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    木蘭花堿的熒光性質(zhì)及其在中藥分析中的應(yīng)用研究

    2019-07-01 10:17:32曹津津孫啟瑞李文紅宋冉冉曹倩玉王可魏永巨
    分析化學(xué) 2019年6期
    關(guān)鍵詞:青風(fēng)藤中藥

    曹津津 孫啟瑞 李文紅 宋冉冉 曹倩玉 王可 魏永巨

    摘?要?研究了木蘭花堿(Magnoflorine,MAG)的熒光光譜和吸收光譜特征,考察了pH值等環(huán)境因素對熒光和吸光的影響,探討了光譜性質(zhì)與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系。木蘭花堿水溶液的三維熒光圖譜中呈現(xiàn)3個熒光峰,激發(fā)波長λex為230、275和315 nm,發(fā)射波長λem均為420 nm。隨溶液pH值升高,激發(fā)光譜中的熒光峰紅移并出現(xiàn)等熒光點,吸收光譜中的吸收峰紅移并形成等色點,表明木蘭花堿分子中的1個羥基發(fā)生了質(zhì)子電離,用pH值-吸光法測得電離常數(shù)pKa=4.77。以L-色氨酸為參比,測得木蘭花堿水溶液的熒光量子產(chǎn)率Y=0.19。青風(fēng)藤等多種中藥材的三維熒光圖譜中呈現(xiàn)木蘭花堿的特征熒光峰,λex/λem=315 nm/420 nm處的熒光峰不受共存組分的影響,且熒光強度穩(wěn)定,據(jù)此建立了中藥青風(fēng)藤中木蘭花堿的熒光分析新方法。在0.04~1.25 μg/mL范圍內(nèi),體系熒光強度IF與木蘭花堿濃度c呈線性關(guān)系,回歸方程為:IF=6146.8c+ 24.4(R=0.999, n=11),檢出限0.52 ng/mL。采用本方法測得青風(fēng)藤對照藥材中MAG的含量為0.63%,加標(biāo)回收率為101.2%~102.7%。LC-MS/MS法測定結(jié)果為0.61%,與熒光法基本一致。本方法簡便快速,結(jié)果可靠,有良好的實際應(yīng)用價值。

    關(guān)鍵詞?木蘭花堿; 青風(fēng)藤; ?中藥; ?三維熒光; ?熒光分析

    1?引 言

    木蘭花堿(又稱木蘭堿,Magnoflorine,MAG,圖1)屬于阿樸菲類生物堿(Aporphine alkaloids)[1],廣泛存在于防己科、馬兜鈴科等藥用植物中[2~4],具有抗氧化[3,5]、膜保護(hù)[6]、降血糖[7]和抗遺忘[8]等藥理作用,但目前木蘭花堿尚未被收錄入中國藥典或作為藥品標(biāo)準(zhǔn)。關(guān)于藥用植物和生物樣品中木蘭花堿的分析方法,主要包括色譜法[9,10]、毛細(xì)管電泳法[11,12]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法[13],迄今尚未見關(guān)于木蘭花堿熒光性質(zhì)及熒光分析方法的研究報道。

    熒光分析法具有靈敏度高、選擇性好、簡便快速、環(huán)境友好等優(yōu)點,在生化分析和化學(xué)藥物分析中應(yīng)用廣泛。但在中藥分析中,由于樣品所含成分的復(fù)雜性以及中藥成分熒光光譜數(shù)據(jù)的缺乏,熒光分析法的應(yīng)用尚不廣泛[14]。目前,中國藥典中收錄的中藥分析方法主要是色譜等方法,熒光法未被用于中藥成分的定量分析。用熒光法測定中藥成分的含量,難點在于如何避免共存組分的干擾。文獻(xiàn)報道的中藥熒光分析方法可大致分為兩類:一是常規(guī)的熒光分析法,基于被測組分與共存組分在熒光波長和強度上的差異,實現(xiàn)快速分析[15,16]; 二是采用三維熒光法結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法[17,18],利用三維熒光光譜信息,借助數(shù)學(xué)統(tǒng)計分離程序,實現(xiàn)復(fù)雜樣品中熒光性質(zhì)相近的藥效成分的計算分析[19,20]。常規(guī)方法簡便快速,便于應(yīng)用; 三維熒光結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法可以解決某些常規(guī)方法難以解決的問題,擴展了熒光法的應(yīng)用范圍。中藥成分種類繁多、數(shù)量龐大,開展中藥成分熒光性質(zhì)的研究是發(fā)展中藥熒光分析法的關(guān)鍵。

