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    南極磷蝦油對骨質(zhì)疏松模型小鼠骨折愈合的促進(jìn)作用

    2019-07-01 07:50:34李媛媛毛相朝唐彭皓李彩龍王靜鳳
    食品科學(xué) 2019年11期
    關(guān)鍵詞:板層重塑軟骨

    李媛媛,毛相朝,唐彭皓,李彩龍,于 朋,王靜鳳*

    (中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266003)

    骨質(zhì)疏松癥是絕經(jīng)后婦女和老年人最普遍、復(fù)雜的骨骼代謝疾病,會引起骨組織內(nèi)單位體積骨量減少、骨微結(jié)構(gòu)遭到破壞,正常荷載性能下降,骨脆性增加,以致骨組織受到低能量創(chuàng)傷即會引發(fā)骨折[1-2]。骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporosis fracture,OPF)是骨質(zhì)疏松癥最常見、最嚴(yán)重的并發(fā)癥[3]。OPF的特點之一是發(fā)病率高:國際骨質(zhì)疏松基金會調(diào)研發(fā)現(xiàn),全球范圍內(nèi)每3 s就會出現(xiàn)一起OPF病例;50 歲之后,1/2的女性和1/5的男性會遭遇一次骨折[4]。OPF特點二為致殘率高:與一般創(chuàng)傷性骨折相比,OPF愈合過程中骨內(nèi)、外膜表面骨形成不足,骨礦化沉積速率減慢,骨痂形成量減少;此外,骨重塑出現(xiàn)延遲,骨折區(qū)新生皮質(zhì)骨厚度變薄,最終延長了骨折愈合周期[5-7],甚至?xí)?dǎo)致骨不連,新骨機(jī)械性能下降[8-9],大大增加了發(fā)生二次骨折的風(fēng)險[10-11]。因此具有高發(fā)病率、高致殘率特點的OPF對老年人尤其是絕經(jīng)后婦女的身心健康構(gòu)成了巨大的威脅[12],其漫長的恢復(fù)過程給患者的日常生活帶來了極大的不便,高昂的醫(yī)療費(fèi)用還給家庭乃至社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[13],OPF已儼然成為新的全球威脅?,F(xiàn)在臨床上OPF的治療方式多為物理、基因和藥物治療,但是這些治療手段價格昂貴,且或多或少存在副作用,所以尋找安全有效的輔助治療措施成為了研究熱點。

    以南極磷蝦為原料提取的南極磷蝦油(Antarctic krill oil,AKO)富含磷脂型二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)、二十二碳六烯酸(docosapentenoic acid,DHA)以及少量的蝦青素等多種活性因子[14-15],研究發(fā)現(xiàn)AKO具有抗氧化[16]、強(qiáng)健大腦[17]、降血脂[18-19]、抗疲勞[20]等多種生物功能[21]。此外,近期研究發(fā)現(xiàn),EPA、DHA可促進(jìn)骨生成、改善軟骨細(xì)胞代謝[22],而骨折愈合過程經(jīng)歷的軟骨內(nèi)骨化則與此有著密切的關(guān)系,因此本研究以富含磷脂型EPA和DHA的AKO為受試物,以軟骨內(nèi)成骨為切入點,系統(tǒng)地研究AKO對骨質(zhì)疏松骨折愈合的作用,以期為南極磷蝦油功能性食品開發(fā)提供理論參考,為OPF的輔助性治療提供新思路。

    1 材料與方法

    1.1 動物、材料與試劑

    8 周齡雌性C57BL/6J小鼠,SPF級,體質(zhì)量(18.50±2.56)g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2012-0001,飼養(yǎng)溫度為22~24 ℃,相對濕度為52%~58%。

    南極磷蝦油由中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與人類健康實驗室贈予。AKO組成成分分析結(jié)果顯示其含有約57.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同)磷脂、14.2%甘油三酯、15.3%游離脂肪酸、2.1%膽固醇和0.594‰蝦青素。EPA和DHA分別占總脂肪酸質(zhì)量的25.13%和19.24%。

