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    超高分辨質譜研究離子源內氣體氛圍對電噴霧電離呼出氣的影響

    2019-07-01 10:17:32杜睿張羽玲曾嘉發(fā)方明亮SashoGligorovski周振李雪
    分析化學 2019年6期

    杜睿 張羽玲 曾嘉發(fā) 方明亮 Sasho Gligorovski 周振 李雪

    摘?要?二次電噴霧電離質譜(Secondary electrospray ionization mass spectrometry, SESI-MS)可實時在線檢測人體呼出氣中的揮發(fā)性有機化合物(Volatile organic compounds, VOCs),但呼出氣中VOCs的電離效率會受到源內氣體氛圍的影響。本研究在自制SESI源的基礎上,以超高分辨質譜(Ultra-high resolution mass spectrometer, UHRMS)為分析技術,以人體呼出氣中典型內源性化合物丙酮(Acetone)和吲哚(Indole),以及典型基質鄰苯二甲酸酐(Phthalic anhydride, PA)和鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate,DP)為目標化合物,初步探究了SESI源內不同氣體氛圍(氮氣(N2)、二氧化碳(CO2)、純凈零氣(Zero air))對目標VOCs電離效率的影響。結果表明,在SESI源內通入3種純凈氣體,可有效提高呼出氣中丙酮和吲哚的信號強度和信噪比;同時,由于降低了源內基質含量,可顯著減弱基質干擾。3種純凈氣體中,通入N2后的效果最為顯著。本研究結果可為SESI源設計及參數設置、呼出氣分析方法開發(fā)提供重要依據。

    關鍵詞?呼氣代謝組; 直接質譜分析; 超高分辨質譜; 二次電噴霧電離; 氣體氛圍

    1?引 言

    二次電噴霧電離質譜(Secondary electrospray ionization mass spectrometry,SESI-MS)可實時在線檢測人體呼出氣中揮發(fā)性化學成分(Volatile organic compounds,VOCs)[1],具有無損、實時、無需樣品前處理、高通量等優(yōu)勢,已成功用于人體生物鐘[2]、診斷肺部疾病[3]、檢測人體呼出氣中內源性代謝物(如色氨酸)[4]等生物醫(yī)學研究中。SESI源工作原理為:在常溫常壓環(huán)境中,呼氣中的中性分子被電噴霧產生的初級離子電離生成分子離子[2,5~8](圖1)。SESI技術的雛形,即電噴霧形成帶電微滴電離氣相分子的概念,由Fenn等于1989年首次提出[9]; 2000年,Wu和Hill將這種電離技術命名為SESI[10]。目前,文獻中報道的SESI源,都是自制SESI源,直至2018年才有一款商品化SESI源在展會中出現[11]。SESI源易于自組建,且可與多種商業(yè)質譜接口耦合[12~14]。從質量分析器的角度,以超高分辨質譜(Ultrahigh resolution mass spectrometer,UHRMS)與SESI源結合,優(yōu)勢最顯著。采用UHRMS,根據準確質量數,能提高定性分析的準確性,有效區(qū)分同重素[15]。

    由于自制SESI源不完全封閉,室內空氣會進入源內,與呼出氣中待分析的目標化合物(如丙酮、吲哚)競爭初級ESI電噴霧形成的微液滴上的有限電荷,降低目標物的電離效率及檢出靈敏度; 而且,對于同時存在于呼出氣與室內空氣中的VOCs,也會降低目標化合物的信噪比。在SESI源內通入不含VOCs的純凈氣體,通過降低源內基質濃度,或可解決上述問題。但目前尚沒有SESI源內純凈氣體氛圍對呼出VOCs以及基質的電離效率的影響研究。

    本研究利用自行搭建的SESI源,以呼出氣中典型內源性代謝物丙酮(Acetone)[2,13]和吲哚(Indole)[12],以及室內空氣中典型VOCs鄰苯二甲酸酐(Phthalic anhydride,PA)[16,17]和鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate,DP)[18]為目標化合物,以UHRMS為檢測手段,探究源內不同純凈氣體氛圍(氮氣(N2)、二氧化碳(CO2)、純凈零級空氣(Zero air,包含: 79% N2,21% O2,< 1 part per million by volume(ppmv)烷烴類物質))對SESI源電離不同來源VOCs的影響,為優(yōu)化離子源設計及參數設置、提高呼出氣中VOCs檢測信噪比提供了依據。

