艾滋病患者HIV-1抗原特異性CD8+記憶性母細(xì)胞樣T細(xì)胞的擴(kuò)增

李星華　李春娜　陳惠麗　黃珊鳳　邵迪　童欣　洪仲思

【摘要】 目的 對艾滋病患者人類免疫缺陷病毒-1型（HIV-1）抗原特異性CD8+記憶性母細(xì)胞樣T細(xì)胞（TSCM）的擴(kuò)增進(jìn)行分析。方法 納入10例HIV-1感染者作為研究對象， 磁珠法分離艾滋病患者CD8+T淋巴細(xì)胞， 并利用Tetramer-SL9標(biāo)記T細(xì)胞表面抗原受體。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測標(biāo)記有流式抗體的HIV-1抗原特異性CD8+ TSCM的分布情況， 利用細(xì)胞因子探索其擴(kuò)增。結(jié)果 HIV-1抗原特異性CD8+ TSCM在CD8+ T淋巴細(xì)胞中的比例， 隨著時間延長， 可誘導(dǎo)出更多的TSCM細(xì)胞， 但是峰值在10 d左右。結(jié)論 艾滋病患者CD8+ T細(xì)胞中TSCM細(xì)胞的存在， 用HIV-1抗原表位（SL9）來標(biāo)記安全性高， 擴(kuò)增效果好， 可為艾滋病的過繼免疫治療提供技術(shù)參考。

【關(guān)鍵詞】 艾滋病;CD8+ T細(xì)胞;記憶性母細(xì)胞樣T細(xì)胞;抗原特異性

【Abstract】 Objective To analyze the amplification of human immunodeficiency virus-1 （HIV-1） antigen-specific CD8+ memory stem T cells （TSCM） in AIDS patients. Methods 10 HIV-1 patients were enrolled in this study. CD8+ T lymphocytes were isolated by magnetic bead method and T cell surface antigen receptors were labeled with Tetramer-SL9. Flow cytometry was used to detect the distribution of HIV-1 antigen-specific CD8+ TSCM labeled with flow antibody， and cytokines were used to explore its amplification. Results The proportion of HIV-1 antigen-specific CD8+ TSCM in CD8+ T lymphocyte can induce more TSCM cells with time prolonging， but the peak value was about 10 d. Conclusion The presence of TSCM cells in CD8+ T cells of AIDS patients is highly safe labeled with HIV-1 epitope （SL9）， and the amplification effect is good. So it may provide a technical reference for adoptive immunotherapy of AIDS.

【Key words】 AIDS; CD8+ T cells; Memory stem T cells; Antigen specificity

基金項(xiàng)目：廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金（項(xiàng)目編號：A2015047）

作者單位：519000 中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院

通訊作者：洪仲思

艾滋病目前已成為嚴(yán)重的全球公共衛(wèi)生問題[1]。過繼免疫療法是運(yùn)用生物技術(shù)或者生物制劑， 對一定條件下患者體內(nèi)免疫細(xì)胞采集、擴(kuò)增后進(jìn)行自體回輸， 起到激發(fā)自身免疫功能的作用， 從而達(dá)到細(xì)胞治療的目的[2]。本文旨在檢測艾滋病患者體內(nèi)HIV-1抗原特異性TSCM細(xì)胞的分布以及利用細(xì)胞因子進(jìn)行擴(kuò)增的情況。

1 資料及方法

1. 1 病例來源 選取10例艾滋病患者均來自中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院感染病防治中心隨訪病例。

1. 2 試劑和儀器 人外周血淋巴細(xì)胞分離液、CD8+ T淋巴細(xì)胞陽選磁珠、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、Indo-1AMCell Permeable細(xì)胞可滲透鈣離子熒光探針、流式細(xì)胞檢測抗體、HLA-A*0201限制的Tetramer SL9（SLYNTATL）-PE、T cell Activation/Expansion Kit、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）[含體積分?jǐn)?shù)2%的BSA和0.5%的乙二胺四乙酸（EDTA）]、2%多聚甲醛溶液、流式細(xì)胞儀（BD公司）。

1. 3 方法

1. 3. 1 外周血采集與處理 從上肢肘窩靜脈取血10 ml， 至EDTA抗凝的負(fù)壓采血管（BD公司）。T細(xì)胞的分離及培養(yǎng)均在生物安全二級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。

1. 3. 2 分離CD8+ T淋巴細(xì)胞 利用淋巴細(xì)胞分離液， 采用密度梯度離心法獲取外周血單個核細(xì)胞（PBMC）， 用PBS緩沖液重懸后加帶有特異性單抗的磁珠， 利用磁珠分選法獲取CD8+ T淋巴細(xì)胞， 置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中。

1. 3. 3 流式細(xì)胞儀標(biāo)本制備 ①收集培養(yǎng)板內(nèi)CD8+T細(xì)胞離心后PBS緩沖液重懸;②根據(jù)HIV-1抗原特異性TSCM細(xì)胞表位特點(diǎn)標(biāo)記抗體：CD8-Pacific Blue、CD122-APC、CD95-FITC、CD62L-PE CY7、CCR7-Alexa Fluor、CD45RO-PercP CY5.5、CD45RA-Texas Red、indo、Tetramer-SL9-PE。避光冰浴20 min。加PBS緩沖液洗滌1次， 棄上清， 加PBS緩沖液重懸至500 μl， 移液至BD流式細(xì)胞管4℃避光保存。