    阿侖膦酸鈉片 澳大利亞默沙東公司;血清中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、骨堿性磷酸酶(bone alkaline phosphatase,BALP)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒 美國R & D公司;通用型組織固定液(中性) 武漢賽維爾生物科技有限公司;UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒及隨機(jī)引物 生工生物工程(上海)股份有限公司;TRIzol試劑 Ambion生物科技有限公司;RiboLock RNA酶抑制劑 美國Thermo Fisher Scientific公司;M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 美國Promega公司;dNTP Mixture寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;Aggrecan、Col10a、MMP-13、PDGF-BB、Ang1、Col1a、OCN β-actin引物 蘇州金唯智生物科技有限公司;SYBR Green熒光染料 美國Novoprotein 公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Neofuge 13R 型高速冷凍離心機(jī) 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司;Model680型酶標(biāo)儀 美國Bio-Rad公司;LightCycler480實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀 瑞士Roche公司;RM2125RTS石蠟切片機(jī) 德國Leica公司;BH14光學(xué)顯微鏡 日本Olympus公司;YLS-16A小動物骨骼強(qiáng)度測定儀 濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司;GK99-UNIGAMMA X-RAY PLUS雙能X射線骨密度儀意大利I’can公司;SCANCO微型計算機(jī)斷層掃描(micro computed tomography,μCT)儀 瑞士Scanco Medical AG公司;100型高效液相色譜儀 美國Aglient公司;ICS2000型離子色譜儀 美國Dionex公司;Ultra Trurrax T18 basic型高速勻漿機(jī) 德國IKA公司。

    1.3 方法

    1.3.1 動物分組及模型建立

    C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組,36 只)和去卵巢組(OVX組,90 只),腹腔注射水合氯醛(400 mg/kg mb)進(jìn)行麻醉,Sham組切除卵巢周圍少量脂肪組織,OVX組行雙側(cè)去卵巢手術(shù)。術(shù)后3 個月,每組取4 只小鼠進(jìn)行安樂死,取股骨進(jìn)行骨密度分析,結(jié)果顯示,與Sham組相比,OVX組小鼠股骨骨密度顯著降低(P<0.05),證明骨質(zhì)疏松模型建立成功(圖1A)。

    圖1 小鼠骨質(zhì)疏松性骨折模型的建立Fig. 1 Establishment of the osteoporotic fracture model

    隨后小鼠于右脛骨中上1/3處行開放性骨折手術(shù)(圖1B)。將手術(shù)成功的小鼠進(jìn)行分組:Sham組小鼠骨折后作為一般骨折對照組(Control組),去卵巢小鼠骨折后隨機(jī)分為骨質(zhì)疏松性骨折模型組(Model組)、陽性對照組(ALN組)、AKO組,每組27 只。骨折后立即灌胃受試物,其中Control組、Model組小鼠灌胃生理鹽水,ALN組小鼠灌胃阿倫磷酸鈉(質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL),AKO組小鼠灌胃南極磷蝦油(質(zhì)量濃度為30 mg/mL),灌胃劑量均為10 mL/kg mb。骨折術(shù)后第5天,每組取5 只小鼠禁食不禁水8 h,行尾靜脈取血,常規(guī)分離血清用于生化指標(biāo)檢測。術(shù)后11、24 d每組取8 只小鼠禁食不禁水8 h,摘眼球取血,收集血清用于生化指標(biāo)檢測;小鼠脫頸椎處死后,迅速分離右脛骨痂組織,用于組織形態(tài)學(xué)觀察(11、24、35 d,每組4 只)、2D μCT分析(24 d,每組3 只)、生物力學(xué)分析(56 d,每組4 只)及骨折愈合相關(guān)基因檢測(11、24 d,每組4 只)。

    1.3.2 血清生化指標(biāo)測定

    參照ELISA試劑盒方法測定血清VEGF質(zhì)量濃度和BALP活力。

    1.3.3 股骨組織骨密度測定

    小鼠去卵巢術(shù)后3 個月,取股骨組織,采用雙能X射線骨密度測試儀檢測骨密度。

    1.3.4 骨痂組織形態(tài)學(xué)觀察

    小鼠右脛骨痂于組織固定液固定24 h,質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%乙二胺四乙酸二鈉(pH 7.3)脫鈣 2~3 周石蠟包埋切片(5 μm厚),進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色,光學(xué)顯微鏡下觀察骨痂組織學(xué)特點并成像。

    1.3.5 骨痂2D μCT分析

    小鼠骨折術(shù)后第24天取材骨痂組織,采用2D μCT掃描儀進(jìn)行掃描,并使用配套軟件分析骨折區(qū)形態(tài)學(xué)參數(shù)。用ImageJ軟件分析2D μCT圖像獲得的愈傷組織橫切面,計算橫切面的最大長度和最小長度以評估愈傷組織的大小。

