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    基于基因芯片的熒光分析方法在甲狀腺乳頭狀癌相關BRAFV600E突變高靈敏及特異性檢測中的應用

    2019-07-01 10:17魏佳高嘉雪王瑤琪王振新孟憲瑛
    分析化學 2019年6期

    魏佳 高嘉雪 王瑤琪 王振新 孟憲瑛

    摘?要?研發(fā)了一種基于DNA芯片(DNA microarray)的熒光分析方法, 并將其用于檢測甲狀腺乳頭癌相關的BRAFV600突變。本方法采用三鏈雜交體系, 首先將單鏈DNA(ssDNA)捕獲探針固定在微陣列芯片基底上,制備DNA芯片;以其為反應平臺, 加入ssDNA目標物與ssDNA捕獲探針進行雜交;最后加入熒光分子Cy5的修飾ssDNA標記ssDNA目標物, 檢測熒光信號。在優(yōu)化的實驗條件下, 本方法對BRAFV600E突變型ssDNA目標物的檢測靈敏度達到亞納摩爾級(0.25 nmol/L), 且具有3個數(shù)量級的線性范圍, 并能夠從突變型ssDNA目標物和野生型ssDNA目標物的混合物中區(qū)分出低至0.1%的BRAFV600E突變型ssDNA目標物。利用本方法對15例臨床甲狀腺組織樣本的BRAFV600E突變水平進行了分析, 實驗結(jié)果與常規(guī)Sanger測序法檢測結(jié)果一致, 表明本方法具有良好的實用性。

    關鍵詞?甲狀腺乳頭狀癌; BRAFV600E突變; DNA芯片

    1?引 言

    BRAF基因(B-Rapidly accelerated fibrosarcoma proto-oncogene)在黑色素瘤、甲狀腺癌等多種人類癌癥中均具有發(fā)生突變的傾向, 被認為是相關癌癥的主要治療靶點[1~4]。自第一個致癌的BRAF突變在21世紀初被證實后, 科研究人員又相繼發(fā)現(xiàn)多種過度活化的BRAF致癌突變(包括BRAFV600E、BRAFV600A和BRAFV600G)[5,6]。其中, BRAFV600E突變(纈氨酸(V)單位點突變?yōu)楣劝彼幔‥))占BRAF致癌突變的90%。研究表明, BRAFV600E選擇性抑制劑療法可有效延長BRAFV600E突變患者的總生存期[1,2]。

    由于BRAFV600E突變在各種癌癥中廣泛存在, 對BRAFV600E突變水平的高靈敏度和高選擇性分析對于腫瘤患者的診斷、治療和預后具有重要意義[3~5]。 Sanger測序[6]、微陣列芯片[7]、結(jié)合等位基因特異性聚合酶鏈反應的熔融曲線分析[8,9]、免疫組化[10,11]和光學生物傳感器[12,13]等技術均能實現(xiàn)BRAF突變的定性與定量分析[14~18]。其中, 微陣列芯片僅需使用極少的樣品量即可獲得高通量的全基因組突變或單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism, SNP)分析結(jié)果, 且一張微陣列芯片可同時分析多個樣本, 極大地節(jié)省了實驗時間和成本。例如, 科研人員使用微陣列芯片從黑色素瘤樣本中成功區(qū)分出BRAF突變型和野生型樣本[7,17,18]。然而, 由于缺乏靈敏度和選擇性, 利用微陣列芯片檢測手術切除或活體檢查的癌組織樣本中較低等位基因頻率(<5%)的BRAFV600E突變卻少有報道。近三十多年, 中國甲狀腺癌的發(fā)病率不斷增加, 其中, 甲狀腺乳頭狀癌(Papillary thyroid cancer, PTC)占甲狀腺癌病例的85%以上[19], 且在25%~45%的甲狀腺癌患者中存在BRAF突變[20,21]。另外, BRAFV600E突變是PTC的惡性程度和預后重要指標, 即BRAFV600E突變?yōu)殛栃耘c患者死亡密切相關[22]。

    本研究通過改變ssDNA捕獲探針上突變位點的位置, 對不同BRAFV600E的突變位點進行了優(yōu)化。同時, 結(jié)合不對稱聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction, PCR)擴增策略, 制備了具有高選擇性和高靈敏度的DNA微陣列芯片(簡稱DNA芯片, DNA microarray), 用于檢測BRAFV600E突變, 并成功用于檢測通過手術切除的PTC組織樣本中BRAFV600E的突變水平。