    本研究組在研究生物堿類化合物的熒光性質(zhì)時,發(fā)現(xiàn)木蘭花堿有強熒光,其三維熒光圖譜有很好的特征性。將木蘭花堿標(biāo)準(zhǔn)品的三維熒光圖譜與本實驗室前期得到的數(shù)百種中藥對照藥材的三維熒光圖譜進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)青風(fēng)藤等多種中藥材的三維熒光圖譜中呈現(xiàn)木蘭花堿的特征熒光峰,由此推測這些中藥材中可能含有木蘭花堿,因此,可望將木蘭花堿的熒光性質(zhì)用于中藥分析。本研究對木蘭花堿和青風(fēng)藤的熒光性質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)考察,建立了青風(fēng)藤中木蘭花堿的熒光分析方法,并利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)對本方法進(jìn)行了驗證。

    2?實驗部分

    2.1?儀器與試劑

    F-7000熒光分光光度計(日本Hitachi公司); UV-2501PC紫外-可見分光光度計(日本Shimadzu公司); LC-TRIPLE QUAD 5500液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國AB SCIEX公司); Milli-Q型超純水機(美國Millipore公司); 828型pH/ISE測試儀(芬蘭Orion公司); 十萬分之一分析天平(日本Shimadzu公司)。

    木蘭花堿(CAS: 2141-9-5,HPLC級,純度>98%,成都瑞芬思生物科技有限公司)溶液:稱取木蘭花堿對照品2.08 mg,用水溶解并定容至25 mL,配制成83.2 μg/mL木蘭花堿標(biāo)準(zhǔn)溶液,低溫保存,備用,使用時適當(dāng)稀釋; 青風(fēng)藤對照藥材(1251-0301,防己科植物青藤 Sinomenium acutum ( Thunb.) Rehd. et Wils.(Qingfengteng)的干燥藤莖,中國食品藥品檢定研究院); 甲醇(色譜純,美國Tedia公司),經(jīng)檢驗無熒光; 甲酸(色譜純,美國Dikma公司); 緩沖溶液:將含磷酸、乙酸和硼酸的混合溶液(均為0.20 mol/L)與NaOH溶液(1.0 mol/L)以一定比例混合,用于調(diào)節(jié)pH值; L-色氨酸(L-Tryptophan,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所); 實驗用水為二次去離子水,經(jīng)檢測無熒光。

    2.2?實驗方法

    2.2.1?pH值對吸光和熒光的影響?在一系列10 mL容量瓶中,分別加入適量木蘭花堿溶液,以緩沖溶液控制pH值,以水定容,分別掃描各溶液的吸收光譜或熒光光譜,并精確測量pH值,熒光測定時選擇激發(fā)和發(fā)射狹縫(Slit)為5.0 nm,光電倍增管負(fù)高壓(PMT)為700 V。

    2.2.2?熒光量子產(chǎn)率的測量?在25 mL容量瓶中分別加入適量L-色氨酸溶液和木蘭花堿溶液(控制溶液濃度,使激發(fā)波長下的吸光度A≤0.05),以水定容。測量吸收光譜和熒光光譜,測量激發(fā)波長處的吸光度和積分熒光強度。以L-色氨酸為參比(280 nm處的熒光量子產(chǎn)率0.14),計算待測物質(zhì)的熒光量子產(chǎn)率[21]。