    1.3.6 骨痂生物力學(xué)測定

    在骨折后第56天取材骨痂組織,通過小鼠骨骼強(qiáng)度測試儀的3點彎曲測試來確定脛骨骨折區(qū)的最大彎曲剛度。

    1.3.7 qPCR分析

    取小鼠骨折后第11、24天骨痂組織,檢測骨折愈合相關(guān)基因mRNA相對表達(dá)量。采用總RNA抽提試劑盒法提取骨痂組織總RNA,取1 μg骨痂總RNA在反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV的催化下逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后進(jìn)行熒光實時定量PCR(quantitative real-time PCR,qPCR)擴(kuò)增,各反應(yīng)物用量參照Maxima SYBR Green qPCR Mastermix說明書要求。反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性15 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸30 s,共45 個循環(huán)。相關(guān)目的基因的引物序列如表1所示,以β-actin作為內(nèi)參校正目的基因mRNA表達(dá)量。

    表1 小鼠骨折愈合相關(guān)基因的引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR amplification of fracture healing related genes

    1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

    采用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析,并進(jìn)行最小顯著性差異法和SNK(Student-Newman-Keuls)法組間比較分析,P<0.05為差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 AKO對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

    圖2 AKO對小鼠血清生化指標(biāo)的影響Fig. 2 Effect of AKO on serum biochemical indicators

    由圖2A可知,各組VEGF表達(dá)高峰期集中在骨折后第5、11天,說明新血管的生成及入侵主要發(fā)生在骨折愈合的早中期。骨折后第5、11天,Model組血清VEGF質(zhì)量濃度較Control組均顯著降低,經(jīng)AKO干預(yù)后VEGF質(zhì)量濃度分別上升了6.39%和8.05%(P<0.05),提示AKO在骨折愈合早中期促進(jìn)血管新生與入侵。圖2B顯示,各組BALP在骨折術(shù)后第24天呈現(xiàn)高表達(dá),表明這個時期是活躍的新骨形成階段。此外,骨折后第11天,與Control組相比,Model組血清BALP活力顯著降低,而AKO組極顯著升高(P<0.01)。提示在骨折愈合期間,AKO可增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性、促進(jìn)新骨形成。

    2.2 AKO對OPF愈合過程中軟骨痂至硬骨骨痂演變的影響

    圖3 AKO對小鼠骨折后11 d骨痂組織形態(tài)學(xué)的影響Fig. 3 Effect of AKO on callus histomorphology at 11 days post-fracture

    對不同時間點的骨痂組織切片進(jìn)行HE染色,動態(tài)觀察骨痂形態(tài)學(xué)變化,從而反映軟骨內(nèi)骨化進(jìn)程。如圖3所示,骨折手術(shù)后11 d,Control組骨折區(qū)愈傷組織由大量編織骨組織和少量軟骨組織組成。然而,Model組主要充斥大量軟骨愈傷組織,且多數(shù)處于增殖期。模型小鼠經(jīng)AKO干預(yù)后,骨痂中大量軟骨細(xì)胞變得肥厚,并伴有軟骨基質(zhì)降解和礦化新骨替代軟骨現(xiàn)象,表明AKO促進(jìn)軟骨細(xì)胞肥大、凋亡及新骨礦化,使小鼠提前完成軟骨痂期過渡至硬骨痂期。

    圖4 AKO對小鼠骨折后24 d骨痂組織形態(tài)學(xué)及微結(jié)構(gòu)的影響Fig. 4 Effect of AKO on histomorphology and microstructure of callus at 24 days post-fracture

    圖4 A表明,骨折后24 d軟骨性骨痂已經(jīng)轉(zhuǎn)化為硬骨骨痂,且逐漸豐富聚集演變成致密的板層骨橋接骨折斷端。結(jié)果顯示,Control組骨痂由致密的編織骨填充,且向成熟的板層骨轉(zhuǎn)變;而Model組編織骨含量較少,且疏松散亂。補(bǔ)給AKO后,小鼠骨痂內(nèi)編織骨的數(shù)量增加,且聚合呈片狀骨。結(jié)果提示AKO可以促進(jìn)骨性骨痂的形成與成熟。此外,第24天愈傷組織的2D μCT分析(圖4C~E)表明,AKO通過增加相對骨體積(增加16.97%)、骨小梁數(shù)量(增加14.77%),降低骨小梁分離度(降低18.53%),使模型小鼠骨性骨痂微結(jié)構(gòu)得到顯著改善。2D μCT結(jié)果顯示,AKO組較Model組骨痂橫截面最大長度減少了23.51%(P<0.01)(圖4B、F),在一定程度上反映了AKO在骨折手術(shù)后第24天顯著降低了愈合組織的大小,加速后期骨重塑。

