基于適冷酶研究的生物綜合實驗教學(xué)設(shè)計

王全富， 侯艷華， 王一帆， 王亞彤

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)威海校區(qū) 海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 山東 威海 264209)

0 引 言

隨著現(xiàn)代生命科學(xué)的迅猛發(fā)展及生物科技產(chǎn)業(yè)化的突起，社會對生物工程人才需求量不斷增加，表明現(xiàn)代生物技術(shù)在我國經(jīng)濟(jì)建設(shè)中的作用越來越受到重視。同時用人單位對生物工程本科畢業(yè)生，不僅要求具有較扎實的生物工程基礎(chǔ)理論知識，同時更強(qiáng)調(diào)具備較好的實驗技能以及在研發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)問題和解決問題的綜合素質(zhì)能力。生物工程專業(yè)的綜合性實驗是在該專業(yè)學(xué)生掌握一定基礎(chǔ)知識和基本操作實驗設(shè)備的技能基礎(chǔ)上，運(yùn)用幾門相關(guān)重要的專業(yè)課程的綜合知識，對學(xué)生進(jìn)行綜合訓(xùn)練的一種復(fù)合式的實驗?，F(xiàn)階段，很多高校也都對生物綜合性實驗的研究內(nèi)容和方法進(jìn)行了研究和探索，通過綜合實驗的改革創(chuàng)新，不斷提高了實驗的教學(xué)水平和質(zhì)量，取得了較好的效果[1-5]。

高校生物工程專業(yè)，如何培養(yǎng)學(xué)生有特色、并更快、較早接觸學(xué)術(shù)前沿、實現(xiàn)科教融合，是亟需解決的問題。因此，本文針對我校生物工程海洋資源開發(fā)與利用辦學(xué)特點(diǎn)，對生物工程綜合性實驗教學(xué)進(jìn)行了改革與實踐，提出以海洋微生物為材料，對其中適冷酶進(jìn)行基因克隆、生物信息學(xué)和同源建模分析，以及基因表達(dá)與純化為綜合實驗，使學(xué)生深入了解海洋微生物適冷酶基因的科學(xué)研究技術(shù)和流程，挖掘?qū)W生的創(chuàng)新潛力，提升學(xué)生的實驗操作技能，進(jìn)而達(dá)到提高實驗教學(xué)質(zhì)量的目的。

1 綜合實驗的教學(xué)特色和目標(biāo)

海洋資源的開發(fā)和利用已成為海洋大國競爭的焦點(diǎn)之一，其中海洋生物基因資源的研究和利用是熱點(diǎn)科學(xué)問題[6]。生物工程綜合實驗是基于海洋生物資源領(lǐng)域研究熱點(diǎn)和校區(qū)海洋特色培養(yǎng)重點(diǎn)，依托專業(yè)教師的最新科研成果，定位在生物化學(xué)、微生物實驗課的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物信息學(xué)、基因工程、酶工程和海洋生物學(xué)所學(xué)基礎(chǔ)知識，構(gòu)建多門課程的交叉綜合實驗課程(見圖1)。綜合實驗通過強(qiáng)調(diào)科學(xué)問題熱點(diǎn)引領(lǐng)，通過自主設(shè)計，對技術(shù)基礎(chǔ)和專業(yè)基礎(chǔ)實驗內(nèi)容的改革、提升和創(chuàng)新，要求學(xué)生掌握海洋微生物適冷酶的科學(xué)研究技術(shù)和流程，提升學(xué)生的實驗操作技能，為學(xué)生在以后參加的科技活動和畢業(yè)設(shè)計奠定基礎(chǔ)。

圖1 生物綜合實驗所屬多課程的交叉

2 實驗內(nèi)容

2.1 實驗菌株及目的基因的選擇

以海洋嗜冷菌Psychrobactersp. ANT206和Pseudoalteromonassp. ANT506為材料，根據(jù)學(xué)生興趣，自主選擇地適冷酶，如超氧化物歧化酶、過氧化物還原酶、蛋白酶和谷氧還蛋白等6種適冷酶。

2.2 適冷酶基因克隆與生物信息學(xué)分析

利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因全長序列，然后利用T-A克隆技術(shù)將該基因轉(zhuǎn)入宿主菌E.coliDH5α中[7]，測定相關(guān)適冷酶基因序列。根據(jù)在線軟件對適冷酶基因測序結(jié)果進(jìn)行綜合分析，可以進(jìn)一步得到目的基因及其所編碼蛋白質(zhì)的生物學(xué)信息，具體內(nèi)容包括：利用NCBI對適冷酶基因序列的開放閱讀框進(jìn)行預(yù)測與分析[8]；利用ExPASy進(jìn)行適冷酶基因序列的翻譯，并預(yù)測所編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)[9]；利用COILS進(jìn)行卷曲螺旋預(yù)測；利用PSORT Server在線預(yù)測蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位；利用NetPhos 2.0 Server預(yù)測蛋白質(zhì)潛在的磷酸化位點(diǎn)；利用Bioedit[10]及MEGA7.2[11]構(gòu)建適冷酶基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2.3 適冷酶的同源建模和蛋白結(jié)構(gòu)特征分析

