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    超高分辨質譜研究離子源內氣體氛圍對電噴霧電離呼出氣的影響

    2019-07-01 10:17:32杜睿張羽玲曾嘉發(fā)方明亮SashoGligorovski周振李雪
    分析化學 2019年6期

    杜睿 張羽玲 曾嘉發(fā) 方明亮 Sasho Gligorovski 周振 李雪

    摘?要?二次電噴霧電離質譜(Secondary electrospray ionization mass spectrometry, SESI-MS)可實時在線檢測人體呼出氣中的揮發(fā)性有機化合物(Volatile organic compounds, VOCs),但呼出氣中VOCs的電離效率會受到源內氣體氛圍的影響。本研究在自制SESI源的基礎上,以超高分辨質譜(Ultra-high resolution mass spectrometer, UHRMS)為分析技術,以人體呼出氣中典型內源性化合物丙酮(Acetone)和吲哚(Indole),以及典型基質鄰苯二甲酸酐(Phthalic anhydride, PA)和鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate,DP)為目標化合物,初步探究了SESI源內不同氣體氛圍(氮氣(N2)、二氧化碳(CO2)、純凈零氣(Zero air))對目標VOCs電離效率的影響。結果表明,在SESI源內通入3種純凈氣體,可有效提高呼出氣中丙酮和吲哚的信號強度和信噪比;同時,由于降低了源內基質含量,可顯著減弱基質干擾。3種純凈氣體中,通入N2后的效果最為顯著。本研究結果可為SESI源設計及參數設置、呼出氣分析方法開發(fā)提供重要依據。

    關鍵詞?呼氣代謝組; 直接質譜分析; 超高分辨質譜; 二次電噴霧電離; 氣體氛圍

    1?引 言

    二次電噴霧電離質譜(Secondary electrospray ionization mass spectrometry,SESI-MS)可實時在線檢測人體呼出氣中揮發(fā)性化學成分(Volatile organic compounds,VOCs)[1],具有無損、實時、無需樣品前處理、高通量等優(yōu)勢,已成功用于人體生物鐘[2]、診斷肺部疾病[3]、檢測人體呼出氣中內源性代謝物(如色氨酸)[4]等生物醫(yī)學研究中。SESI源工作原理為:在常溫常壓環(huán)境中,呼氣中的中性分子被電噴霧產生的初級離子電離生成分子離子[2,5~8](圖1)。SESI技術的雛形,即電噴霧形成帶電微滴電離氣相分子的概念,由Fenn等于1989年首次提出[9]; 2000年,Wu和Hill將這種電離技術命名為SESI[10]。目前,文獻中報道的SESI源,都是自制SESI源,直至2018年才有一款商品化SESI源在展會中出現[11]。SESI源易于自組建,且可與多種商業(yè)質譜接口耦合[12~14]。從質量分析器的角度,以超高分辨質譜(Ultrahigh resolution mass spectrometer,UHRMS)與SESI源結合,優(yōu)勢最顯著。采用UHRMS,根據準確質量數,能提高定性分析的準確性,有效區(qū)分同重素[15]。

    由于自制SESI源不完全封閉,室內空氣會進入源內,與呼出氣中待分析的目標化合物(如丙酮、吲哚)競爭初級ESI電噴霧形成的微液滴上的有限電荷,降低目標物的電離效率及檢出靈敏度; 而且,對于同時存在于呼出氣與室內空氣中的VOCs,也會降低目標化合物的信噪比。在SESI源內通入不含VOCs的純凈氣體,通過降低源內基質濃度,或可解決上述問題。但目前尚沒有SESI源內純凈氣體氛圍對呼出VOCs以及基質的電離效率的影響研究。

    本研究利用自行搭建的SESI源,以呼出氣中典型內源性代謝物丙酮(Acetone)[2,13]和吲哚(Indole)[12],以及室內空氣中典型VOCs鄰苯二甲酸酐(Phthalic anhydride,PA)[16,17]和鄰苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate,DP)[18]為目標化合物,以UHRMS為檢測手段,探究源內不同純凈氣體氛圍(氮氣(N2)、二氧化碳(CO2)、純凈零級空氣(Zero air,包含: 79% N2,21% O2,< 1 part per million by volume(ppmv)烷烴類物質))對SESI源電離不同來源VOCs的影響,為優(yōu)化離子源設計及參數設置、提高呼出氣中VOCs檢測信噪比提供了依據。