    2?實驗部分

    2.1?儀器與試劑

    QExactiveTM四極桿組合靜電場軌道阱傅里葉變換超高分辨質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司); 自制SESI源是將nanoESI商品源與自制質譜接口組合而成(圖2): nanoESI源(美國Thermo Fisher Scientific公司),自制質譜接口[6](廣州禾信儀器股份有限公司定制),包括一個離子化反應腔和兩個進樣管(圖2A),均為不銹鋼材質,目的在于減少呼出VOCs的吸附,同時,進樣管與腔體為可拆卸設計,便于定期清理; Milli-Q Integral 5超純水儀(密理博中國有限公司); AJH-3080A零氣發(fā)生器(北京安捷華科技有限公司)。

    標準校正液(美國Thermo Fisher Scientific公司); 甲醇(色譜級,純度99.9%,美國默克公司)。N2標準氣體(純度 ≥ 99.999%,佛山市佛鋼氣體有限公司); CO2標準氣體(純度99.99%,廣州市粵佳氣體有限公司)。醫(yī)療呼吸氣體干燥(Nafion)管(內徑1.32 mm,長度60 cm,ME 60系列,美國博純有限責任公司); 特氟龍(PTFE)管(內徑4 mm,上海畢帝塑料公司); 聚氨酯(Polyurethane,PU)管(內徑2 mm, 上海畢帝塑料公司)。1 mL移液槍頭(德國Eppendorf公司)。質量流量控制器(量程0~1 L/min,韓國Line Tech公司); Lzb-3微型玻璃轉子流量計(量程0~0.6 L/min,浙江余姚工業(yè)自動化儀表廠)。

    2.2?樣品分析

    2.2.1?樣品采集?人體呼出氣采樣流程參見文獻[6],即志愿者(2名,25歲和29歲,女性)通過鼻吸、嘴呼的方式提供呼出氣樣品。采樣前,志愿者用純水漱口,并在實驗室內靜坐30 min[2]。采集呼氣時,志愿者先深呼吸3次,再采集全呼氣[18~20],一次性呼氣吹嘴由1 mL移液槍頭改制而成。樣品傳輸管路包括: Nafion管、PTFE管和Lzb-3微型玻璃轉子流量計。Nafion管用于去除呼出氣中的水汽,避免水汽冷凝在PTFE管內壁、吸附VOCs[6]; PTFE管可減少VOCs吸附損失; Lzb-3微型玻璃轉子流量計用于控制呼出氣流速。還需說明的是,ID 1.32 mm的Nafion管所允許的最大氣體流量為0.4 L/min,所以單次采樣時,呼氣流速控制為0.4 L/min。每個實驗條件下,每位志愿者重復呼氣5~6次。

    2.2.2?SESI-UHRMS分析?SESI-UHRMS實時在線檢測呼出氣裝置如圖2B所示。SESI源有兩個進樣口: 呼出氣樣品的進樣口和純凈氣體的進樣口(未通入純凈氣體時,源內為室內空氣)(圖2A)。ESI溶劑為超純水(電阻率18.2 MΩ·cm),流速200 nL/min。 ESI電壓為+2.5 kV(正離子檢測模式)/2.5 kV(負離子檢測模式),質譜接口離子傳輸管溫度為150℃。檢測模式: 正負離子切換掃描(切換時間0.01 s); 全掃描,質量數范圍m/z 50~300,質譜質量分辨率為140000 FWHM(m/z 200)。

    2.3?數據處理

    通過軟件Xcalibur 3.0確定目標化合物以及質量偏差。通過軟件Origin 9.0中“Statistics”功能的“Descriptive Statistics”,“Normality Test”判斷原始數據是否服從正態(tài)分布; 并通過“Homogeneity of Variance Test”,“Levene's Test”進行方差齊性分析,用One-way ANOVA方法,進行差異性分析,通過均值比較(Means comparision)中的多重比較方法(Tukey's multiple means comparison test)進行組內差異性對比分析。

