青蒿琥酯增強(qiáng)順鉑對(duì)前列腺癌細(xì)胞殺傷活性及作用機(jī)制研究

周麗娜

前列腺癌嚴(yán)重威脅男性健康。盡管手術(shù)是治療前列腺癌的最佳手段，但對(duì)于進(jìn)行術(shù)后輔助治療或中晚期前列腺癌患者而言，系統(tǒng)性化療仍是不可或缺的治療方案[1]。然而，一些腫瘤細(xì)胞對(duì)化療敏感性的降低是目前面臨的重大問(wèn)題。順鉑是一種常見(jiàn)的鉑類化療藥物，其抗癌譜十分廣泛。腫瘤細(xì)胞攝入順鉑后，腫瘤細(xì)胞中DNA 會(huì)與順鉑發(fā)生不可逆性交聯(lián)反應(yīng)，從而使其受損并喪失正常功能，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡性死亡[2-3]。然而長(zhǎng)期大劑量使用順鉑會(huì)嚴(yán)重降低腫瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，并對(duì)患者造成嚴(yán)重的副反應(yīng)。因此，采用適當(dāng)?shù)妮o助治療提高順鉑的抗前列腺癌活性以降低順鉑的使用劑量具有十分重要的臨床意義。本研究觀察體外聯(lián)用青蒿琥酯對(duì)順鉑抗前列腺癌活性的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人前列腺癌細(xì)胞系LNCaP 購(gòu)于美國(guó)模式培養(yǎng)物保存中心（ATCC）。細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）中，放置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。

1.2 試 劑 順鉑（批號(hào)C2210000），青蒿琥酯（批號(hào)A3731），噻唑藍(lán)（MTT，批號(hào)M2128）和凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)APOAF）購(gòu)于德國(guó)Sigma-Aldrich。甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH，批號(hào)#5174）、間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化蛋白（Met，批號(hào)#8198）、蛋白激酶B（AKT，批號(hào)#4691）、磷酸化AKT（批號(hào)#4060）、Bcl-2 相關(guān)細(xì)胞死亡激動(dòng)子（Bad，批號(hào)#9268）、磷酸化Bad（批號(hào)#5284）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 蛋白（Bcl-2，批號(hào)#4223）、大分子B 淋巴細(xì)胞瘤蛋白（Bcl-xl，批號(hào)#2764）、半胱天冬酶-9（caspase-9，批號(hào)#9502）和半胱天冬酶-3 （caspase-3，批號(hào)#9665） 抗體購(gòu)于美國(guó)Cell Signaling。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物（ECL）顯色試劑盒（批號(hào)32106）購(gòu)于美國(guó)Pierce。脂質(zhì)體2000（Lipofectamine2000，批號(hào)11668019）購(gòu)于美國(guó)Invitrogen。蛋白G 免疫共沉淀瓊脂糖（批號(hào)sc-500778）購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz。

1.3 Met 真核表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染 采用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法進(jìn)行Met 過(guò)表達(dá)，將人Met 基因開(kāi)放閱讀框架序列用PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的基因片段以分子克隆方法與pcDNA3.1 連接后構(gòu)建成Met 重組過(guò)表達(dá)質(zhì)粒。順時(shí)轉(zhuǎn)染簡(jiǎn)要步驟如下：將2μg/mL Met重組質(zhì)粒或空質(zhì)粒用脂質(zhì)體2000 進(jìn)行包裹，靜置15min 后將其與無(wú)血清培養(yǎng)基混合。貼壁培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞用該包含質(zhì)粒的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育6h。隨后吸走該包含質(zhì)粒的培養(yǎng)基，加入新鮮的RPMI-1640 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）常規(guī)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞活力抑制率檢測(cè) 按5×103/孔在96 孔板上接種LNCaP 細(xì)胞并孵育過(guò)夜，用于進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、青蒿琥酯組、順鉑組、順鉑+青蒿琥酯組和順鉑+青蒿琥酯+Met 質(zhì)粒組。對(duì)照組為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LNCaP 細(xì)胞不加藥物處理，青蒿琥酯組為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LNCaP 細(xì)胞用10μM 青蒿琥酯處理，順鉑組為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LNCaP 細(xì)胞用2μM 順鉑，順鉑+青蒿琥酯組為空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LNCaP 細(xì)胞用2μM 順鉑和10μM 青蒿琥酯聯(lián)合處理，順鉑+青蒿琥酯+Met 質(zhì)粒組為Met 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的LNCaP 細(xì)胞用2μM 順鉑和10μM 青蒿琥酯聯(lián)合處理。各組細(xì)胞培養(yǎng)48h 后，加入20μL MTT 溶液（5mg/mL）并繼續(xù)培養(yǎng)4h。吸走上清液，加入二甲亞砜，充分震蕩后用酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度（570nm 波長(zhǎng)）。LNCaP 的細(xì)胞活力抑制率用以下公式計(jì)算：細(xì)胞活力抑制率=（吸光度對(duì)照組-吸光度藥物處理組）/吸光度對(duì)照組×100%。