    2?實驗部分

    2.1?儀器與試劑

    QExactiveTM四極桿組合靜電場軌道阱傅里葉變換超高分辨質譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司); 自制SESI源是將nanoESI商品源與自制質譜接口組合而成(圖2): nanoESI源(美國Thermo Fisher Scientific公司),自制質譜接口[6](廣州禾信儀器股份有限公司定制),包括一個離子化反應腔和兩個進樣管(圖2A),均為不銹鋼材質,目的在于減少呼出VOCs的吸附,同時,進樣管與腔體為可拆卸設計,便于定期清理; Milli-Q Integral 5超純水儀(密理博中國有限公司); AJH-3080A零氣發(fā)生器(北京安捷華科技有限公司)。

    標準校正液(美國Thermo Fisher Scientific公司); 甲醇(色譜級,純度99.9%,美國默克公司)。N2標準氣體(純度 ≥ 99.999%,佛山市佛鋼氣體有限公司); CO2標準氣體(純度99.99%,廣州市粵佳氣體有限公司)。醫(yī)療呼吸氣體干燥(Nafion)管(內徑1.32 mm,長度60 cm,ME 60系列,美國博純有限責任公司); 特氟龍(PTFE)管(內徑4 mm,上海畢帝塑料公司); 聚氨酯(Polyurethane,PU)管(內徑2 mm, 上海畢帝塑料公司)。1 mL移液槍頭(德國Eppendorf公司)。質量流量控制器(量程0~1 L/min,韓國Line Tech公司); Lzb-3微型玻璃轉子流量計(量程0~0.6 L/min,浙江余姚工業(yè)自動化儀表廠)。

    2.2?樣品分析

    2.2.1?樣品采集?人體呼出氣采樣流程參見文獻[6],即志愿者(2名,25歲和29歲,女性)通過鼻吸、嘴呼的方式提供呼出氣樣品。采樣前,志愿者用純水漱口,并在實驗室內靜坐30 min[2]。采集呼氣時,志愿者先深呼吸3次,再采集全呼氣[18~20],一次性呼氣吹嘴由1 mL移液槍頭改制而成。樣品傳輸管路包括: Nafion管、PTFE管和Lzb-3微型玻璃轉子流量計。Nafion管用于去除呼出氣中的水汽,避免水汽冷凝在PTFE管內壁、吸附VOCs[6]; PTFE管可減少VOCs吸附損失; Lzb-3微型玻璃轉子流量計用于控制呼出氣流速。還需說明的是,ID 1.32 mm的Nafion管所允許的最大氣體流量為0.4 L/min,所以單次采樣時,呼氣流速控制為0.4 L/min。每個實驗條件下,每位志愿者重復呼氣5~6次。

    2.2.2?SESI-UHRMS分析?SESI-UHRMS實時在線檢測呼出氣裝置如圖2B所示。SESI源有兩個進樣口: 呼出氣樣品的進樣口和純凈氣體的進樣口(未通入純凈氣體時,源內為室內空氣)(圖2A)。ESI溶劑為超純水(電阻率18.2 MΩ·cm),流速200 nL/min。 ESI電壓為+2.5 kV(正離子檢測模式)/2.5 kV(負離子檢測模式),質譜接口離子傳輸管溫度為150℃。檢測模式: 正負離子切換掃描(切換時間0.01 s); 全掃描,質量數范圍m/z 50~300,質譜質量分辨率為140000 FWHM(m/z 200)。

    2.3?數據處理

    通過軟件Xcalibur 3.0確定目標化合物以及質量偏差。通過軟件Origin 9.0中“Statistics”功能的“Descriptive Statistics”,“Normality Test”判斷原始數據是否服從正態(tài)分布; 并通過“Homogeneity of Variance Test”,“Levene's Test”進行方差齊性分析,用One-way ANOVA方法,進行差異性分析,通過均值比較(Means comparision)中的多重比較方法(Tukey's multiple means comparison test)進行組內差異性對比分析。