    2?實驗部分

    2.1?儀器與試劑

    晶芯SmartArrayer 136微陣列芯片點樣系統(tǒng)、晶芯LuxScan 10K微陣列芯片掃描儀、高分子三維基片D、聚四氟乙烯網(wǎng)格圍欄(北京博奧生物有限公司); TC-5000梯度PCR儀(英國Techne公司); 5415R型高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司); HPC-250CL恒溫恒濕箱(上海申賢恒溫設備廠)。

    實驗中所使用的單鏈寡核苷酸(ssDNA)序列(上海生工生物工程股份有限公司合成)如表1所示; 組織基因組DNA提取試劑盒、多功能DNA純化及回收試劑盒(百泰克公司); 十二烷基硫酸鈉、檸檬酸鈉緩沖液、甲醛溶液(阿拉丁公司); OneTaq熱啟動DNA聚合酶2×預混液(美國NEB公司)。其它化合物均為分析純, 購于北京化工廠。實驗用水為Milli-Q(美國Millipore公司)制備的超純水(18.2 MΩ cm)。

    2.2?臨床組織樣品的制備

    甲狀腺組織標本取自吉林大學第一醫(yī)院甲狀腺外科行甲狀腺手術的PTC患者, 已征得患者同意。采用組織基因組DNA提取試劑盒提取樣本DNA, 并作為不對稱重疊擴增PCR實驗的模板, 通過兩個獨立的PCR步驟擴增基因組DNA。具體操作如下:將10 μL oneTaq熱啟動DNA聚合酶2×預混液、1 μL F1、1 μL R1、1 μL模板DNA混合, 加水至20 μL, 在TC-5000擴增儀上進行兩步擴增, 擴增條件為94℃預變性3 min后進行30個循環(huán)(94℃解鏈30 s, 47℃退火20 s, 68℃引物延伸20 s), 68℃延伸5 min, 迅速降溫至4℃; 將此雙鏈的反應產(chǎn)物作為第二步PCR的模板, 擴增出單鏈的ssDNA, 將25 μL oneTaq熱啟動DNA聚合酶2×預混液、2.5 μL F1、2.5 μL模板(此模板中包含第一步反應中剩余的少許部分R1)混合, 加水至50 μL, 反應步驟與第一步相同。經(jīng)過第二步不對稱PCR后, 采用多功能DNA純化及回收試劑盒對獲得的粗品進行純化。用雜交緩沖液稀釋純化后所得產(chǎn)物, 直接進行SNP分析。

    2.3?DNA芯片的制備

    本實驗中共設計了12種針對BRAFV600E不同突變位點的氨基修飾的ssDNA捕獲探針(Probe 1E、3E、5E、7E、9E、1W、3W、5W、7W、9W、7A、7G, 如表1所示), 將不同濃度的ssDNA捕獲探針溶解于點樣緩沖液中(3×SSC、0.1% (w/V) SDS和1.5 mol/L甜菜堿), 采用接觸法在醛基修飾的三維高分子D基片上進行點樣。點樣后將微陣列芯片置于溫度為37℃, 濕度為75%的恒溫恒濕箱中孵育12 h, 再依次用清洗緩沖液(1×SSC, 0.01% (w/V) SDS, 30 mL)和水各清洗3次。隨后將微陣列芯片置于含0.1 mol/L乙醇胺的PBS(pH 7.5, 50 mmol/L PB, 0.15 mol/L NaCl)中,在30℃下孵育1 h, 以封閉芯片表面未反應的醛基。最后, 用PBS和水各洗滌3次, 離心(480 r/min, 1 min)甩干, 并用聚四氟乙烯圍欄將所制備的微陣列芯片分成12個獨立的子陣列, 得到DNA芯片。

    2.4?BRAFV600E突變DNA的檢測

    將模擬樣本(合成的4種ssDNA目標物(Target E、W、G、A)及其混合物)和純化后的不對稱PCR產(chǎn)物分別溶解在雜交緩沖液(3×SSC, 0.1% (w/V) SDS)中, 將30 μL上述溶液分別加入到每個子陣列中, 44℃下雜交2 h, 按照以下步驟進行清洗:30 mL雜交緩沖液37℃下清洗3次, 5 min/次, 30 mL清洗緩沖液25℃下清洗3次, 5 min/次, 30 mL水4 ℃下清洗3次, 3 min/次, 離心甩干后, 再向每個子陣列中加入30 μL 200 nmol/L溶解在標記緩沖液(1×SSC, 0.1%(w/V)SDS)中的Cy5修飾的標記ssDNA(Label), 并在30℃孵育1 h, 按照如上所述的步驟洗滌和干燥后, 使用芯片掃描儀提取陣列點的熒光信號值。相對熒光信號強度(F)定義如下:F=Fsample/Fblank, 其中Fsample為樣品的熒光信號強度, Fblank為空白樣品的熒光信號強度, 采用不含ssDNA目標物的雜交緩沖液作為空白樣品。熒光信號的平均值和標準偏差均由6個重復信號點的信號值計算得到。