同源建模分析選擇已報道的來源于中溫同源酶與本實驗的適冷酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)比較[12-13]。利用PyMOL軟件比對兩組序列的三維結(jié)構(gòu)，利用Protein Interactions Calculator program(http://pic.mbu.iisc.ernet.in)分析陽離子-π鍵相互作用、芳香環(huán)間的相互作用、離子間的相互作用、疏水相互作用、氫鍵等分子內(nèi)作用力[14]，利用VMD1.9.3分析鹽橋數(shù)量[15]。

2.4 海洋生物功能基因的表達(dá)與純化

將目的基因與質(zhì)粒pET-28a (+)連接，并將其轉(zhuǎn)入E.coliBL21中，篩選陽性重組菌，并通過低溫誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)目的基因的異源表達(dá)。利用Ni-NTA純化重組適冷蛋白，并經(jīng)SDS-PAGE進(jìn)行重組適冷酶的純度驗證。

2.5 重組適冷酶的活性研究

測定純化過程中蛋白質(zhì)含量和重組酶活性，算出相應(yīng)的比酶活和回收率等數(shù)值。在純化的基礎(chǔ)上，對重組適冷酶的最適溫度進(jìn)行研究。

3 實施方案

依托于海洋生物基因資源的研究和利用的熱點(diǎn)科學(xué)問題，建立一套立體式的海洋微生物適冷酶基因研究生物工程綜合實驗課。具體實施方案如圖2所示。

3.1 實驗理論學(xué)習(xí)

(1) 介紹綜合實驗課程的教學(xué)目標(biāo)及主要內(nèi)容，布置學(xué)生自主查閱6種適冷酶的相關(guān)文獻(xiàn)，在閱讀相關(guān)文獻(xiàn)后，撰寫文獻(xiàn)總結(jié)報告，根據(jù)學(xué)生興趣，提出擬開展的創(chuàng)新性實驗設(shè)計和方案。

(2) 教師根據(jù)學(xué)生提交的文字材料，并根據(jù)學(xué)生意向進(jìn)行分組，開始實驗。

3.2 實驗安排

(1) 綜合實驗為4周學(xué)時，具體分配，基因克隆與生物信息學(xué)(1周)，基因表達(dá)與重組蛋白純化(2周)，電泳檢測和蛋白活性分析(1周)。

圖2 生物工程綜合實驗的實施方案

(2) 在各組實驗教師的指導(dǎo)下，進(jìn)一步完善每組的實驗方案，同時熟悉實驗所使用的設(shè)備以及所采用方法的原理，回顧相關(guān)課程教學(xué)知識，然后開始實驗研究，在實驗的同時進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

(3) 學(xué)生參加“開放式、研究性”實驗交流會。圖3所示是利用同源建模方法，構(gòu)建適冷酶與同源中溫酶三維結(jié)構(gòu)比對模型圖。圖4所示是實驗交流會上適冷酶的表達(dá)與純化結(jié)果。從圖4(a)結(jié)果看出，學(xué)生能把適冷酶的基因表達(dá)出來，但是沒有純化出來。經(jīng)過學(xué)生查閱文獻(xiàn)和組里老師討論，通過降低包涵體尿素處理濃度和改變Ni-NTA親和層析的條件，最終將目標(biāo)蛋白純化出來[見圖4(b)]。

圖3 適冷酶與同源中溫酶三維結(jié)構(gòu)比對模型圖

因此，學(xué)生完成上述基因生物信息學(xué)分析，以及表達(dá)和純化后，各組教師召開討論組，結(jié)合各組的實驗結(jié)果引導(dǎo)學(xué)生依次思考如下問題：① 自己所克隆的基因表達(dá)情況如何？② 適冷酶的同源建模過程中，同源模型序列選擇依據(jù)是什么？③ 適冷酶的分子結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有哪些？④ 電泳條帶出現(xiàn)條帶歪曲，如何改進(jìn)?⑤ 表達(dá)后蛋白純化效果和活性如何?學(xué)生運(yùn)用學(xué)到的知識結(jié)合教師提示和自己的實驗操作等環(huán)節(jié)解決問題，最后撰寫一篇科技論文格式的研究報告。

(a) 第一實驗結(jié)果(b) 改進(jìn)后實驗結(jié)果

圖4 適冷酶的表達(dá)與純化的結(jié)果

3.3 考核方式

實驗完成后每人撰寫相關(guān)的研究報告，并按照實驗小組進(jìn)行答辯?？己顺煽冎校瑢嶒瀯邮帜芰φ?0%，研究報告撰寫占20%，實驗結(jié)果答辯占20%。

4 結(jié) 語

經(jīng)過一系列的創(chuàng)新探索和實踐后的“基于適冷酶研究的生物綜合實驗”課程，更加彰顯了以學(xué)生獨(dú)立實施的主題，提高學(xué)生對實驗的積極性，增強(qiáng)學(xué)生獨(dú)立分析解決問題的能力，加強(qiáng)學(xué)生團(tuán)隊合作意識，培養(yǎng)學(xué)生科研能力，從而提升大學(xué)生參與科技活動的積極性。通過生物綜合實驗系統(tǒng)學(xué)習(xí)了生物信息學(xué)和分子生物學(xué)等實驗技術(shù)，本科生以第一作者在Microbiological Research等國際SCI學(xué)術(shù)期刊發(fā)表了論文[16]，獲得第十三屆“挑戰(zhàn)杯”全國三等獎。但生物綜合實驗方案還存在一些問題，實驗教學(xué)內(nèi)容和方法還需要不斷完善。