海洋酸化影響重金屬Cd對石莼的生理學(xué)毒性

江瑩瑩， 金 鵬， 曾曉鵬， 衛(wèi)燕云， 夏建榮

(廣州大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510006)

工業(yè)革命開始以來，全球大氣CO2濃度一直處于上升之中，據(jù)預(yù)測，到21世紀(jì)末 pCO2將達(dá)到 1 000×10-6[1].大氣 CO2濃度升高，使 CO2在海水中溶解量增加，海水 pH 下降，導(dǎo)致海洋酸化，到 2100 年 pH 值將降低 0.3～0.4[2].大型海藻作為海洋重要的初級生產(chǎn)力，和高等植物一樣，利用核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/氧化酶(Rubisco)催化固定 CO2.面對大氣中 CO2濃度的升高，藻類對此的響應(yīng)具有種類差異性和特異性，這可能與它們的無機(jī)碳利用機(jī)制有關(guān).例如，大氣CO2濃度的升高有利于馬尾藻(Sargassummuticum)[3]和滸苔(Ulvaprolifera)[4]的生長；而硬石莼(Ulvarigida)的生長和光合作用則不受影響[5]；也有研究表明，CO2濃度的升高降低了江蘺(Gracilariatenuistipitata)的光合速率和色素含量[6]，抑制了黑藻(Eckloniastolonifera)的生長[7].

海洋重金屬污染也日益嚴(yán)重，在部分重金屬污染的區(qū)域，如鎘污染區(qū)域，Cd2+濃度可達(dá)到 16 mg/L[8].海洋鎘污染的出現(xiàn)已經(jīng)對海洋藻類構(gòu)成嚴(yán)重威脅[9-11].鎘對藻類的毒性作用機(jī)制主要涉及其與含羥基、氨基、巰基的蛋白質(zhì)分子結(jié)合，影響酶的功能，導(dǎo)致生長受到抑制[12].同時(shí)鎘與鋅蛋白酶會(huì)發(fā)生親合反應(yīng)，置換出鋅，干擾碳酸酐酶的活性和生理功能，從而可能影響無機(jī)碳的獲取[13-14].在大型藻類的研究中，CO2濃度升高情況下，pH降低會(huì)增加金屬的溶解度，可能導(dǎo)致沉積物和有機(jī)配體中金屬的解吸，增加海水中重金屬離子的含量[15-16]，從而影響重金屬的毒性，如高濃度 CO2(1 400×10-6)加劇了 Cu 對滸苔的毒性[17]，但海洋酸化又能夠緩解 Cd2+對壇紫菜(Pyropiahaitanensis)的毒性[18]，可見海洋酸化導(dǎo)致重金屬毒性變化在不同海藻中存在明顯差異.石莼是我國沿海常見的大型海藻，具有分布廣、生長快等特點(diǎn)，但在面臨重金屬鎘污染和海洋酸化的環(huán)境時(shí)，它們?nèi)绾雾憫?yīng)還鮮有報(bào)道.本研究利用石莼作為實(shí)驗(yàn)材料，通過在不同 CO2濃度(390×10-6和 1 000×10-6)和 Cd2+濃度(0 mmol/L、0.05 mmol/L和 0.1 mmol/L)下培養(yǎng)，測定相對生長速率、凈光合速率、暗呼吸速率、色素含量、葉綠素?zé)晒鈪?shù)以及胞外碳酸酐酶活性等指標(biāo)，評估 CO2濃度升高和不同 Cd2+水平對石莼的生理學(xué)影響，為預(yù)測大氣 CO2濃度升高導(dǎo)致的海洋酸化可能對重金屬毒性的影響提供理論基礎(chǔ).