1. 3. 4 上流式細(xì)胞儀分析 熒光抗體染色后， 用流式細(xì)胞儀分析， 并用flowjo 流式分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1. 3. 5 擴(kuò)增患者體內(nèi)的抗原特異性的記憶性母細(xì)胞樣T淋巴細(xì)胞 ①細(xì)胞培養(yǎng)：將分離出來的PBMC置于10%含胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)， 添加細(xì)胞因子（10 ng/ml Anti-CD3、10 ng/ml Anti-28， 10 ng/ml IL-2）。培養(yǎng)環(huán)境：體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度及37℃下。每隔3 d更換新鮮RPMI1640培養(yǎng)液， 補(bǔ)充細(xì)胞因子。②每隔5 d添加A2-SL9抗原肽刺激PBMC， 并添加細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素-8（IL-8）、白細(xì)胞介素-15（IL-15）]， 5 d后更換培養(yǎng)液及添加補(bǔ)充細(xì)胞因子。培養(yǎng)時間15 d。③標(biāo)記流式抗體及主要組織相容性復(fù)合體（MHC）四聚體， 流式篩選抗原特異性TSCM， 計(jì)算TSCM比例。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ x-±s）表示， 采用t檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 通過流式細(xì)胞技術(shù)驗(yàn)證HIV-1抗原特異性CD8+ TSCM細(xì)胞（樣本1） 根據(jù)CD8+ TSCM細(xì)胞的表位特點(diǎn)標(biāo)記流式抗體， HIV-1抗原表位的標(biāo)記需要四聚體技術(shù)， 本實(shí)驗(yàn)選取Tetramer-SL9作為1個抗原表位標(biāo)記， 其帶有PE顏色標(biāo)簽， 可以通過流式細(xì)胞儀監(jiān)測到。首先通過選定CD8+ T細(xì)胞， 然后在CD8+ T細(xì)胞中選定CD45RO- CD45RA+的細(xì)胞亞群;進(jìn)一步再選定出CD62L+ CCR7+的細(xì)胞亞群， 隨后在這個亞群細(xì)胞的基礎(chǔ)上， 選定CD95+并且CD122+雙陽性的細(xì)胞， 同時被Tetramer-SL9所標(biāo)記， 該群細(xì)胞就是本研究所要關(guān)注的TSCM細(xì)胞。見圖1。

2. 2 HIV-抗原特異性TSCM細(xì)胞在CD8+T淋巴細(xì)胞中的構(gòu)成 利用結(jié)果中的圈門數(shù)據(jù)分別計(jì)算10個樣本中HIV-1抗原特異性TSCM細(xì)胞在CD8+ T淋巴細(xì)胞中所占比例。見圖2。

2. 3 擴(kuò)增后HIV-抗原特異性TSCM細(xì)胞在CD8+T淋巴細(xì)胞中的百分比 將患者血樣分為實(shí)驗(yàn)組（添加細(xì)胞因子IL-8、IL-15）和對照組（無添加細(xì)胞因子）， 分別觀察基線（T0）， 5 d后（T1）， 10 d后（T2）， 15 d后（T3）4個檢測點(diǎn)TSCM細(xì)胞在CD8+ T淋巴細(xì)胞中的比例。處理前均值為0.0027%， 處理后見圖3。

試驗(yàn)結(jié)果表明， 細(xì)胞因子（IL-8、IL-15）可以在體外實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)增CD8+ T淋巴細(xì)胞中TSCM細(xì)胞的百分比。并且隨著時間延長， 可能誘導(dǎo)出更多的TSCM細(xì)胞， 但是峰值在10 d 左右。

3 討論

記憶性T淋巴細(xì)胞在機(jī)體對感染性疾病和腫瘤的免疫應(yīng)答中扮演著關(guān)鍵角色[3]， TSCM為一群缺乏快速效應(yīng)細(xì)胞功能， 但具有強(qiáng)大增殖及自我更新潛力的細(xì)胞亞群， 它能夠持續(xù)地產(chǎn)生記憶細(xì)胞亞群和效應(yīng)細(xì)胞亞群， 這些特性使其突破移植低效率、持續(xù)時間短、缺乏調(diào)控持續(xù)免疫攻擊等限制[4-6]。

本實(shí)驗(yàn)將TSCM細(xì)胞和艾滋病患者CD8+ T細(xì)胞有機(jī)地聯(lián)系到一起， 利用四聚體技術(shù)標(biāo)記TSCM細(xì)胞表面的HIV-1抗原表位（SL9）來鑒定HIV-1抗原特異性TSCM細(xì)胞在艾滋病患者外周血中的存在情況， 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明這群細(xì)胞的確存在于艾滋病患者體內(nèi)， 但在CD8+ T淋巴細(xì)胞中所占比例很低， 而標(biāo)記HIV-1抗原表位（SL9）有利于更好識別TSCM細(xì)胞。

本研究明確了HIV-1抗原特異性TSCM的存在情況， 通過添加細(xì)胞因子（IL-8、IL-15）， 可以明顯促進(jìn)TSCM細(xì)胞的形成。與此同時， 隨著CD8+ T細(xì)胞數(shù)量的增加， 相應(yīng)的TSCM細(xì)胞在其中的比例也隨之顯著增加， 在第10天達(dá)到高峰。但是， 由于細(xì)胞在培養(yǎng)過程中隨之時間的推移， 會有不同程度的死亡， 在體外培養(yǎng)的第15天， CD8+ T細(xì)胞數(shù)量以及CD8+ T細(xì)胞中TSCM細(xì)胞的比例也出現(xiàn)下降趨勢。

綜上所述， 本研究證明了艾滋病患者CD8+ T細(xì)胞中TSCM細(xì)胞的存在， 并采用HIV-1抗原表位（SL9）來標(biāo)記， 同時初步探索建立利用細(xì)胞因子（IL-8、IL-15）可能是促進(jìn)TSCM細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增的有效方法。該方法安全性能高， 擴(kuò)增效果好， 可為艾滋病的過繼免疫治療提供技術(shù)參考。

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[收稿日期：2018-10-25]