不同提取方法對灰樹花呈味物質(zhì)釋放的影響

許 銳，徐曉東，宋 澤，賈 茜，馮 濤，宋詩清*

（上海應(yīng)用技術(shù)大學(xué)香料香精技術(shù)與工程學(xué)院，上海 201418）

灰樹花（Grifola frondosa）屬擔(dān)子菌亞門、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、樹花菌屬，又名貝葉多孔菌，浙江慶元等地俗稱云蕈，河北遷西等地俗稱栗蘑，四川稱千佛菌，日本稱舞茸?；覙浠ú粌H口感鮮美，含有豐富的蛋白質(zhì)、碳水化合物、多糖、維生素、多種微量元素，更具有免疫功能和抗癌作用[1-2]，其中灰樹花多糖中生物活性最高的β-葡聚糖具有較好的抗炎作用[3-4]。20世紀(jì)80年代以來，日本、中國等國的科學(xué)家在灰樹花的生物、化學(xué)、藥理學(xué)等方面進行了廣泛研究，結(jié)果表明灰樹花是具有特殊價值的藥食兩用菇[5]。

近年來，國內(nèi)外研究者對灰樹花等食用菌的研究主要集中在多糖、貯藏保鮮及初級調(diào)味品開發(fā)等方面，有關(guān)灰樹花呈味物質(zhì)方面的研究鮮見報道。Zhang Anqiang等對灰樹花水溶性多糖的純化和結(jié)構(gòu)鑒定進行了研究[6]；Yang Hailong等研究了灰樹花發(fā)酵液與豆乳之間的協(xié)調(diào)作用[7]；He Xiaoyun等提取了灰樹花中的新呋喃酮并對其進行鑒定，同時對其抗菌性進行了研究[8]；呂旭聰?shù)确治隽嘶覙浠寡趸钚远喾拥奶崛〖兓椒úζ溥M行鑒定[9]；Su Chunhan等研究了不同提取溫度對灰樹花生物活性多糖理化性質(zhì)的影響[10]；Dissanayake等研究了灰樹花提取物的功能性食用價值[11]；陳貴堂等對灰樹花多肽的抗氧化活性進行了研究[12]；茆廣華研究發(fā)現(xiàn)富硒灰樹花子實體具有減毒、抗腫瘤和增強免疫機制的作用[13]。有關(guān)食用菌風(fēng)味物質(zhì)的研究一直是風(fēng)味化學(xué)工作者研究的重點，食用菌調(diào)味料及食用菌風(fēng)味食品的開發(fā)是食用菌深加工的重要方向[14-15]。食用菌的滋味主要是其豐富多樣的風(fēng)味物質(zhì)引起的，主要分為揮發(fā)性和非揮發(fā)性兩類。食用菌的揮發(fā)性組分種類繁多，主要包括八碳化合物及其衍生物、萜烯類、含硫化合物以及醛類、酸類、酮類、酯類等[16]。非揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)主要是一些可溶性糖及糖醇、有機酸、游離氨基酸以及5’-核苷酸等[17]。本實驗以可溶性糖、有機酸、游離氨基酸組成和含量、分子質(zhì)量分布為指標(biāo)，研究高壓蒸煮、酶解和閃式高速提取對灰樹花呈味物質(zhì)釋放的影響，以期為食用菌調(diào)味料的開發(fā)及風(fēng)味增強肽產(chǎn)品的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