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

經(jīng)過 4 d暫養(yǎng)后，將生長狀態(tài)良好的石莼剪成質(zhì)量約為 0.1 g(Fw)的矩形葉片置于 2 L 聚碳酸酯(PC)瓶中.PC 瓶中 f/2 加富的人工海水預(yù)先分別通過 CO2加富器(CE100D，武漢瑞華儀器設(shè)備有限責(zé)任公司，中國)通入 390×10-6和 1 000×10-6CO2空氣 24 h，使其 pH 分別穩(wěn)定在約8.20±0.05和7.80±0.05.實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩組 CO2濃度，分別通入正常空氣 390×10-6(Air)和含 1 000×10-6CO2空氣(+CO2)，通氣速率保持在 0.4 L/min.三個(gè) Cd2+濃度梯度分別為 0 mmol/L(對照組， Control)、0.05 mmol/L(中等鎘濃度，MCd)和 0.10 mmol/L(高鎘濃度，HCd).溫度和光強(qiáng)控制條件與暫養(yǎng)相同，每個(gè)培養(yǎng)條件設(shè)置三個(gè)平行樣.培養(yǎng)期間每 48 h 更換一次人工海水，持續(xù)通入 390×10-6和 1 000×10-6CO2空氣以維持 pH，培養(yǎng) 7 d后用于以下實(shí)驗(yàn).

1.2 相對生長速率

將石莼從培養(yǎng)介質(zhì)中撈出，用吸水紙吸干表面附著水分后，測定鮮重(Fw)，石莼的相對生長速率用以下公式計(jì)算(Relative Growth Rate，RGR)[19]：

(1)

式中：Wt為第t天所稱的藻體鮮重，g；W0為藻體初始鮮重，g.

1.3 光合放氧和暗呼吸速率

取 5 mL 培養(yǎng)液于 20 ℃ 恒溫反應(yīng)槽內(nèi)，加入約 0.006 g 的藻片，通過磁力攪拌器在反應(yīng)槽內(nèi)勻速攪動(dòng)，分別在光強(qiáng)為 400 μmol photons/(m·s)和在黑暗條件下，通過液相氧電極(YSI Model 5 300，Yellow Springs Instrument Co.，美國) 測定藻體的光合放氧速率(Net photosynthetic rate，Pn)和暗呼吸速率(Dark respiration rate，Rd).

1.4 葉綠素?zé)晒?/h3>

葉綠素 a 熒光參數(shù)是通過使用便攜式調(diào)制葉綠素?zé)晒鈨x(PAM-2100， Heinz Walz GmbH，德國)測定.弱測量光和光化光分別為 0.01 和 100 μmol photons/(m·s)，飽和脈沖光為 5 000 μmol photons/(m·s)，持續(xù) 0.8 s.PSII 的最大光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)、實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率(Yield)[20-21]通過以下公式計(jì)算：

(2)

其中,Fv為暗適應(yīng)可變熒光值，F(xiàn)m為暗適應(yīng)飽和光強(qiáng)下的最大熒光值，F(xiàn)0為暗適應(yīng)出示熒光值.

(3)

F′m為光化光的最大熒光產(chǎn)量穩(wěn)定水平,F為激發(fā)狀態(tài)下的實(shí)時(shí)熒光.

1.5 色素含量

將藻體置于含 10 mL 90% 丙酮的研缽中研磨后，在 4 ℃ 黑暗環(huán)境下提取 24 h，離心 10 min，吸取上清液用紫外可見分光光度計(jì)(UV-1 800，島津，日本) 測定波長分別為 750 nm、665 nm、652 nm、510 nm 和 480 nm 的吸光度，色素含量計(jì)算參考Porra[22]和Parsons等[23]的方法：

Chla=12.25×(A665-A750)-2.55×(A652-A750)

(4)

Chlb=20.31×(A652-A750)-4.91×(A665-A750)

(5)

Car=7.6×[(A480-A750)-1.49×(A510-A750)

(6)

1.6 胞外碳酸酐酶活性

胞外碳酸酐酶活性(extracellular Carbonic Anhydrase，eCA)采用 Wilbur等[24]的方法測定.將藻體放入含有巴比妥-鹽酸緩沖溶液 (20 mM，pH 8.3)的反應(yīng)槽中，磁力攪拌器攪動(dòng)，加入飽和 CO2水(將純水置于 4 ℃ 恒溫循環(huán)水浴中，通入高純度的 CO2氣體約 60 min 制得)，記錄 pH 值從 8.3 降低到 7.3 的時(shí)間.酶的單位計(jì)算公式為

(7)

其中，t0和t分別代表不加藻和加藻的反應(yīng)時(shí)間.