    3?結果與討論

    3.1?定性分析

    以N2氛圍下SESI-UHRMS實時在線檢測人體呼出氣的結果為例,志愿者呼出氣一級質譜圖(背景已扣除)如圖3所示。

    根據目標化合物的分子結構特征和質子親和力[22~24],結合SESI源電離機理[15,25,26],可知丙酮[2,13]、吲哚[12]、PA[16,17]和DP[18]均會形成質子化分子離子[M + H]+。在志愿者呼氣樣品實時監(jiān)測過程中,在m/z 59.0499、118.0651、149.0230和279.1582處分別檢測到質譜峰,元素組成鑒別為[C3H7O]+、[C8H8N]+、[C8H5O3]+和[C16H23O4]+,質量偏差(實測值與理論值的差值)為0.8、0.0、0.3和0.9 mDa,可確定上述質譜峰即為呼出氣中丙酮、吲哚及室內空氣中PA和DP的質子化分子離子(圖4)。

    3.2?SESI源內氣體氛圍對呼出VOCs的影響

    本研究選擇N2、CO2、Zero air作為考察的純凈氣體,主要基于如下原因: (1)3種氣體理化性質相對穩(wěn)定,且都是呼出氣中的成分(按體積比計算,呼出氣包含: 78.14% N2,13.6%~16% O2,4.0%~5.3% CO2,5% 水汽,1 ppmv VOCs,1 ppmv氨氣); (2)不易爆炸,相對安全; (3)是實驗室常用標準氣體,易于獲取。

    當源內氣體氛圍為N2,充入流速分別為0.1和0.8 L/min時,丙酮檢出強度增加約9倍, 信噪比(S/N)提高約2倍(表1),吲哚信號強度增加約6倍(表1)。值得注意的是,對比SESI源內未通入N2與N2通入流速為0.1 L/min時呼出氣的檢測結果,發(fā)現丙酮信號沒有顯著差別,而吲哚的信號增強約2倍,且信號重現性(RSD)得到改善,RSD由55%減小為10%。

    與N2結果相似(表1,圖5),CO2氛圍下,當充入流速為0.8 L/min時,相比于0.1 L/min,丙酮和吲哚的信號強度分別提高約1倍和4倍; 對于Zero air,當充入流速為0.8 L/min 時,相比于0.1 L/min,丙酮和吲哚的信號強度分別提高約11倍和9倍。對比未通入CO2、Zero air與0.1 L/min 的CO2、Zero air氛圍下呼出氣的檢測結果,發(fā)現丙酮和吲哚的信號均沒有顯著差別,且在這兩種氛圍氣體下,呼出氣中吲哚信號的重現性未得到顯著改善。

    綜上,當以0.8 L/min的流速向源內充入N2、CO2和Zero air時,呼出氣中吲哚及丙酮的檢出強度均明顯提高(圖5)。

    在純凈氣體充入流速均為0.8 L/min的條件下,對呼出氣中丙酮及吲哚的檢出信號強度進行正態(tài)分布檢驗及方差齊性檢驗,結果滿足單因素方差分析(ANOVA analysis)的條件。ANOVA結果(圖6)表明,當顯著性水平為0.05時,丙酮(Prob>F: 1.0 ×10?8; F Value 89.8)及吲哚(Prob>F: 3.7 ×10?5; F Value 23.1)在N2、CO2、Zero air氣體氛圍下的檢出強度均存在顯著性差異。丙酮在Zero air 氛圍下的強度均值略高于N2氛圍下的結果,CO2氛圍下最低; 吲哚在N2氛圍下的信號強度高于Zero air和CO2氛圍下的結果。進一步對比3種純凈氣體氛圍兩兩之間的差異性,多重比較分析結果(圖7)表明,在顯著性水平為0.05時,呼出氣中丙酮的信號在N2與CO2之間(Prob: 2.4 ×10?6,Sig=1)、CO2與Zero air之間(Prob: 0,Sig=1)及N2和Zero air之間(Prob: 3.3 ×10?4,Sig=1)均存在顯著性差異; 呼出氣中吲哚的信號在N2與CO2之間(Prob: 2.9 ×10?5,Sig=1)、N2和Zero air之間(Prob: 0.002,Sig=1)均存在顯著性差異,而在CO2與Zero air之間(Prob: 0.1,Sig=0)不存在顯著差異。呼出氣中丙酮及吲哚的信號在N2和Zero air之間的差異顯著性均最小,推測主要是由于Zero air的主要成分為N2(79%)。綜上,為提高SESI-MS檢測呼氣中內源性VOCs的靈敏度,可在自制SESI源中通入N2。