灰樹花干品為浙江慶元市售。

纖維素酶（20 000 U/g）、風(fēng)味蛋白酶（20 000 U/g）、食用菌水解酶（2 000 U/g） 廣西南寧龐博生物工程有限公司；海藻糖、巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、甘露醇及5’-核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma公司；氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品 日本W(wǎng)ako公司；其他試劑 國藥集團化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ICS2500型離子色譜儀、CarboPac PA-20陰離子交換分析柱、Carbo Pac MA-1陰離子交換柱 美國Dionex公司；600高效液相色譜儀 美國Waters公司；Ultimate AQ-C18色譜柱 上海月旭材料科技有限公司；Green ODS-AQ C18色譜柱 上海易創(chuàng)儀器分析有限公司；ATN-300全自動凱氏定氮儀 上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司；754PC紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；GL-21M高速冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；DHG-9145A型鼓風(fēng)干燥箱、HWS28型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CS-700粉碎機 上海淀久機械制造有限公司；Milli-Q超純水設(shè)備 美國Ultra公司；JHBE-60T閃式高速提取器上海釩幟精密設(shè)備有限公司；ASTREE電子舌系統(tǒng)法國Alpha MOS公司。

1.3 方法

1.3.1 原料前處理

灰樹花干品使用CS-700粉碎機粉碎，過200 目篩，儲存待用。

1.3.2 灰樹花原液制備

稱取100 g灰樹花粉末，按料液比1∶20加入去離子水，混合，攪拌均勻，浸泡1.5 h，經(jīng)8 層紗布過濾，得灰樹花原液（記為A1）。

1.3.3 灰樹花酶解液的制備

食用菌水解酶酶解：稱取100 g灰樹花粉末，按料液比1∶20加入去離子水，升溫至90 ℃，滅酶5 min，冷卻至50 ℃，調(diào)節(jié)pH值至4.5，加入食用菌水解酶0.2 g（0.2%（以灰樹花質(zhì)量計，下同）），酶解1.5 h，升溫至90 ℃，滅酶5 min后，7 000 r/min下冷凍離心15 min，取上清液備用（記為B1）。

復(fù)合酶酶解：稱取100 g灰樹花干品粉末，按料液比1∶20加入去離子水，升溫至90 ℃，滅酶5 min，冷卻至50 ℃，調(diào)節(jié)pH值至3.5，加入纖維素酶0.5 g（0.5%），酶解1.5 h，然后調(diào)節(jié)pH值至6.0、溫度為50 ℃，加入風(fēng)味蛋白酶0.4 g（0.4%），繼續(xù)酶解1.5 h，升溫至90 ℃，滅酶5 min后，7 000 r/min下冷凍離心15 min，取上清液備用（記為C1）。

1.3.4 灰樹花高壓蒸煮液的制備

稱取100 g灰樹花粉末，按料液比1∶20加入去離子水，在40 kPa壓力下蒸煮1.5 h，蒸煮液冷卻至室溫，7 000 r/min下冷凍離心15 min，取上清液備用（記為D1）。

1.3.5 灰樹花閃式高速提取液的制備

在進行上述4 種處理前，將100 g灰樹花粉末按料液比1∶20加入去離子水，在11 000 r/min的轉(zhuǎn)速下，用閃式高速提取器提取2 min，再通過以上4 種處理方法分別制得4 個樣品，分別記為A2、B2、C2、D2。