1.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用 Excel 和 Origin8.5.1 軟件(Origin Lab Corp.，Northampton，MA，USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析.運(yùn)用雙因素方差分析(Two-way ANOVA 和 Fisher LSD) 分析數(shù)據(jù)間的差異性.以P<0.05 作為顯著差異水平.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 相對生長速率

圖1(a)表示不同CO2濃度及Cd2+濃度培養(yǎng)下石莼的相對生長速率.在大氣CO2濃度下，隨著 Cd2+濃度升高，相對生長速率出現(xiàn)下降趨勢.由對照組到中等鎘濃度(MCd)水平時(shí)，相對生長速率降低 32.78%(P<0.05)，到高鎘濃度(HCd) 水平時(shí)，與 MCd 相比，下降幅度則不明顯(P>0.05).HCd 培養(yǎng)下相對生長速率最低，約為 11.57±3.91%/d.高 CO2濃度下，隨著 Cd2+濃度逐漸升高，相對生長速率分別下降 50.11% (P<0.05，RGR=11.64±3.01 %/d)和 61.77%(P<0.05,RGR=4.45±0.17 %/d).雙因素方差分析表明，CO2濃度升高對生長沒有顯著影響，鎘濃度升高則顯著降低石莼的相對生長速率(Two-way ANOVA, CO2濃度：P>0.05， 鎘濃度：P<0.05)，且二者交互效應(yīng)顯著(Two-way ANOVA,P<0.05)，表明 CO2濃度升高增加了 Cd2+對石莼生長的毒性作用，見圖1(b).

圖1 不同 CO2和 Cd2+濃度條件下石莼的相對生長速率(a)以及不同CO2條件下 Cd2+濃度對石莼相對生長速率的抑制率(b)

Fig.1 Relative growth rate (a) and the inhibition rate (b) ofUlvalactucaat different CO2and Cd2+concentrations

其中，不同字母表示相同Cd2+濃度下，不同 CO2濃度對石莼產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)；不同橫線高度表示相同 CO2濃度下，不同 Cd2+濃度對石莼產(chǎn)生顯著影響(P<0.05).

2.2 凈光合速率

如圖 2(a) 所示，CO2濃度升高與 Cd2+濃度升高均可顯著降低石莼的凈光合速率(Two-way ANOVA，CO2濃度：P<0.05，Cd2+濃度：P<0.05).在正常CO2濃度條件下，與對照組(Control)相比，HCd 條件下，石莼凈光合速率降低了 70.86%(P<0.05，Pn=14.33±1.46 O2/(g FW·h))；在高 CO2濃度條件下,則降低了 89.59%(P<0.05，Pn=3.57±0.31 O2/(g FW·h)).如圖2(b)所示,與相對生長速率類似，CO2濃度升高與 Cd2+濃度升高對石莼的凈光合作用亦存在顯著的交互效應(yīng)(Two-way ANOVA，P<0.05)，即 CO2濃度升高增加了 Cd2+對石莼凈光合作用的毒性作用.

2.3 胞外碳酸酐酶活性

不同CO2濃度及Cd2+濃度培養(yǎng)下石莼胞外碳酸酐酶的活性變化如圖 3 所示， 在兩種 CO2濃度下，Cd2+濃度升高均顯著降低胞外碳酸酐酶活性.如與對照組比，在正常 CO2濃度條件下，HCd 中胞外碳酸酐酶活性降低了 65.11%(P<0.05，eCA=7.17±0.96 EU/mg SP)；在高 CO2濃度條件下，HCd 中胞外碳酸酐酶活性則降低了 79.09%(P<0.05，eCA=2.09±0.75 EU/mg SP).雙因素方差分析表明，CO2濃度升高與 Cd2+濃度升高均顯著降低石莼的胞外碳酸酐酶活性(Two-way ANOVA，CO2濃度：P<0.05，Cd2+濃度：P<0.05)，且二者交互效應(yīng)顯著(Two-way ANOVA，P<0.05)，表明 CO2濃度升高增加了 Cd2+對石莼胞外碳酸酐酶活性的抑制作用.

圖2 不同 CO2和 Cd2+濃度條件下石莼的凈光合速率(a)以及不同 CO2條件下 Cd2+濃度對石莼凈光合速率的抑制率(b)

Fig.2 Net photosynthetic rate (a) and the inhibition rate (b) ofUlvalactucaat different CO2and Cd2+concentrations

其中，不同字母表示相同 Cd2+濃度下，不同 CO2濃度對石莼產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)；不同橫線高度表示相同 CO2濃度下，不同 Cd2+濃度對石莼產(chǎn)生顯著影響(P<0.05).