    3?結果與討論

    3.1?定性分析

    以N2氛圍下SESI-UHRMS實時在線檢測人體呼出氣的結果為例,志愿者呼出氣一級質譜圖(背景已扣除)如圖3所示。

    根據目標化合物的分子結構特征和質子親和力[22~24],結合SESI源電離機理[15,25,26],可知丙酮[2,13]、吲哚[12]、PA[16,17]和DP[18]均會形成質子化分子離子[M + H]+。在志愿者呼氣樣品實時監(jiān)測過程中,在m/z 59.0499、118.0651、149.0230和279.1582處分別檢測到質譜峰,元素組成鑒別為[C3H7O]+、[C8H8N]+、[C8H5O3]+和[C16H23O4]+,質量偏差(實測值與理論值的差值)為0.8、0.0、0.3和0.9 mDa,可確定上述質譜峰即為呼出氣中丙酮、吲哚及室內空氣中PA和DP的質子化分子離子(圖4)。

    3.2?SESI源內氣體氛圍對呼出VOCs的影響

    本研究選擇N2、CO2、Zero air作為考察的純凈氣體,主要基于如下原因: (1)3種氣體理化性質相對穩(wěn)定,且都是呼出氣中的成分(按體積比計算,呼出氣包含: 78.14% N2,13.6%~16% O2,4.0%~5.3% CO2,5% 水汽,1 ppmv VOCs,1 ppmv氨氣); (2)不易爆炸,相對安全; (3)是實驗室常用標準氣體,易于獲取。

    當源內氣體氛圍為N2,充入流速分別為0.1和0.8 L/min時,丙酮檢出強度增加約9倍, 信噪比(S/N)提高約2倍(表1),吲哚信號強度增加約6倍(表1)。值得注意的是,對比SESI源內未通入N2與N2通入流速為0.1 L/min時呼出氣的檢測結果,發(fā)現丙酮信號沒有顯著差別,而吲哚的信號增強約2倍,且信號重現性(RSD)得到改善,RSD由55%減小為10%。

    與N2結果相似(表1,圖5),CO2氛圍下,當充入流速為0.8 L/min時,相比于0.1 L/min,丙酮和吲哚的信號強度分別提高約1倍和4倍; 對于Zero air,當充入流速為0.8 L/min 時,相比于0.1 L/min,丙酮和吲哚的信號強度分別提高約11倍和9倍。對比未通入CO2、Zero air與0.1 L/min 的CO2、Zero air氛圍下呼出氣的檢測結果,發(fā)現丙酮和吲哚的信號均沒有顯著差別,且在這兩種氛圍氣體下,呼出氣中吲哚信號的重現性未得到顯著改善。

    綜上,當以0.8 L/min的流速向源內充入N2、CO2和Zero air時,呼出氣中吲哚及丙酮的檢出強度均明顯提高(圖5)。

    在純凈氣體充入流速均為0.8 L/min的條件下,對呼出氣中丙酮及吲哚的檢出信號強度進行正態(tài)分布檢驗及方差齊性檢驗,結果滿足單因素方差分析(ANOVA analysis)的條件。ANOVA結果(圖6)表明,當顯著性水平為0.05時,丙酮(Prob>F: 1.0 ×10?8; F Value 89.8)及吲哚(Prob>F: 3.7 ×10?5; F Value 23.1)在N2、CO2、Zero air氣體氛圍下的檢出強度均存在顯著性差異。丙酮在Zero air 氛圍下的強度均值略高于N2氛圍下的結果,CO2氛圍下最低; 吲哚在N2氛圍下的信號強度高于Zero air和CO2氛圍下的結果。進一步對比3種純凈氣體氛圍兩兩之間的差異性,多重比較分析結果(圖7)表明,在顯著性水平為0.05時,呼出氣中丙酮的信號在N2與CO2之間(Prob: 2.4 ×10?6,Sig=1)、CO2與Zero air之間(Prob: 0,Sig=1)及N2和Zero air之間(Prob: 3.3 ×10?4,Sig=1)均存在顯著性差異; 呼出氣中吲哚的信號在N2與CO2之間(Prob: 2.9 ×10?5,Sig=1)、N2和Zero air之間(Prob: 0.002,Sig=1)均存在顯著性差異,而在CO2與Zero air之間(Prob: 0.1,Sig=0)不存在顯著差異。呼出氣中丙酮及吲哚的信號在N2和Zero air之間的差異顯著性均最小,推測主要是由于Zero air的主要成分為N2(79%)。綜上,為提高SESI-MS檢測呼氣中內源性VOCs的靈敏度,可在自制SESI源中通入N2。