    綜上表明,AKO通過加速軟骨細(xì)胞肥大和礦化、促進(jìn)硬骨痂的形成與完善,增加愈傷組織的成熟,從而促進(jìn)骨折愈合。

    2.3 AKO對OPF愈合過程中硬骨痂塑形的影響

    圖5 AKO對小鼠骨折后35 d骨痂組織形態(tài)學(xué)及56 d骨痂生物力學(xué)性能的影響Fig. 5 Effect of AKO on callus histomorphology at 35 days post-fracture and biomechanical properties of callus on at 56 days post-fracture

    圖5 A顯示,骨折后35 d,Control組骨痂在將形成皮質(zhì)骨的區(qū)域觀察到致密的板層骨,而Model組骨折處的板層骨塑型不完全,間隙較大;灌胃AKO后,板層骨痂致密成熟,骨重塑能力顯著增強(qiáng)。骨折后56 d骨痂的彎曲剛度測試結(jié)果(圖5B)顯示,Model組骨痂結(jié)構(gòu)強(qiáng)度較Control組顯著降低,說明骨質(zhì)疏松癥損害了OPF愈合質(zhì)量;經(jīng)AKO治療后,骨痂結(jié)構(gòu)強(qiáng)度極顯著升高59.28%(P<0.01)。以上結(jié)果提示,AKO可促進(jìn)骨重塑的完成,使新骨快速恢復(fù)正常的機(jī)械強(qiáng)度,提高新骨的內(nèi)在質(zhì)量和抗外力性能。

    2.4 AKO對軟骨內(nèi)成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響

    骨折愈合過程中軟骨內(nèi)成骨相關(guān)關(guān)鍵因子的mRNA相對表達(dá)量檢測結(jié)果顯示(圖6),骨折術(shù)后第11天,與Control組相比,Model組Aggrecan、Col10a表達(dá)量顯著升高;而MMP-13、PDGF-BB、Ang1、Col1a及OCN相對表達(dá)量顯著降低,直到術(shù)后第24天表達(dá)量才上升。提示Model組小鼠骨折后第11天愈合過程仍處于軟骨痂優(yōu)勢階段,直至第24天才集中發(fā)生軟骨礦化及骨性骨痂的重塑。說明由于骨質(zhì)疏松癥的影響,軟骨痂的成熟及礦化被嚴(yán)重推遲。模型小鼠灌胃AKO后,骨痂Aggrecan、Col10a表達(dá)量在術(shù)后第11天顯著下調(diào),分別下降53.43%、20.47%;而MMP-13、PDGF-BB、Ang1、Col1a及OCN相對表達(dá)量在骨折后第11天顯著上調(diào),分別升高85.53%、187.83%、115.5%、35.15%、134.74%。另外,圖6B、C顯示,骨折后第24天,AKO組小鼠MMP-13、PDGF-BB、Ang1表達(dá)量降低,而Col1a及OCN表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。以上結(jié)果提示,AKO可通過調(diào)控軟骨內(nèi)骨化相關(guān)基因的表達(dá),促進(jìn)血管入侵,加速OPF小鼠軟骨痂向鈣化軟骨痂轉(zhuǎn)變,從而加速骨折愈合。

    圖6 AKO對小鼠軟骨內(nèi)成骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of AKO on mRNA expression of key genes related to endochondral ossification

    3 討 論

    本實驗采用OVX手術(shù)及單側(cè)脛骨開放性骨折手術(shù)建立OPF模型,通過檢測OPF愈合過程中軟骨內(nèi)成骨時期和骨痂重塑期相關(guān)的各項指標(biāo),探究AKO對骨質(zhì)疏松模型小鼠骨折愈合的作用。結(jié)果表明,AKO可促進(jìn)OPF愈合過程中的成軟骨分化、軟骨成熟肥大、軟骨基質(zhì)降解、新血管生成和新骨形成,加速軟骨內(nèi)骨化進(jìn)程;促進(jìn)硬骨痂塑型,增強(qiáng)新骨機(jī)械強(qiáng)度,提高愈合質(zhì)量。

    骨折愈合是一個響應(yīng)骨損傷而發(fā)生的復(fù)雜多階段的骨修復(fù)過程,其最終目標(biāo)是使受損的骨返回到功能和生物力學(xué)健全的狀態(tài)。骨質(zhì)疏松性骨折愈合主要經(jīng)歷以下3 個緊密連接的階段:1)骨折斷端形成血腫、募集間充質(zhì)干細(xì)胞的炎癥期;2)骨膜反應(yīng)為特征的膜內(nèi)成骨,以及經(jīng)歷軟骨骨痂-礦化軟骨痂-編織骨樣骨性骨痂的逐步過渡的軟骨內(nèi)骨化階段;3)包括骨再吸收和骨形成的骨痂重塑階段,使骨恢復(fù)原始形態(tài)和質(zhì)量[23-24]。