    3?結(jié)果與討論

    3.1?DNA芯片反應條件的優(yōu)化

    構(gòu)建的DNA芯片熒光檢測方法的原理如圖1所示。氨基修飾的ssDNA捕獲探針通過席夫堿反應固定于醛基修飾的芯片基底; 一部分ssDNA目標物與ssDNA捕獲探針進行雜交, 另一部分與Cy5標記的ssDNA完成雜交, 以獲得熒光檢測信號。Cy5具有較好的光穩(wěn)定性和較高的量子產(chǎn)率(0.28), 有助于提高檢測靈敏度。

    首先考察了ssDNA捕獲探針突變位點位置對ssDNA目標物雜交效率和選擇性的影響。ssDNA捕獲探針包含25個核苷酸, 包括間隔區(qū)(T10)和與相應的ssDNA目標物雜交的ssDNA片段。BRAFV600E突變位點位于捕獲探針5'末端開始的的第1、3、5、7、9位。其中, 捕獲探針Probe 1E、3E、5E、7E或9E與BRAFV600E突變型ssDNA目標物Target E完全互補, 而捕獲探針Probe 1W、3W、5W、7W或9W與野生型ssDNA目標物Target W完全互補。如圖2所示, ssDNA捕獲探針上突變位點的位置對ssDNA目標物雜交效率和選擇性有極大影響。除了Probe 5E和5W, 隨著BRAFV600E突變位點距探針5'末端距離的增大, 與之雜交的ssDNA目標物5'端游離出的ssDNA片段隨之增加, 空間位阻增大, 從而使雜交效率降低, F逐漸降低。然而, 完全互補雙鏈DNA(dsDNA)與單堿基錯配dsDNA的F比值卻不斷增加, 即檢測的靈敏度降低而選擇性變好。dsDNA的熔點溫度與其序列密切相關, 相對于其它dsDNA, 突變位點位于位置5的dsDNA熔點溫度較低。該現(xiàn)象導致在相同的雜交溫度下, Probe 5E和Probe 5W與相應的ssDNA目標物雜交效率較低, 檢測信號較弱。綜合考慮檢測靈敏度和選擇性, 在后續(xù)實驗中使用突變位點位于位置7的捕獲探針(Probe 7E和Probe 7W)檢測ssDNA目標物。

    由于每個dsDNA都具有其特定的熔點溫度, 因此, 雜交效率會受到雜交溫度的影響。過低的雜交溫度不能完全消除DNA目標物的二級結(jié)構(gòu), 而過高的雜交溫度可能導致dsDNA的雙螺旋解旋。 如圖3所示, F受雜交溫度影響很大。在44℃雜交溫度下, 完全互補dsDNA的F最大, 表現(xiàn)出較高的雜交效率。因此, 選擇44℃為最佳雜交溫度。

    3.2?模擬樣本中BRAFV600E突變的檢測

    為了考察該DNA芯片對BRAFV600E突變檢測的選擇性, 將4種ssDNA目標物(包含1種野生型Target W和3種突變型Target E、G和A)分別與4種ssDNA捕獲探針修飾的芯片共同孵育。通過雜交形成4個完全互補的dsDNA和12個單堿基錯配的dsDNA。4個完全互補的dsDNA分別代表野生型BRAFV600(wild-type)、具有A等位基因的BRAFV600(BRAFV600E突變)、具有C等位基因的BRAFV600(BRAFV600A突變)和具有G等位基因的BRAFV600(BRAFV600G突變)基因組DNA。如圖4所示, 完全互補的dsDNA均表現(xiàn)出較強的熒光信號。其中, 具有BRAFV600E突變的完全互補dsDNA的熒光信號比其它對應單堿基錯配dsDNA的熒光信號高13倍以上(圖4A)。以上結(jié)果表明, 構(gòu)建的基于DNA芯片熒光檢測方法具有良好的選擇性,