1.5 免疫共沉淀 按1.4 所述進(jìn)行分組處理LNCaP細(xì)胞，之后對(duì)LNCaP 細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。將等量的各組細(xì)胞用細(xì)胞裂解液在冰上進(jìn)行裂解，裂解30min 后將裂解產(chǎn)物離心10min（12000rpm）并采集上清液。將上清液分成等量?jī)煞荩环萦米鲀?nèi)參（Input），另一份進(jìn)行免疫共沉淀（IP）。在共沉淀體系中加入Bad 抗體并在4℃下孵育過(guò)夜，之后在共沉淀體系中加入蛋白G 瓊脂糖珠并在室溫?fù)u床下作用2h。孵育完成后將該共沉淀產(chǎn)物離心5min（12000rpm）。之后吸走上清液，用Western blot 上樣緩沖液進(jìn)行重懸并在沸水下浴煮5min。處理后的共沉淀體系可直接用于Western blot 實(shí)驗(yàn)。

1.6 Western blot 試驗(yàn) 直接提取的等量總蛋白質(zhì)或1.5 所述所得樣品用10% SDS-PAGE 進(jìn)行電泳分離。所得的蛋白分離膠再用電轉(zhuǎn)方法將其中的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。用5%脫脂奶粉對(duì)PVDF 進(jìn)行封閉孵育2h，再將PVDF 膜用GAPDH、Met、AKT、磷酸化AKT、Bad、磷酸化Bad、Bcl-2、Bcl-xl、caspase-9和caspase-3 抗體在4℃下孵育過(guò)夜。之后將該P(yáng)VDF 膜用洗滌緩沖液清洗2 次后用帶辣根過(guò)氧化物酶的二抗室溫孵育2h，用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物（ECL）試劑盒檢測(cè)PVDF 膜上的蛋白條帶。目的蛋白的相對(duì)表達(dá)用目標(biāo)蛋白灰度值與GAPDH 灰度值的比值表示，蛋白灰度值分析用Image J 軟件處理。

1.7 細(xì)胞凋亡試驗(yàn) 按1.4 所述進(jìn)行分組處理LNCaP 細(xì)胞，之后對(duì)LNCaP 細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，取2×106的各組細(xì)胞按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟用Annexin-V 和碘化丙啶（PI）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色孵育20min，之后用生理鹽水洗滌2 次，細(xì)胞用生理鹽水重懸后用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)LNCaP 細(xì)胞Annexin-V的熒光強(qiáng)度。Annexin-V 陽(yáng)性的LNCaP 細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)由3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)而得，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），統(tǒng)計(jì)分析軟件為SPSS 15.0，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 青蒿琥酯在體外增強(qiáng)順鉑對(duì)前列腺癌細(xì)胞殺傷活性 MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，順鉑+青蒿琥酯組LNCaP細(xì)胞活力抑制率、凋亡率均高于青蒿琥酯組和順鉑組（P 均＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 青蒿琥酯和順鉑對(duì)LNCaP 細(xì)胞活力抑制率和凋亡率的影響（%，x±s）