    2.2.3?青風(fēng)藤樣品提取液的制備?經(jīng)不同比例的甲醇-水提取溶劑的對比實驗,確定提取溶劑中甲醇的體積分?jǐn)?shù)為60%。稱取青風(fēng)藤對照藥材粉末0.025 g,以提取溶劑溶解并定容至50 mL,超聲振蕩30 min,靜置過夜,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,得濃度為500 μg/mL的提取液。

    2.2.4?色譜條件?Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(50 mm × 4.6 mm, 1.8 μm); ?流動相: 甲醇-?0.01%甲酸(60∶40, V/V); ?流速0.3 mL/min; 柱溫40℃; ?進(jìn)樣量4 μL。

    2.2.5?質(zhì)譜條件?離子源為電噴霧電離源 (ESI); 氣簾氣(CUR): 275 kPa; 離子化電壓5.5 kV; 離子源溫度500℃; 噴霧氣(GAS1): 345 kPa; 輔助加熱氣(GAS2): 345 kPa; 正離子全掃描方式; 采用多離子反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式定量分析。木蘭花堿的質(zhì)譜檢測參數(shù)見表1,與文獻(xiàn)[22]中的參數(shù)基本一致。

    3?結(jié)果與討論

    3.1?木蘭花堿水溶液的三維熒光圖譜

    在酸性條件下,木蘭花堿水溶液在發(fā)射波長(λem)420 nm處呈現(xiàn)一組熒光峰,激發(fā)波長(λex)分別為230、 270和300 nm(圖2A); pH值為近中性時(圖2B),λem基本不變,λex和熒光峰形有所變化,圖2A中300 nm激發(fā)峰紅移至315 nm; pH值升高至堿性時(圖2C),熒光波長基本不變。上述結(jié)果表明,在溶液pH值由酸性到近中性的過程中,木蘭花堿的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化,其分子中的羥基可能發(fā)生了質(zhì)子電離[23]。

    木蘭花堿三維熒光圖譜(圖2)有較強的熒光強度和很好的特征性。本實驗室曾研究過數(shù)百種中藥材的三維熒光圖譜[24],因缺乏中藥成分熒光性質(zhì)基礎(chǔ)資料,其中大多數(shù)難以判斷熒光峰的歸屬。將圖2與這些中藥材的三維熒光圖譜進(jìn)行對比,發(fā)現(xiàn)青風(fēng)藤、川烏、黃連、威靈仙、關(guān)黃柏、酸棗仁、淫羊藿等中藥材的三維熒光圖譜中呈現(xiàn)木蘭花堿的熒光峰。因此,木蘭花堿的熒光性質(zhì)可望用于這些中藥材的鑒別與其中木蘭花堿的測定。

    3.2?木蘭花堿熒光的影響因素

    測定了木蘭花堿在不同pH值條件下的二維熒光光譜(圖3A)。在酸性條件下(pH 1.7~5.9),隨pH值升高,激發(fā)光譜中270 nm處的熒光峰減弱并紅移至275 nm,230 和300 nm處的熒光峰升高并分別紅移至235和315 nm,在252和297 nm出現(xiàn)等熒光點; 發(fā)射光譜中420 nm處的熒光峰波長不變,但強度減弱。在近中性及堿性條件下(pH 6.4~14.0),熒光波長和強度均基本不變。熒光強度與pH值之間的關(guān)系如圖3B所示。