1.3.6 水分含量的檢測

水分含量的檢測參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測定》[18]中烘箱法。

1.3.7 粗蛋白含量的檢測

粗蛋白的檢測參照GB/T 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》[19]中凱氏定氮法。

1.3.8 粗脂肪含量的檢測

粗脂肪含量測定參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測定》[20]中酸水解法。

1.3.9 可溶性糖含量的檢測

可溶性糖含量的檢測參考Ajlouni等[21]的方法。

1.3.10 有機酸、游離氨基酸含量及分子質(zhì)量分布的檢測

有機酸、游離氨基酸含量及分子質(zhì)量分布的檢測參考徐曉東等[22]的方法。

1.3.11 灰樹花呈味物質(zhì)的呈味特性測定

采用ASTREE電子舌系統(tǒng)，其主要由味覺傳感器、信號采集器和模式識別系統(tǒng)3 個部分組成。該裝置配有7 個傳感器（SRS-1、BRS-1、SWS-1、UMS-1、STS-1、SPS-1、GPS-1），以Ag/AgCl作為參比電極，在室溫下進行數(shù)據(jù)采集。數(shù)據(jù)采集前，電子舌系統(tǒng)需要經(jīng)過自檢、診斷和矯正等步驟，以確保采集得到的數(shù)據(jù)具有可靠性和穩(wěn)定性。本實驗采用體積分?jǐn)?shù)為10%的乙醇作為清洗溶劑，采樣時間120 s，1 次/s，每個樣品設(shè)置3 個平行樣品。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗所得數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用SPSS軟件進行顯著性分析，分析方法為最小顯著差法，顯著性水平為P＜0.05。主成分分析（principal component analysis，PCA）采用Unscramb 9.7軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰樹花干品的基本成分

表1 灰樹花干品基本成分Table 1 Chemical composition of Grifola frondosa

由表1可知，灰樹花干品的水分含量為3.46 g/100 g。灰樹花中主要的營養(yǎng)物質(zhì)為蛋白質(zhì)，其含量較高，為25.55 g/100 g，因此適合呈味肽的開發(fā)研究。同時，灰樹花中粗脂肪含量極低，僅有3.34 g/100 g，適合健康飲食的需要。

2.2 不同處理方式對灰樹花可溶性糖含量的影響

表2 不同處理方式條件下灰樹花提取液中可溶性糖含量Table 2 Soluble sugar contents in Grifola frondosa extracts obtained by different extraction methods

由表2可知，和原液相比，所有的處理方式條件下灰樹花提取液中可溶性糖的總量都呈現(xiàn)顯著性降低，尤其采用閃式高速提取處理后的高壓蒸煮制備液中其含量由1.15 mg/g（A2）降低為0.12 mg/g（D2）。這可能是由于在高壓蒸煮制備過程中會伴隨有美拉德反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致糖含量降低，而進一步采用閃式高速提取器進行處理，其細胞破碎程度增加，除了糖的釋放，蛋白質(zhì)或氨基酸含量也會增加，美拉德反應(yīng)程度也相應(yīng)加劇。兩種酶的酶解處理同樣會伴隨有美拉德反應(yīng)的發(fā)生，因此可溶性糖含量出現(xiàn)降低，但又因為酶解條件相對溫和，盡管采用了閃式高速提取器處理，可溶性糖總量也沒有出現(xiàn)顯著性降低。

食用菌的甜味主要是由這些小分子可溶性糖提供的[21]。從單一糖含量的變化來看，除樣品D1外，蔗糖在其他樣品中的含量顯著降低，且在食用菌水解酶酶解處理的樣品B1和B2中未檢出；木糖和阿拉伯糖在樣品B、C和D中都呈下降趨勢；葡萄糖的含量在兩種酶處理的樣品組中呈現(xiàn)增加趨勢，可能是葡萄糖的釋放量大于其消耗量，而葡萄糖在高壓蒸煮液中顯著降低，說明其釋放量不足以滿足消耗量；鼠李糖和巖藻糖在原液中均未檢出，而在高壓蒸煮液中被檢出；酶解液和高壓蒸煮液中檢出巖藻糖的存在。

對比4 組樣品閃式高速提取器處理前后的可溶性糖含量可知，閃式高速提取對可溶性糖的釋放有一定的促進作用。

2.3 不同處理方式對灰樹花有機酸含量的影響

表3 不同處理方式條件下灰樹花提取液中有機酸含量Table 3 Organic acid contents in Grifola frondosa extracts obtained by different extraction methods