    3.3?SESI源內氣體氛圍對基質的影響

    分析SESI源內氣體氛圍對基質的影響,結果表明,以N2氛圍為例,當通入氣體流速分別為0.1和0.8 L/min時,即當充入N2流速提高8倍時,PA和DP的信號強度分別減少約0.6和0.1倍(表2)。此結果與3.2節(jié)中呼出氣中VOCs的檢出情況相反,推測可能是SESI源內純凈氣體含量增加后,基質在源內含量降低,進而檢出強度降低。此外,N2通入流速為0.1 L/min時的結果與未通入N2的結果沒有顯著差別,表明此時源內N2含量還無法影響信號檢出效果,此結論與呼出氣中丙酮的檢出結果一致(表1和表2)。

    氣體氛圍為CO2和Zero air時,趨勢與N2相似(表2,圖8),當充入氣體流速為0.8 L/min時,相比于0.1 L/min氣體流速,PA和DP的信號強度分別減少約0.5和0.1倍。

    值得注意的是,當實時檢測呼氣時,PA和DP信號強度,在N2、CO2氣體氛圍中,呈降低趨勢,而在Zero air氛圍中出現進樣峰,本研究組將會在后續(xù)工作中進一步探究這一現象。

    8; F Value 69.6)在3種氣體氛圍下檢出信號穩(wěn)定,且檢出強度均存在顯著性差異; 并且,在N2氛圍下PA和DP的信號強度均低于Zero air和CO2氛圍下的結果,說明N2氛圍對降低背景基質干擾的影響最大。

    進一步對比0.8 L/min流速下3種純凈氣體氛圍兩兩之間的差異性,結果(圖10)表明,8,Sig=1)CO2與Zero air之間(Prob: 4.6 ×10?6, Sig=1)也均存在顯著性差異。Zero air是造成PA及DP信號強度差異顯著的主要原因。上述結果說明,N2氛圍對于降低基質PA及DP干擾的效果最好,而Zero air氛圍最差。

    綜上,自制SESI源內通入足夠量的純凈N2,可以顯著增強呼出氣中丙酮及吲哚的信號強度,同時顯著降低基質信號強度。此外,由于N2為惰性氣體,性質穩(wěn)定,不會對呼氣裝置有影響,不易與其它物質發(fā)生反應,因此適宜作為SESI-UHRMS檢測呼出氣時的SESI源內的氣體氛圍。

    4?結 論

    本研究結果表明,充入一定流速的純凈氣體,可以增強提高呼出氣中丙酮和吲哚的電離效率; 同時,源內純凈氣體含量增加后,能有效降低源內PA和DA含量,進而降低基質檢出強度。3種純凈氣體氛圍中,以N2對呼出氣中丙酮和吲哚的增強效果以及對基質PA和DA的降低效果,最為顯著。在后續(xù)研究中,還需以有效提高目標物的信噪比、降低基質干擾為目標,更系統(tǒng)、深入地探索氣體氛圍對呼出VOCs的影響機制,如通過加入不同氣體體積比例N2和O2或N2和CO2混合氣體,拓寬流速范圍,以更好地理解氣體氛圍理化性質對電離效率的影響機制,為優(yōu)化SESI源內氣體氛圍、研制SESI商品源、建立SESI-MS呼氣檢測方法提供理論依據。