    軟骨內(nèi)成骨階段是發(fā)生在骨質(zhì)疏松性骨折愈合早中期的重要階段:在此過程中,大量具有多向分化潛能的MSCs被募集到骨折斷端,在轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)等生長因子作用下分化為軟骨細(xì)胞;軟骨細(xì)胞大量增殖,分泌軟骨蛋白聚糖;軟骨細(xì)胞成熟肥大,分泌X型膠原,形成軟骨骨痂[25]。隨后,由于軟骨痂機(jī)械強(qiáng)度無法滿足機(jī)體需求,它將被編織骨由外向內(nèi)逐漸替代:軟骨愈傷組織分泌MMP-13等因子進(jìn)行軟骨基質(zhì)降解,最終軟骨細(xì)胞凋亡[26];成骨細(xì)胞入侵增殖分化、分泌骨基質(zhì)并礦化成小梁骨,并逐漸匯聚成致密的板層骨,形成骨性骨痂連接骨折斷端[27]。骨折后第11、24天的骨痂HE、2D μCT結(jié)果顯示,相比于Model組小鼠,AKO組小鼠骨折區(qū)提前出現(xiàn)大量肥大軟骨細(xì)胞并伴有軟骨基質(zhì)降解,部分軟骨被礦化新骨代替,形成松散的小梁骨;隨后更快地轉(zhuǎn)變成了致密、骨微結(jié)構(gòu)優(yōu)良的成熟板層骨。提示AKO通過促進(jìn)軟骨內(nèi)骨化進(jìn)程,改善骨質(zhì)疏松引起的骨折愈合延遲現(xiàn)象。

    軟骨內(nèi)骨化進(jìn)程受多種生長因子調(diào)控:其中Aggrecan、Col10a、MMP-13是軟骨細(xì)胞增殖、肥大、基質(zhì)降解的標(biāo)志物[28-30];VEGF、PDGF-BB、Ang是血管生成及入侵相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子[31],促進(jìn)氧分壓的改善及營養(yǎng)、成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的運(yùn)輸;BALP、Col1a、OCN表達(dá)量反映成骨細(xì)胞活性[32],是重要的骨生成標(biāo)志物,可以反應(yīng)硬骨痂形成及重塑情況。血清及基因檢測結(jié)果顯示,模型小鼠灌胃AKO后,骨折后第11天的骨痂Aggrecan、Col10a表達(dá)量顯著降低,而MMP-13、VEGF、PDGF-BB、Ang1、ALP、Col1a及OCN的mRNA相對表達(dá)量顯著上調(diào),表明AKO促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、肥大、凋亡及礦化。同時骨折后第24天,骨痂MMP-13、PDGF-BB、Ang1 mRNA相對表達(dá)量降低,而Col1a及OCN mRNA相對表達(dá)量顯著升高,說明AKO組已提前完成血管入侵,且加速了新骨的形成,進(jìn)一步證明了AKO加速軟骨內(nèi)骨化,促進(jìn)骨折愈合。

    骨折愈合后期以骨重塑為主:為了恢復(fù)骨的原有模式,骨性骨痂進(jìn)行骨塑形與改建,髓腔中多余的愈傷組織被吸收、清除,髄腔重新溝通,皮質(zhì)骨區(qū)演變出生物力學(xué)性能優(yōu)良的板層骨,恢復(fù)正常骨結(jié)構(gòu)。此階段主要經(jīng)歷破骨細(xì)胞對松散的編織骨進(jìn)行重吸收,并伴隨成骨細(xì)胞形成新的成熟板層骨的爬行替代過程,使原始骨痂的形狀和大小被重塑[33],生物力學(xué)性能得到改善[34-35]。骨折后第35天,組織學(xué)觀察結(jié)果顯示AKO組較Model組具有更強(qiáng)的骨重塑能力,形成致密的新骨橋接骨折斷端。骨折后第56天,AKO組骨痂最大彎曲剛度較Model組顯著增加,說明骨折愈合質(zhì)量更優(yōu)。綜上結(jié)果表明,AKO能夠在骨折愈合末期促進(jìn)骨性骨痂重塑,優(yōu)化骨痂力學(xué)結(jié)構(gòu)。

    綜上所述,AKO通過調(diào)控血管生成因子、軟骨內(nèi)成骨相關(guān)因子的表達(dá)以及成骨細(xì)胞活性來增強(qiáng)血管入侵、軟骨內(nèi)成骨以及骨重塑,改善因骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折愈合延遲與損傷,提高愈合質(zhì)量。

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