    增加而線性增大, 檢出限(3σ)為0.25 nmol/L。與其它SNP檢測方法(如電化學生物傳感器[23]、表面聲波生物傳感器[24]、微懸臂生物傳感器[25]等)相比, 本方法具有較低的檢出限, 能夠滿足臨床實際樣品的檢測需求。等位基因頻率的定量分析在疾病診斷方面具有重要意義, 本研究在保持模擬樣本中ssDNA目標物總量不變的條件下, 改變Target E和Target W的比例, 考察本方法對等位基因頻率的測定能力。如圖6所示, 對于總量為3 pmol的混合ssDNA目標物, 最低可檢出豐度為0.1%的Target E(F大于空白樣品σ), 優(yōu)于文獻[8]報道的方法。以上結(jié)果表明, 基于DNA芯片的熒光分析方法可用于靈敏、特異地分析復雜樣品中的BRAFV600E突變。

    3.3?實際樣本中BRAFV600E突變的檢測

    為了考察本方法的實用性, 對4名良性甲狀腺結(jié)節(jié)(BTN)患者和11名PTC患者臨床樣本甲狀腺組織中的BRAFV600E突變水平進行了分析。在優(yōu)化實驗條件下, 對組織提取的基因組DNA的不對稱PCR產(chǎn)物進行了檢測。與100 ng/mL不對稱PCR產(chǎn)物雜交, 并使用Label標記后, 通過計算Probe 7E陣列點的平均熒光信號強度與Probe 7W陣列點的平均熒光信號強度的比值表示BRAFV600E突變水平。如圖7所示, 約50%的PTC組織表現(xiàn)出較高的BRAFV600E突變等位基因頻率水平(>20%), 而BTN組織則表現(xiàn)出相對較低的BRAFV600E突變的等位基因頻率水平(<15%)。此實驗結(jié)果與商業(yè)化Sanger測序法的檢測結(jié)果高度一致(約80%)。此外, 本方法可檢測低至100 ng/mL的PCR產(chǎn)物, 遠低于Sanger測序法的檢出限(20 μg/mL)。

    4?結(jié) 論

    建立了基于DNA芯片的熒光分析方法, 通過優(yōu)化DNA捕獲探針的序列和雜交溫度, 選擇性地檢測BRAFV600E突變。在最佳實驗條件下, 本方法能夠區(qū)分野生型BRAFV600和3種BRAFV600突變, 且對BRAFV600E突變等位基因的檢出頻率低至0.1%。此外, 本方法對15名臨床患者甲狀腺組織樣本中BRAFV600E突變水平的檢測結(jié)果與商業(yè)化Sanger測序法檢測結(jié)果相當。結(jié)合不對稱PCR擴增策略, 本方法在檢測不同臨床樣品中的BRAFV600E突變方面具有很大的潛力, 為甲狀腺癌的治療或預后提供了一種新方法。

    References

    1?Grasso M, Estrada M A, Ventocilla C, Samanta M, Maksimoska J, Villanueva J, Winkler J D, Marmorstein R. ACS Chem. Biol., 2016, 11(10): 2876-2888

    2?Agianian B, Gavathiotis E. J. Med. Chem., ?2018, ?61(14): 5775-5793

    3?Karoulia Z, Gavathiotis E, Poulikakos P I. Nat. Rev. Cancer, ?2017, ?17(11): 676-691

    4?Davies H, Bignell G R, Cox C, Stephens P, Edkins S, Clegg S, Teague J, Woffendin H, Garnett M J, Bottomley W, Davis N, Dicks E, Ewing R, Floyd Y, Gray K, Hall S, Hawes R, Hughes J, Kosmidou V, Menzies A, Mould C, Parker A, Stevens C, Watt S, Hooper S, Wilson R, Jayatilake H, Gusterson B A, Cooper C, Shipley J, Hargrave D, Pritchard-Jones K, Maitland N, Chenevix-Trench G, Riggins G J, Bigner D D, Palmieri G, Cossu A, Flanagan A, Nicholson A, Ho J W, Leung S Y, Yuen S T, Weber B L, Seigler H F, Darrow T L, Paterson H, Marais R, Marshall C J, Wooster R, Stratton M R, Futreal P A. Nature, ?2002, ?417(6892): 949-954