    根據(jù)不同pH值下木蘭花堿的熒光光譜變化推斷,在pH 1.7~14.0之間,木蘭花堿發(fā)生了羥基質(zhì)子電離。激發(fā)光譜中等熒光點的出現(xiàn)表明,在pH值變化過程中,木蘭花堿存在兩種熒光型體的轉(zhuǎn)化[23],一種是在酸性條件下的分子型體,另一種是在近中性和堿性條件下的離子型體,兩種型體的熒光激發(fā)波長不同,發(fā)射波長相同,均為420 nm。木蘭花堿分子結(jié)構(gòu)中有2個羥基,但只有1個羥基質(zhì)子電離。從分子結(jié)構(gòu)看,木蘭花堿B環(huán)上季銨N原子帶正電荷,對相鄰A環(huán)的π-電子體系有吸引作用,使得C1位上的羥基較易電離出質(zhì)子。文獻(xiàn)[25]計算得到C1位OH鍵能(88.7 kcal/mol)低于C11位OH鍵能(90.9 kcal/mol)。因此,推測應(yīng)該是C1位羥基質(zhì)子電離。質(zhì)子電離后產(chǎn)生的氧負(fù)離子與A環(huán)共軛,增大了A環(huán)的電子云密度,導(dǎo)致激發(fā)波長(吸收波長)紅移。另一方面,氧負(fù)離子可能與空間距離較近的D環(huán)C11位羥基形成分子內(nèi)氫鍵[26],導(dǎo)致C11位羥基質(zhì)子難以電離。

    甲醇和水是提取及測定中藥熒光成分時的常用溶劑。本實驗結(jié)果表明,在水-甲醇體系中,隨著甲醇體積分?jǐn)?shù)增大,木蘭花堿的λem逐步藍(lán)移; 在甲醇中λem=375 nm,熒光有所增強。從實驗成本和環(huán)境保護(hù)等方面考慮,應(yīng)選擇在近中性水溶液中測定木蘭花堿的熒光。

    有序介質(zhì)常對物質(zhì)的熒光有敏化作用。結(jié)果表明, 0.02 mol/L 十二烷基硫酸鈉(SDS)和溴化十六烷基三甲銨(CTAB)對木蘭花堿水溶液的熒光基本無影響。因此,可直接利用木蘭花堿的內(nèi)源熒光。

    在日內(nèi)和日間(1,3和5 d)分別測量9份相同濃度的木蘭花堿水溶液的熒光強度,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.5%和1.2%,表明木蘭花堿的熒光穩(wěn)定。

    綜上,木蘭花堿在近中性水溶液中有穩(wěn)定的強熒光,適宜用于分析測定。

    3.3?木蘭花堿的吸收光譜與電離常數(shù)

    為了驗證上述木蘭花堿熒光光譜隨pH值變化的分子機理,測定了木蘭花堿水溶液在不同pH值下的吸收光譜(理論上,熒光激發(fā)光譜與吸收光譜的圖形相似,隨pH值變化的趨勢相同),結(jié)果見圖4A。在酸性條件下,木蘭花堿在250~380 nm波長范圍內(nèi)有2個吸收峰,吸收波長分別為268和300 nm。隨pH值升高,268 nm處的吸收峰紅移至275 nm,吸光度降低; 同時,300 nm吸收峰紅移至316 nm,吸光度升高,在254 nm和302 nm形成等色點; pH>6后,吸收光譜不再隨pH值的升高而變化。各光譜曲線在320 nm處的吸光度A與pH值的關(guān)系呈S形曲線(圖4B)。在240~350 nm范圍,圖4中的吸收光譜與圖3中的熒光激發(fā)光譜形狀相似,變化趨勢相同。

    圖4A中出現(xiàn)等色點,表明木蘭花堿在水溶液中存在兩種吸光型體(也是熒光型體)的相互轉(zhuǎn)化,木蘭花堿發(fā)生了質(zhì)子電離,表現(xiàn)為一元弱酸。根據(jù)圖4中的光譜數(shù)據(jù),可以用pH值-光度法測定木蘭花堿羥基質(zhì)子的電離常數(shù)pKa,計算公式為:

    式中, AHL表示弱酸分子全部以分子型體存在時的吸光度(如圖4B中pH 2.5附近的A值), AL表示弱酸分子全部以離子型體存在時的吸光度(如圖4B中pH 7.0附近的A值)。將圖4B中位于S形曲線中間部分的 pH-A數(shù)據(jù)代入式(1),計算pKa,結(jié)果見表2, 平均值為pKa=4.77。