2.2 青蒿琥酯通過(guò)下調(diào)Met 表達(dá)增強(qiáng)順鉑對(duì)前列腺癌細(xì)胞殺傷活性 Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青蒿琥酯能降低LNCaP 細(xì)胞Met 表達(dá)水平，順鉑對(duì)Met的表達(dá)水平無(wú)明顯影響。另外，轉(zhuǎn)染Met 表達(dá)質(zhì)粒能使LNCaP 細(xì)胞Met 發(fā)生強(qiáng)制過(guò)表達(dá)，廢除青蒿琥酯對(duì)Met 的抑制，見(jiàn)圖1。同時(shí)，MTT 和流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青蒿琥酯+順鉑+Met 質(zhì)粒組LNCaP 細(xì)胞活力抑制率和細(xì)胞凋亡率均低于順鉑+青蒿琥酯組（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.3 青蒿琥酯通過(guò)Met/AKT/Bad 途徑促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的凋亡 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青蒿琥酯能明顯誘導(dǎo)LNCaP 細(xì)胞Bad 與Bcl-xl 及Bcl-2 相互作用，見(jiàn)圖2。同時(shí)，Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，青蒿琥酯能明顯促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的caspase-9 和caspase-3的活化，見(jiàn)圖3。然而，轉(zhuǎn)染Met 質(zhì)粒后，青蒿琥酯聯(lián)合順鉑處理的LNCaP 細(xì)胞Bad 與Bcl-xl 及Bcl-2結(jié)合水平，caspase-9 和caspase-3 活化水平及凋亡水平均明顯降低，見(jiàn)圖2-3。

3 討 論

青蒿琥酯是提取自菊科植物黃花蒿葉的天然活性成分，除抗瘧作用外，還具有一定的抗腫瘤活性，能抑制一些腫瘤細(xì)胞增殖并阻滯其細(xì)胞周期[4-5]。然而，青蒿琥酯是否能提高順鉑對(duì)前列腺癌的殺傷活性，迄今還不明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管青蒿琥酯單獨(dú)處理對(duì)前列腺癌細(xì)胞系的殺傷活性較弱，但其能明顯增強(qiáng)順鉑的抗前列腺癌活性，表明青蒿琥酯可以作為輔助治療藥物增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性，提高其療效。

圖1 青蒿琥酯、順鉑和Met 質(zhì)粒處理對(duì)LNCaP 細(xì)胞Met 表達(dá)水平及AKT 和Bad 磷酸化水平的影響

圖2 青蒿琥酯、順鉑和Met 質(zhì)粒處理對(duì)LNCaP 細(xì)胞Bad 與Bcl-2 及Bcl-xl 相互作用的影響

圖3 青蒿琥酯、順鉑和Met 質(zhì)粒處理對(duì)LNCaP 細(xì)胞caspase-9、caspase-3 活化水平的影響

Met 是肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）的受體。文獻(xiàn)報(bào)道，高度活化的c-met 能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移并抑制其凋亡途徑，是一種原癌基因[6-9]。因此，Met 可作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。在Met 下游通路中，AKT的激活是Met 發(fā)揮腫瘤促進(jìn)作用的重要步驟[10]。另外，Bcl-2 促凋亡蛋白Bad 是AKT 激酶的作用底物，然而B(niǎo)ad 的促凋亡活性取決于其磷酸化狀態(tài)。非磷酸化的Bad 能與Bcl-2 和Bcl-xl 這兩種抗凋亡蛋白發(fā)生結(jié)合，使其失去活性從而發(fā)揮促凋亡活性。然而，當(dāng)Bad 被AKT 激酶磷酸化后，磷酸化的Bad 會(huì)從其與Bcl-xl 或Bcl-2 形成的異二聚體中分離出來(lái)，從而使Bcl-xl 和Bcl-2 游離出來(lái)發(fā)揮抗凋亡作用[11-12]。本研究結(jié)果還表明，青蒿琥酯能明顯抑制前列腺癌細(xì)胞Met 蛋白表達(dá)水平，從而抑制前列腺癌細(xì)胞AKT 磷酸化通路，使Bad 蛋白不能在AKT 激酶的作用下發(fā)生磷酸化，進(jìn)而使Bcl-2 和Bcl-xl 蛋白失活以提高前列腺癌細(xì)胞對(duì)順鉑誘導(dǎo)的凋亡通路的敏感性，表現(xiàn)為凋亡執(zhí)行蛋白caspase-9 和caspase-3 顯著活化，誘導(dǎo)前列腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡性死亡?？傊?，本研究結(jié)果顯示，青蒿琥酯可能通過(guò)Met/AKT/Bad 途徑增強(qiáng)順鉑的抗前列腺活性。