。菌液于8000r/min離心5min，取1mL上清液與1mLSalkowski試劑混合，避光靜置30min，用紫外分光光度計(jì)于530nm處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IAA量。重復(fù)3次。

1.3.5菌株YN1對(duì)小麥的耐鹽能力分析參照文獻(xiàn)[10]的方法。小麥種子用5%次氯酸鈉表面消毒后，于25℃催芽24h。菌株YN1先用無(wú)菌水稀釋至108cfu/mL，后將催芽種子在菌液中靜止放置4h。用無(wú)菌濾紙吸干種子表面多余液體，放入裝有Hoagland半固體培養(yǎng)基的試管中，NaCl濃度為150mmol/L。于光照培養(yǎng)箱內(nèi)（晝/夜溫度為20℃/15℃，光/暗周期為16h/8h）培養(yǎng)12d后，測(cè)量小麥株高和根長(zhǎng)，統(tǒng)計(jì)小麥地上部、根鮮重和側(cè)根數(shù)。以無(wú)菌水+150mmol/LNaCl處理為CK1，無(wú)菌水處理為CK2。

1.3.6菌株YN1處理對(duì)小麥脯氨酸、丙二醛、葉綠素含量等的影響參照文獻(xiàn)[11]的方法測(cè)定脯氨酸含量。采用1.3.5的方法培養(yǎng)小麥種子，取培養(yǎng)12d的小麥幼苗0.5g，按1/10（W/V）加入3%磺基水楊酸5mL，沸水浴10min，冷卻過(guò)濾。取2mL濾液加入冰醋酸和酸性茚三酮溶液各2mL，沸水浴30min，冷卻至室溫，加入4mL甲苯，振蕩器高速振蕩30s，靜置5min。取上層溶液測(cè)定520nm下吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算脯氨酸含量。

丙二醛含量測(cè)定參照文獻(xiàn)[12]的方法。取小麥幼苗0.5g，加入5%TCA溶液5mL，冰浴下研磨，3000×g離心15min，取2mL上清液與5mL0.5%硫代巴比妥酸溶液混勻，沸水浴10min，冷卻至室溫，3000×g離心15min。取上清液分別測(cè)定532、600、450nm下的吸光度。根據(jù)公式[6.452×（OD532-OD600）-0.559×OD450]×Vt/（FW×Vs），計(jì)算丙二醛含量。式中，Vt為提取液總體積，Vs為測(cè)定用提取液體積，F(xiàn)W為樣品鮮重。

參照文獻(xiàn)[13]的方法測(cè)定葉綠素和類胡蘿卜素含量。稱取小麥葉片0.5g，加入80%丙酮3mL，研磨至勻漿，16000×g離心5min，將上清液用80%丙酮定容至10mL。分別測(cè)定470、663、645nm下的吸光度，根據(jù)吸光度值分別計(jì)算類胡蘿卜素、葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量。以80%丙酮作為空白，以空白作為參比。重復(fù)3次。

1.3.7菌株YN1對(duì)小麥過(guò)氧化酶活性的影響參照酶活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)制備粗酶液。稱取0.5g小麥葉片，液氮研磨，按1/10（W/V）加入酶提取液，混勻，4℃、8000r/min離心15min，上清液為粗提液。

SOD活性測(cè)定：取90μL粗酶液，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)，按比例、順序加入不同反應(yīng)液，充分混勻，室溫靜置30min，于560nm測(cè)定吸光度值。參照試劑盒提供的公式計(jì)算SOD活性。

CAT活性測(cè)定：取35μL粗酶液與CAT檢測(cè)工作液混合，室溫下立即測(cè)定240nm下初始吸光度值和1min后的吸光度值，根據(jù)試劑盒提供的公式計(jì)算CAT活性。

POD活性測(cè)定：吸取15μL粗酶液，參照試劑盒說(shuō)明書(shū)按比例加入不同反應(yīng)液，混合均勻，記錄470nm下30s時(shí)的吸光度值和1min后的吸光度值，參照試劑盒提供的計(jì)算式計(jì)算POD活性。

1.4數(shù)據(jù)分析

利用MicrosoftExcel2003進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖，利用DPSV3.01進(jìn)行方差分析和差異比較。

2結(jié)果與分析

2.1菌株分離與鑒定

菌株YN1菌落形態(tài)特征：菌落為淡黃色，有光澤，表面光滑，粘稠、邊緣整齊，無(wú)流動(dòng)性（圖1）。

用16SrDNA通用引物對(duì)菌株YN1的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1400bp左右擴(kuò)增出單一條帶。之后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行序列測(cè)定，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，利用MEGA5.0軟件分析系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。結(jié)果（圖2）顯示，菌株YN1與已報(bào)道的成團(tuán)泛菌（Pantoeaagglomerans）菌株（基因登錄號(hào)HQ219999.1）親緣關(guān)系最近，相似性在99.9%，分在同一分支，確定該菌株為成團(tuán)泛菌。