有機酸是存在于生物體中的酸，是具有羧基（—COOH）的有機化合物的總稱。本實驗選擇研究了10 種有機酸的變化，結(jié)果如表3所示。和原液相比，無論是酶解處理還是高壓蒸煮處理，其有機酸的總量都呈顯著性增加，如原液A1中有機酸的總量為2.79 mg/g，經(jīng)過食用菌水解酶酶解處理后（B1），其有機酸的總量增加到4.83 mg/g，高壓蒸煮處理后（D1），其總量增加到5.27 mg/g。其中丙酸在原液（A1和A2）中均未檢出，而在B、C和D樣品中檢出，尤其在食用菌水解酶酶解處理的樣品B1和高壓蒸煮處理的樣品D1中含量較高，分別為2.84 mg/g和3.22 mg/g。乳酸在復(fù)合酶酶解處理樣品中增加較明顯，由原液A1中的0.83 mg/g增加到C1中的2.43 mg/g。酒石酸和富馬酸的含量變化不明顯，而其他有機酸經(jīng)過不同處理后含量變化沒有明顯規(guī)律性，但是有機酸對食品的酸味起到重要的作用，因此有機酸含量增加，其樣品的酸味感有可能會增加。對比4 組樣品閃式高速提取器處理前后的有機酸含量變化可知，除經(jīng)過閃式高速提取處理后的原液略有降低外，其他3 組經(jīng)過閃式高速提取處理后都呈現(xiàn)一定程度的增加趨勢。

2.4 不同處理方式對灰樹花游離氨基酸含量的影響

表4 不同處理方式條件下灰樹花提取液中游離氨基酸含量Table 4 Free amino acid contents in Grifola frondosa extracts obtained by different extraction methods

游離氨基酸是食用菌中重要的鮮味活性物質(zhì)。除了色氨酸未檢測出，其余17 種氨基酸都能檢測到，結(jié)果見表4。從游離氨基酸總量上看，兩種酶解作用后的游離氨基酸總量都呈現(xiàn)顯著性增加，尤其復(fù)合酶酶解處理的樣品，其總量由118.70 mg/100 g增加到221.60 mg/100 g，其原因可能是復(fù)合酶是分步酶解，這使得灰樹花蛋白在酶解過程中充分釋放氨基酸。相反，高壓蒸煮處理的樣品其游離氨基酸總量出現(xiàn)顯著性下降，這與前述的可溶性糖含量降低的結(jié)果相吻合，可能是由于美拉德反應(yīng)的發(fā)生所導(dǎo)致。從各個氨基酸的變化可以看出，除蛋氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸外，所有的氨基酸含量在高壓蒸煮過程中均降低，很多研究報道它們都是參與美拉德反應(yīng)產(chǎn)生呈味物質(zhì)的重要前體物[23]；其中天冬氨酸和谷氨酸是灰樹花中主要的呈鮮物質(zhì)，它們在兩種酶解處理中都顯著性增加，且復(fù)合酶酶解處理的樣品增加量最多。

由表4可知，在經(jīng)過閃式高速提取器處理后，盡管2 組酶解樣品游離氨基酸總量有所增加，但是B2和C2中的游離氨基酸含量都低于A2，原因可能是經(jīng)過閃式提取之后再進行酶解反應(yīng)會導(dǎo)致一些氨基酸的損失，例如絲氨酸、甘氨酸和纈氨酸等；而呈鮮味、甜味的氨基酸含量有所增加，例如天冬氨酸、谷氨酸、蘇氨酸和丙氨酸。因此，閃式高速提取器處理不利于游離氨基酸的釋放，或需要進行閃式高速提取優(yōu)化后再繼續(xù)進行。

根據(jù)氨基酸的呈味特性，將其分為鮮味、甜味、苦味以及無味4 種。其中各氨基酸按呈味特性分類如下，鮮味：Asp＋Glu；甜味：Thr＋Ser＋Gly＋Ala＋Pro；苦味：Val＋Met＋Ile＋Leu＋Phe＋His＋Arg；無味：Cys＋Tyr＋Lys，分別計算其含量，結(jié)果如表5所示。

表5 不同處理方式條件下灰樹花提取液中游離氨基酸分類及含量Table 5 Free amino acid composition in Grifola frondosa extracts obtained by different extraction methods