圖3 不同 CO2和 Cd2+濃度條件下石莼的胞外碳酸酐酶活性

Fig.3 Extracellular carbon anhydrase activity ofUlvalactucaat different CO2and Cd2+concentrations

其中，不同字母表示相同 Cd2+濃度下，不同 CO2濃度對石莼產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)；不同橫線高度表示相同 CO2濃度下，不同 Cd2+濃度對石莼產(chǎn)生顯著影響(P<0.05).

2.4 暗呼吸速率

與相對生長速率、胞外碳酸酐酶活性及凈光合速率響應(yīng)截然相反，在正常 CO2濃度條件下，與對照組(Control)相比，HCd 條件下，石莼凈暗呼吸速率升高 68.49%(P<0.05，Rd=14.98±4.21 O2/(g FW·h))； 在高 CO2濃度條件下，則升高了212.01%(P<0.05，Rd=23.91±2.75 O2/(g FW·h))(圖 4).CO2濃度升高與Cd2+濃度升高對石莼的暗呼吸速率亦存在顯著的交互效應(yīng)(Two-way ANOVA,P<0.05)，即在高 CO2濃度條件下，石莼暗呼吸對 Cd2+更加敏感.

圖4 不同 CO2和 Cd2+濃度條件下石莼的暗呼吸速率

Fig.4 Dark respiration rate ofUlvalactucaat different CO2and Cd2+concentrations

其中，不同字母表示相同Cd2+濃度下，不同 CO2濃度對石莼產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)；不同橫線高度表示相同 CO2濃度下，不同 Cd2+濃度對石莼產(chǎn)生顯著影響(P<0.05).

2.5 色素含量

如表 1 所示，CO2濃度升高與 Cd2+濃度升高均顯著降低石莼的 Chla和 Chlb含量(Two-way ANOVA，CO2濃度：P<0.05，Cd2+濃度：P<0.05).在正常 CO2濃度條件下，與對照組(Control)相比，HCd 條件下，石莼 Chla含量降低了 47.75%(P<0.05)，Chlb含量降低了 35.00%(P<0.05)；在高 CO2濃度條件下，Chla則降低了 60.61%(P<0.05)，Chlb降低 62.86%(P<0.05).CO2濃度升高與 Cd2+濃度升高對石莼的 Chla和 Chlb含量均存在顯著的交互效應(yīng)(Two-way ANOVA，P<0.05).

表1 不同 CO2和 Cd2+濃度條件下石莼的色素含量(mg/g FW)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)

Table 1 Pigment contents (mg/g FW) and chlorophyll fluorescence parameters ofUlvalactucaat different CO2and Cd2+concentrations

培養(yǎng)條件Chla/(mg/g FW)Chlb/(mg/g FW)Car/(mg/g FW)Fv/Fm實(shí)際光化學(xué)效率Air Control0.77±0.06Aa0.40±0.03Aa0.38±0.02Aa0.78±0.01Aa0.50±0.05AaAir MCd0.55±0.05Ba0.30±0.03ABa0.29±0.02Ba0.69±0.02Ba0.38±0.02BaAir HCd0.41±0.10Ca0.26±0.07Ba0.18±0.06Ca0.64±0.01Ca0.28±0.01Ca+CO2 Control0.66±0.08Ab0.39±0.04Aa0.35±0.06Aa0.75±0.01Aa0.49±0.01Aa+CO2 MCd0.42±0.06Bb0.25±0.06Ba0.23±0.04Ba0.63±0.03Bb0.32±0.01Bb+CO2 HCd0.26±0.01Cb0.14±0.01Cb0.15±0.01Ca0.59±0.01Cb0.24±0.02Cb

注：不同小寫字母表示相同 Cd2+濃度下，不同 CO2濃度對石莼產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)；不同大寫字母表示相同 CO2濃度下，不同 Cd2+濃度對石莼產(chǎn)生顯著影響(P<0.05).

Car 含量在正常 CO2濃度條件下，與對照組(Control)相比，HCd 條件下， 石莼 Car 含量降低了 52.63%(P<0.05)；在高 CO2濃度條件下，Car 則降低了57.14%(P<0.05)(表 1).CO2濃度升高對 Car 含量沒有顯著影響，Cd2+濃度升高均顯著降低石莼的 Car 含量(Two-way ANOVA, CO2濃度：P>0.05，Cd2+濃度：P<0.05).