    3.3?SESI源內氣體氛圍對基質的影響

    分析SESI源內氣體氛圍對基質的影響,結果表明,以N2氛圍為例,當通入氣體流速分別為0.1和0.8 L/min時,即當充入N2流速提高8倍時,PA和DP的信號強度分別減少約0.6和0.1倍(表2)。此結果與3.2節(jié)中呼出氣中VOCs的檢出情況相反,推測可能是SESI源內純凈氣體含量增加后,基質在源內含量降低,進而檢出強度降低。此外,N2通入流速為0.1 L/min時的結果與未通入N2的結果沒有顯著差別,表明此時源內N2含量還無法影響信號檢出效果,此結論與呼出氣中丙酮的檢出結果一致(表1和表2)。

    氣體氛圍為CO2和Zero air時,趨勢與N2相似(表2,圖8),當充入氣體流速為0.8 L/min時,相比于0.1 L/min氣體流速,PA和DP的信號強度分別減少約0.5和0.1倍。

    值得注意的是,當實時檢測呼氣時,PA和DP信號強度,在N2、CO2氣體氛圍中,呈降低趨勢,而在Zero air氛圍中出現進樣峰,本研究組將會在后續(xù)工作中進一步探究這一現象。

    8; F Value 69.6)在3種氣體氛圍下檢出信號穩(wěn)定,且檢出強度均存在顯著性差異; 并且,在N2氛圍下PA和DP的信號強度均低于Zero air和CO2氛圍下的結果,說明N2氛圍對降低背景基質干擾的影響最大。

    進一步對比0.8 L/min流速下3種純凈氣體氛圍兩兩之間的差異性,結果(圖10)表明,8,Sig=1)CO2與Zero air之間(Prob: 4.6 ×10?6, Sig=1)也均存在顯著性差異。Zero air是造成PA及DP信號強度差異顯著的主要原因。上述結果說明,N2氛圍對于降低基質PA及DP干擾的效果最好,而Zero air氛圍最差。

    綜上,自制SESI源內通入足夠量的純凈N2,可以顯著增強呼出氣中丙酮及吲哚的信號強度,同時顯著降低基質信號強度。此外,由于N2為惰性氣體,性質穩(wěn)定,不會對呼氣裝置有影響,不易與其它物質發(fā)生反應,因此適宜作為SESI-UHRMS檢測呼出氣時的SESI源內的氣體氛圍。

    4?結 論

    本研究結果表明,充入一定流速的純凈氣體,可以增強提高呼出氣中丙酮和吲哚的電離效率; 同時,源內純凈氣體含量增加后,能有效降低源內PA和DA含量,進而降低基質檢出強度。3種純凈氣體氛圍中,以N2對呼出氣中丙酮和吲哚的增強效果以及對基質PA和DA的降低效果,最為顯著。在后續(xù)研究中,還需以有效提高目標物的信噪比、降低基質干擾為目標,更系統(tǒng)、深入地探索氣體氛圍對呼出VOCs的影響機制,如通過加入不同氣體體積比例N2和O2或N2和CO2混合氣體,拓寬流速范圍,以更好地理解氣體氛圍理化性質對電離效率的影響機制,為優(yōu)化SESI源內氣體氛圍、研制SESI商品源、建立SESI-MS呼氣檢測方法提供理論依據。

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