2.2菌株YN1生物學(xué)活性測(cè)定

對(duì)菌株YN1固氮能力、產(chǎn)鐵載體能力和產(chǎn)IAA能力進(jìn)行測(cè)定發(fā)現(xiàn)，YN1分別在無(wú)氮培養(yǎng)基上和CAS-MSA平板培養(yǎng)5d后，菌株周圍分別出現(xiàn)透明圈和橘紅色暈圈，表明YN1具有固氮能力（圖3a）和產(chǎn)鐵載體能力（圖3b）。

由圖4可知，菌株YN1可以產(chǎn)生生長(zhǎng)素（IAA），在100mmol/LNaCl條件下，IAA產(chǎn)量為153.81μg/mL，比無(wú)NaCl時(shí)增加26.79%（112.06μg/mL）。表明鹽脅迫可以提高菌株YN1的IAA產(chǎn)量。

2.3菌株YN1對(duì)小麥耐鹽能力的影響

菌株YN1處理的小麥耐鹽能力結(jié)果如圖5、表1所示。鹽脅迫（150mmol/LNaCl）下，YN1處理后的小麥幼苗株高、主根長(zhǎng)、鮮重等均比CK1有顯著提高，其中株高和側(cè)根數(shù)分別增加92.2%和40.8%，植株鮮重增加102.4%。但與CK2相比，株高和植株鮮重明顯降低，根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)明顯增加。表明YN1處理提高了小麥幼苗的耐鹽能力。

2.4菌株YN1對(duì)小麥抗逆代謝的影響

由圖6可以看出，在150mmol/LNaCl脅迫下，經(jīng)菌株YN1處理的小麥脯氨酸含量比CK1增加47.90%，葉綠素和類胡蘿卜素含量分別增加77.23%和78.55%，MDA含量下降35.3%。表明在鹽脅迫下，YN1處理增強(qiáng)了小麥的抗逆代謝。

2.5菌株YN1對(duì)小麥抗氧化酶活性的影響

由圖7可以看出，鹽脅迫下，與CK1相比，YN1處理的小麥植株的抗氧化酶活性均有明顯提高，CAT、POD和SOD活性分別增加74.7%、27.1%和64.2%。表明菌株YN1可能通過(guò)提高小麥植株抗氧化酶活性增強(qiáng)耐鹽能力。

3討論與結(jié)論

經(jīng)鑒定，本研究分離到的耐鹽菌株YN1為Pantoeaagglomerans。該菌株具有產(chǎn)鐵載體、固氮等特性，100mmol/L鹽濃度可顯著提高其產(chǎn)IAA能力。另外，該菌株可促進(jìn)小麥在中度鹽濃度（150mmol/L）下生長(zhǎng)并顯著提高小麥體內(nèi)脯氨酸、葉綠素等含量和SOD、CAT等抗氧化酶活性。

植物在鹽脅迫下主要表現(xiàn)為生長(zhǎng)抑制。潘多鋒等[14]發(fā)現(xiàn)，偃麥草苗期株高、成活率、生物量的降低均與鹽濃度升高有關(guān)。PGPR菌株對(duì)提高植物的耐鹽能力有重要作用。許芳芳等[15]發(fā)現(xiàn)小麥內(nèi)生腸桿菌FYP1101能夠顯著提高小麥的耐鹽能力和鹽脅迫下小麥的生物量。Li等[11]也發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌Pantoea和Bacillus等在中高鹽濃度下對(duì)象草（Pennisetumpurpureum）的生長(zhǎng)有顯著的促生作用。本研究證實(shí)菌株YN1可增加小麥在鹽脅迫下的生物量，提高小麥的耐鹽能力。

研究發(fā)現(xiàn)，脯氨酸、可溶性糖等代謝物和SOD、POD等抗氧化酶與植物抗逆密切相關(guān)。脯氨酸作為植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)外滲透壓提高植物抗逆境脅迫的能力，脯氨酸的積累可提高植物的耐鹽能力[12-17]。SOD、POD等為植物體內(nèi)主要的抗氧化酶，可清除植物體內(nèi)活性氧，緩解過(guò)多活性氧對(duì)植物的損傷[13，18]。傅蕾等[12]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生菌Pantoeasp.不僅提高鹽脅迫下狼尾草種子發(fā)芽力，而且明顯提高植株體內(nèi)脯氨酸和可溶性糖含量，同時(shí)多種抗氧化酶活性也顯著提高。本研究得出菌株YN1處理不僅提高小麥植株內(nèi)脯氨酸含量和SOD等抗氧化酶活性，而且對(duì)葉綠素和類胡蘿卜素含量的提高也較為明顯。從耐鹽能力看，菌株YN1處理可使小麥在中度鹽濃度（150mmol/L）正常生長(zhǎng)。這與已報(bào)道的菌株Kp120的耐鹽能力相當(dāng)[19]。

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