2.6 葉綠素?zé)晒鈪?shù)

如表 1 所示，CO2濃度升高與 Cd2+濃度升高均顯著降低石莼的Fv/Fm和Yield(Two-way ANOVA，CO2濃度：P<0.05，Cd2+濃度：P<0.05).在正常 CO2濃度條件下，與對照組(Control)相比，HCd 條件下，石莼Fv/Fm含量降低了 17.95%(P<0.05)，Yield含量降低了 44.00%(P<0.05)；在高 CO2濃度條件下，F(xiàn)v/Fm則降低了 21.33%(P<0.05)，Yield降低 51.02%(P<0.05)(表 1).與 Chla和 Chlb類似，CO2濃度升高與 Cd2+濃度升高對石莼的Fv/Fm和Yield均存在顯著的交互效應(yīng)(Two-way ANOVA，P<0.05).

3 討 論

3.1 Cd2+ 對石莼的影響

重金屬 Cd2+是一種植物非必需元素，當(dāng)濃度持續(xù)升高時(shí)，可抑制海藻壇紫菜[18]、龍須菜(Gracilarialemaneiformis)[25]、滸苔和緣管滸苔(UlvaLinza)[26]的生長，但抑制程度與藻種類和所接觸的重金屬離子濃度密切相關(guān).而在目前的研究中，不管是否處于酸化環(huán)境，隨著Cd2+濃度的升高，石莼的相對生長速率均明顯降低.重金屬對植物的毒性由植物的攝取能力和胞內(nèi)結(jié)合位點(diǎn)決定[27].當(dāng)周圍環(huán)境中重金屬離子達(dá)到一定濃度時(shí)，細(xì)胞壁上的金屬結(jié)合位點(diǎn)達(dá)到飽和，則多余的重金屬進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，參與代謝過程，從而對細(xì)胞產(chǎn)生毒性[28].

重金屬 Cd2+對藻類色素的影響存在種類差異，如小球藻(Chlorellavulgaris)[29]、滸苔和緣管滸苔[26]Chla和 Chlb含量均明顯下降，但對三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)色素含量并沒有明顯的影響[30].本文的研究結(jié)果與前者相似，其原因可能在于 Cd2+抑制了葉綠素合成代謝關(guān)鍵酶氨基乙酰脫氫酶的活性，并最終影響葉綠素合成[31].Car 作為捕光天線色素將吸收的光能傳遞給葉綠素分子用于光合作用，前人的研究顯示，滸苔和緣管滸苔的類胡蘿卜素含量由于 Cd2+濃度升高而出現(xiàn)下降的現(xiàn)象[26]，本文的研究結(jié)果也證實(shí)了 Cd2+影響類胡蘿卜素合成.Cd2+在影響石莼色素合成的同時(shí)，也導(dǎo)致Fv/Fm、Yield 和光合放氧速率的下降，這與Brembu 等[30]結(jié)果相一致.而石莼呼吸速率明顯增加，也表明其對重金屬解毒的能量需求增加[17]，可見重金屬 Cd2+對石莼生長的影響可能是通過抑制色素的合成，下調(diào)光能的利用效率，降低光合速率，增加呼吸速率，進(jìn)而導(dǎo)致有機(jī)物積累的降低，生長受到抑制.

3.2 CO2 濃度升高增加了Cd2+對石莼的毒性

在壇紫菜的研究中發(fā)現(xiàn)，在高 Cd2+濃度下，高濃度 CO2并沒有影響壇紫菜Chla和 Car 含量[18]，而條斑紫菜(Pyropiayezoensis)在高 Zn 濃度下，高濃度CO2導(dǎo)致 Chla含量明顯升高[35].目前的研究顯示，CO2濃度升高培養(yǎng)下，不同濃度的 Cd2+均能使石莼Chla明顯降低，而 Chlb僅在 HCd 條件下降低顯著，而 Car 則沒有明顯變化，表明色素對 CO2和 Cd2+的交互作用影響的敏感度為：Chla>Chlb>Car，這說明石莼處于 Cd2+脅迫環(huán)境中，CO2濃度升高可能更容易抑制光能的利用，而對光能的捕獲影響較小，這與Fv/Fm和 Yield 的變化也是一致的.光能利用效率的降低，導(dǎo)致光合速率下降.

4 結(jié) 論