谷氨酸與食鹽結(jié)合形成的L-谷氨酸鈉是鮮味的代表物質(zhì)，也是味精的主要成分，雖然天冬氨酸鈉鹽的鮮味程度低于L-谷氨酸鈉10%[24]，但是仍具有明顯的鮮味，通常把天冬氨酸和谷氨酸均歸類為鮮味氨基酸。由表4可知，天冬氨酸和谷氨酸的總量約占游離氨基酸總量的20%左右。由表5可以看出，復(fù)合酶酶解處理的鮮味氨基酸、甜味氨基酸以及苦味氨基酸含量較其他處理增加更明顯，但閃式高速提取處理不利于鮮味氨基酸的生成。

2.5 不同處理方式對灰樹花肽分子質(zhì)量分布的影響

表6 不同處理方式條件下灰樹花提取液的分子質(zhì)量分布Table 6 Molecular mass distribution of Grifola frondosa extracts obtained by different extraction methods

由表6可以明顯看出，不同提取方法得到的制備液中不同分子質(zhì)量組分的肽分布明顯不同。和原液相比，酶解作用后，小于1 000 Da組分的含量增加，這是因為酶解條件充分使得大分子分解成小分子，而高壓蒸煮處理樣品中小于500 Da組分含量降低，但是500～1 000 Da的肽分布含量顯著性高于其余3 組，可能是由于高壓蒸煮使得蛋白質(zhì)大分子降解為肽的能力可能小于酶的作用。氨基酸的分子質(zhì)量都小于500 Da，即3 種不同提取方法處理后，氨基酸的含量都有增加，兩種酶解處理液增加最為明顯，這與游離氨基酸的分析結(jié)果一致。食用菌味道鮮美是源于其含有許多鮮味物質(zhì)，呈味肽就是一類重要的風(fēng)味物質(zhì)，呈味肽是一類分子質(zhì)量小于3 000 Da的寡肽[25]，這類肽組分可與舌頭味蕾上某一味道的特異性受體相互作用，呈現(xiàn)特征滋味[26]。由表6可以看出，兩種酶解制備液中，小于3 000 Da的組分含量最多，分別占98.15%和98.17%，說明酶解制備液最有可能獲得呈味肽。

而經(jīng)過閃式高速提取器的處理后，小于3 000 Da的組分含量反而減少，可能是當(dāng)水作為溶劑時會因為水溶的成分太多導(dǎo)致樣品的黏稠性增大，發(fā)生混懸、乳化等情況，造成過濾困難，同時根據(jù)閃式高速提取器的原理，在轉(zhuǎn)頭高速轉(zhuǎn)動下和超聲情況下，容易產(chǎn)生熱量，使得局部溫度升高、環(huán)境變劣，導(dǎo)致小分子的肽損失，所以小分子的肽經(jīng)過閃式提取處理之后會出現(xiàn)含量降低現(xiàn)象。

2.6 灰樹花呈味物質(zhì)的呈味特性分析

2.6.1 基于電子舌檢測的PCA

PCA可以在沒有任何樣品信息的條件下，迅速瀏覽所有數(shù)據(jù)，找出它們之間的相關(guān)性，建立一個合理的模型[27-29]。本研究對不同處理方式的樣品進行電子舌分析，將得到的數(shù)據(jù)進行PCA，由于兩個主成分累積貢獻率為87%（超過70%），前2 個主成分已經(jīng)包含了幾乎全部的信息，能夠反映樣品的整體信息，能夠清楚地顯示出判定結(jié)果，說明主成分之間的獨立性較強，因此只建立了PC1-PC2的二維判別圖。由圖1可知，8 個樣品明顯被分為3 類，A2、B2、C2和D2位于最左側(cè)，B1、C1和D1位于最右側(cè)，A1位于中上部，這說明閃式高速提取器處理對于灰樹花的呈味特性有明顯影響，原液A1也與處理后的樣品味道呈現(xiàn)明顯差異。A2位于最左側(cè)，D1位于最右側(cè)，說明A2和D1味道差異最大。B1和D1的距離很近，說明食用菌水解酶酶解處理和高壓蒸煮處理的灰樹花味道在有些方面更為接近，與原液和復(fù)合酶酶解處理差異比較大。