    5?Chen H C, Sierra J, Yu L J, Cerchio R, Wall B A, Goydos J, Chen S. Oncotarget, ?2018, ?9(5): 5861-5875

    6?Lang A H, Drexel H, Geller-Rhomberg S, Stark N, Winder T, Geiger K, Muendlein A. ?J. Mol. Diagn., ?2011, ?13(1): 23-28

    7?Weyant G W, Wisotzkey J D, Benko F A, Donaldson K J. J. Mol. Diagn., ?2014, ?16(5): 481-485

    8?Miotke L, Lau B T, Rumma R T, Ji H P. Anal. Chem., ?2014, ?86(5): 2618-2624

    9?Hatae R, Hata N, Yoshimoto K, Kuga D, Akagi Y, Murata H, Suzuki S O, Mizoguchi M, Iihara K. PloS One, ?2016, ?11(8): e0160489

    10?Tu M, Chia D, Wei F, Wong D. Analyst, ?2016, ?141(2): 393-402

    11?Chen D, Qi W, Zhang P, Zhang Y, Liu Y, Guan H, Wang L. Pathology, ?2018, ?214(2): 303-307

    12?Huber F, Lang H P, Glatz K, Rimoldi D, Meyer E, Gerber C. Nano Lett., ?2016, ?16(9): 5373-5377

    13?Li P, He H, Wang Z, Feng M, Jin H, Wu Y, Zhang L, Zhang L, Tang X. Anal. Chem., ?2016, ?88(1): 883-889

    14?Du Y, Pothukuchy A, Gollihar J D, Nourani A, Li B, Ellington A D. Angew. Chem., ?2017, ?56(4): 992-996

    15?Wang Y, Tian K, Shi R, Gu A, Pennella M, Alberts L, Gates K S, Li G, Fan H, Wang M X, Gu L Q. ACS Sens., ?2017, ?2(7): 975-981

    16?Wu T, Chen W, Yang Z, Tan H, Wang J, Xiao X, Li M, Zhao M. Nucleic Acids Res., ?2018, ?46(4): e24

    17?Mukherjee S,Sathanoori M, Ma Z, Andreatta M, Lennon P A, Wheeler S R, Prescott J L, Coldren C, Casey T, Rietz H, Fasig K, Woodford R, Hartley T, Spence D, Donnelan W, Berdeja J, Flinn I, Kozyr N, Bouzyk M, Correll M, Ho H, Kravtsov V, Tunnel D, Chandra P. Cancer Genet., ?2017, ?216-217: 1281-1241

    18?Kim I J, Kang H C, Jang S G, Ahn S A, Yoon H J, Park J G. J. Mol. Diagn., ?2007, ?9(1): 55-63

    19?DONG Fen, ZHANG Biao, SHAN Guang-Liang. China Oncol., ?2016, ?26(1): 47-52

    董 芬, 張 彪, 單廣良. 中國癌癥雜志, ?2016, ?26(01): 47-52

    20?Kurtulmus N, Ertas B, Saglican Y, Kaya H, Ince U, Duren M. Eur. Thyroid J., ?2016, ?5(3): 195-200

    21?Lubitz C C, Zhan T, Gunda V, Amin S, Gigliotti B J, Fingeret A L, Holm T M, Wachtel H, Sadow P M, Wirth L J, Sullivan R J, Panka D J, Parangi S. Thyroid, ?2018, ?28(3): 328-339

    22?Xing M, Alzahrani A S, Carson K A, Viola D, Elisei R, Bendlova B, Yip L, Mian C, Vianello F, Tuttle R M, Robenshtok E, Fagin J A, Puxeddu E, Fugazzola L, Czarniecka A, Jarzab B, O'Neill C J, Sywak M S, Lam A K, Riesco-Eizaguirre G, Santisteban P, Nakayama H, Tufano R P, Pai SI, Zeiger M A, Westra W H, Clark D P, Clifton-Bligh R, Sidransky D, Ladenson P W, Sykorova V. JAMA-J. Am. Med. Assoc., ?2013, ?309(14): 1493-1501

    23?Wang Z, Zhang J, Yin Z, Wu S, Mandler D, Zhang H. Nanoscale, ?2012, ?4(8): 2728-2733

    24?Liu X, Wang J Y, Mao X B, Ning Y, Zhang G J. Anal. Chem., ?2015, ?87(18): 9352-9359

    25?Koirala D, Yu Z, Dhakal S, Mao H. J. Am. Chem. Soc., ?2011, ?133(26): 9988-9991

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