    References

    1?Sinues P M L, Kohler M, Zenobi R. PloS One, 2013, 8(4): e59909

    2?Sinues P M L, Kohler M, Zenobi R. Anal. Chem., ?2013, ?85(1): 369-373

    3?Bean H D, Zhu J J, Sengle J C, Hill J E. J. Breath. Res., ?2014, ?8(4): 041001

    4?Garcia-Gomez D, Gaisl T, Bregy L, Sinues P M L, Kohler M, Zenobi R. Chem. Commun., ?2016, ?52(55): 8526-8528

    5?Vidal-de-Miguel G, Macia M, Pinacho P, Blanco J. Anal. Chem., ?2012, ?84(20): 8475-8479

    6?Li X, Huang D D, Du R, Zhang Z J, Chan C K, Huang Z X, Zhou Z. J. Vis. Exp., ?2018, ?133: e56465

    7?ZHU Teng-Gao, HAN Jing, SHU Jun-Wen, KE Mu-Fang, WANG Dan, LIU Wen-Jie, LIN Nian-Xiang, CHEN Huan-Wen. Chinese J.Anal.Chem., 2018, 46(3): 400-405

    朱騰高, 韓 京, 舒俊文, 柯牡芳, 王 丹, 劉文杰, 林年香, 陳煥文. 分析化學, 2018, 46(3): 400-405

    8?Bean H D, Zhu J J, Hill J E. J. Vis. Exp., ?2011, ?52: UNSP e2664

    9?Fenn J B, Mann M, Meng C K, Wong S F, Whitehouse C M. Science, ?1989, ?246(4926): 64-71

    10?Wu C, Siems W F, Hill H H. Anal. Chem., ?2000, ?72(2): 396-403

    11?Singh K D, del Miguel G V, Gaugg M T, Ibanez A J, Zenobi R, Kohler M, Frey U, Sinues P M L. J. Breath Res., ?2018, ?12(2): 027113

    12?Gaugg M T, Gomez D G, Barrios-Collado C, Vidal-de-Miguel G, Kohler M, Zenobi R, Sinues P M L. J. Breath Res., ?2016, ?10(1): 016010

    13?Bregy L, Muggler A R, Sinues P M L, Garcia-Gomez D, Suter Y, Belibasakis G N, Kohler M, Schmidlin P R, Zenobi R. Sci. Rep., ?2015, ?5: 15163

    14?Bean H D, Mellors T R, Zhu J J, Hill J E. J. Agric. Food Chem., ?2015, ?63(17): 4386-4392

    15?Li X, Huang L, Zhu H, Zhou Z. Rapid Commun. Mass Spectrom., ?2017, ?31(3): 301-308

    16?Keller B O, Sui J, Young A B, Whittal R M. Anal. Chim. Acta, ?2008, ?627(1): 71-81

    17?https://www.waters.com/webassets/cms/support/docs/bkgrnd_ion_mstr_list.pdf

    18?http://www.newobjective.com/downloads/technotes/PV-3.pdf

    19?Tirzite M, Bukovskis M, Strazda G, Jurka N, Taivans I. J. Breath Res., ?2017, ?11(3): 036009

    20?Fu X A, Li M X, Knipp R J, Nantz M H, Bousamra M. Cancer Med., ?2014, ?3(1): 174-181

    21?Oguma T, Nagaoka T, Kurahashi M, Kobayashi N, Yamamori S, Tsuji C, Takiguchi H, Niimi K, Tomomatsu H, Tomomatsu K, Hayama N, Aoki T, Urano T, Magatani K, Takeda S, Ade T, Asano K.PloS One, ?2017, ?12(4): e0174802

    22?Zhao J, Zhang R Y. Atmos. Environ., ?2004, ?38(14): 2177-2185

    23?Szulejko J E, McMahon T B. J. Am. Chem. Soc., ?1993, ?115(17): 7839-7847

    24?Benoit F M, Harrison A G. J. Am. Chem. Soc., ?1977, ?99(12): 3980-3984

    25?Sinues P M L, de la Mora J F. Int. J. Mass Spectrom., ?2007, ?265(1): 68-72

    26?Wu M X, Wang H Y, Zhang J T, Guo Y L. Anal. Chem., ?2016, ?88(19): 9547-9553

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