圖1 基于灰樹花呈味物質(zhì)電子舌檢測分析的PCA圖Fig. 1 PCA plot of Grifola frondosa extracts based on electronic tongue data

2.6.2 基于呈味物質(zhì)含量檢測的PCA分析

以8 個樣品中可溶性糖、有機酸和游離氨基酸的含量為變量，采用數(shù)理統(tǒng)計方法將樣品進行PCA分析。由于兩個主成分累積貢獻率為82%（超過70%），前2 個主成分已經(jīng)包含了幾乎全部的信息，能夠反映樣品的整體信息，能夠清楚地顯示出判定結(jié)果，說明主成分之間的獨立性較強，因此只建立了PC1-PC2的二維判別圖。由圖2可知，樣品D位于PC1的右側(cè)，其余樣品都在PC1左側(cè)，說明高壓蒸煮下處理的樣品與其他方式處理的樣品在呈味物質(zhì)的釋放方面存在明顯差異。同時還可以看出，樣品B和C距離比較接近，與樣品A相差較遠，說明酶解處理后的樣品在呈味物質(zhì)釋放上比較相似，而與原液明顯不同。由于樣品中呈味物質(zhì)分析僅給出含量的差異，體現(xiàn)在味感上面更加復(fù)雜，而電子舌可以給出酸、甜、鮮、苦、咸和復(fù)合口感，所以二者的PCA分析存在差異。但綜合圖1、2的分析可以得出，無論酶解還是高壓蒸煮處理，味感及呈味物質(zhì)都與原樣存在明顯差異，閃式高速提取處理后其味感及呈味物質(zhì)也發(fā)生了明顯改變。

3 結(jié) 論

經(jīng)過食用菌水解酶酶解、復(fù)合酶酶解和高壓蒸煮3 種不同提取方法獲得的制備液，呈味物質(zhì)都有一定的變化，3 種不同的提取方法對灰樹花呈味物質(zhì)釋放的影響不盡相同。

研究結(jié)果表明，和原液相比，所有處理方式的樣品可溶性糖總量都顯著性降低，尤其采用閃高速提取處理后的高壓蒸煮制備液。從有機酸含量變化來看，酶解處理和高壓蒸煮處理的樣品有機酸總量都顯著性增加；對比4 組樣品閃式高速提取器處理前后的有機酸含量變化可知，除原液經(jīng)過閃式高速提取處理后略有降低外，其他3 組經(jīng)過閃式高速提取處理后都呈現(xiàn)一定程度的增加。從游離氨基酸總量上看，兩種酶解作用后的樣品游離氨基酸總量都顯著性增加，尤其復(fù)合酶酶解處理的樣品。相反，高壓蒸煮處理的樣品游離氨基酸總量顯著性下降，可能是由于美拉德反應(yīng)所導(dǎo)致。在經(jīng)過閃式高速提取器處理后，盡管兩組酶解樣品氨基酸總量有所增加，但是和經(jīng)過閃式高速提取器處理的原液相比仍然較低，因此，閃式高速提取器處理不利于游離游離氨基酸的釋放，或需要進行閃式高速提取優(yōu)化后再繼續(xù)進行。由氨基酸分類及含量變化可以看出，閃式高速提取處理不利于鮮味氨基酸的保留。PCA分析發(fā)現(xiàn)無論酶解還是高壓蒸煮處理，味感及呈味物質(zhì)都與原樣存在明顯差異，同時閃式高速提取處理后其味感及呈味物質(zhì)也發(fā)生了明顯改變。

總之，本實驗通過系統(tǒng)研究不同提取方法對灰樹花中呈味物質(zhì)釋放的影響，對灰樹花呈味深加工產(chǎn)品的開發(fā)提供了一定的理論參考。