    3.4?木蘭花堿的熒光量子產(chǎn)率的測定

    按照2.2.2節(jié)方法測得木蘭花堿水溶液(離子型體)的熒光量子產(chǎn)率為0.19,屬于強熒光物質(zhì)。從分子結(jié)構(gòu)(圖1)上看,木蘭花堿具有強熒光物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)特征:具有大的共軛π鍵結(jié)構(gòu),圖1中A、D兩個苯環(huán)形成聯(lián)苯結(jié)構(gòu),共軛程度較高; 具有剛性平面結(jié)構(gòu),C環(huán)與A、D兩環(huán)連接,增加了分子的平面性和剛性,其離子型體的C1位氧負(fù)離子可能與C11位羥基形成分子內(nèi)氫鍵,也使分子的剛性增強; 苯環(huán)上的給電子取代基(羥基和甲氧基)具有增強熒光的作用; 從圖1和熒光波長為420 nm可以推斷,木蘭花堿的最低單線電子激發(fā)態(tài)S1為(π,π*)型,此類躍遷幾率高,熒光強度大。

    3.5?中藥青風(fēng)藤提取液的三維熒光圖譜

    青風(fēng)藤為防己科植物青藤和毛青藤的干燥藤莖,主治風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)腫痛等癥[27]。在青風(fēng)藤藥材中已發(fā)現(xiàn)逾60種化合物,主要包括生物堿類、脂類、甾醇類、萜類、菲類和蒽醌類等[28],其藥效成分主要為嗎啡烷類[29,30]和阿樸菲類[31]生物堿。雖然青風(fēng)藤中的化學(xué)成分種類繁多,但其提取液的熒光光譜比較簡單(圖5)。

    圖5與圖2中,位于λem=420 nm的熒光峰的激發(fā)波長和光譜形狀基本一致,且隨pH值的變化基本相同,可判斷為木蘭花堿的熒光峰。在圖5中,短波處(λem=330~340 nm)的熒光峰推測為嗎啡烷類生物堿,此類化合物的分子共軛程度較低,熒光波長較短。在堿性條件下(圖5C),木蘭花堿熒光峰的λem略有紅移,可能是菲類及蒽醌類化合物所致,這些化合物的分子共軛程度較高,熒光波長較長。對比圖5和圖2可知,如選擇在中性水溶液中,激發(fā)波長為315 nm時測定木蘭花堿的熒光,青風(fēng)藤中的其它組分基本不干擾。

    3.6?青風(fēng)藤中木蘭花堿的熒光法測定

    測定不同濃度的木蘭花堿系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光光譜(圖6),熒光強度IF(λex/λem=315 nm/420 nm)與木蘭花堿在0.04~1.25 μg/mL濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,回歸方程為IF=6146.8c+ 24.4,相關(guān)系數(shù)R=0.999(n=11)。以空白信號3倍的標(biāo)偏差計算方法的檢出限為0.52 ng/mL。

    在青風(fēng)藤樣品提取液中加入不同體積的木蘭花堿標(biāo)準(zhǔn)溶液,加標(biāo)回收實驗結(jié)果見表3?;厥章试?01.2%~102.7%之間。 配制4份不同濃度的青風(fēng)藤提取液,采用本方法測得木蘭花堿的含量平均值為0.63%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD, n=4)為0.1%。用本方法測定木蘭花堿時,如果樣品提取液中的其它組分在測量波長下也產(chǎn)生熒光,則會對測定產(chǎn)生干擾。利用LC-MS/MS,測得同一青風(fēng)藤樣品中木蘭花堿的含量為0.61%,RSD為2.5%(n=3)。兩種方法測定結(jié)果基本一致。

    4?結(jié) 論

    木蘭花堿水溶液可產(chǎn)生穩(wěn)定的強熒光,可用于中藥樣品中木蘭花堿的測定。本研究建立的青風(fēng)藤中木蘭花堿的熒光分析新方法具有簡便快速、環(huán)境友好、靈敏度高、結(jié)果可靠等優(yōu)點, 研究結(jié)果為中藥和生化樣品中木蘭花堿的分析測定提供了新思路。

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