富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌群體感應(yīng)現(xiàn)象及其腐敗活性的抑制作用

孫曉佳，李婷婷*，赫彬彬，梅永超，王當(dāng)豐，謝 晶，勵(lì)建榮,*

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧省高等學(xué)校生鮮食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，遼寧 錦州 121013；2.大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧 大連 116600；3.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

群體感應(yīng)（quorum sensing，QS）是一種細(xì)菌間信息交流的通訊系統(tǒng)，細(xì)菌通過自身合成并釋放信號(hào)分子感知環(huán)境變化，當(dāng)信號(hào)分子濃度達(dá)到一定閾值時(shí)開啟細(xì)胞密度依賴的特定基因表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控細(xì)菌的生物行為，如生物發(fā)光、生物被膜形成、毒力因子表達(dá)及浮游等[1-2]。微生物的生長(zhǎng)代謝是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的主要原因之一，其QS機(jī)制在水產(chǎn)品的腐敗過程中起著至關(guān)重要的作用。本實(shí)驗(yàn)室從腐敗大菱鲆中分離得到一株熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens，PF），作為水產(chǎn)品低溫貯藏過程中的優(yōu)勢(shì)腐敗菌（specific spoilage organism，SSO），其腐敗特性受N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（N-acyl-homoserine lactone，AHLs）介導(dǎo)的QS調(diào)控[3-5]。

群體感應(yīng)抑制劑（quorum sensing inhibitors，QSIs）指對(duì)細(xì)菌間信息交流具有阻礙作用，能干擾或抑制QS現(xiàn)象，且對(duì)細(xì)菌正常生命活動(dòng)不造成破壞的物質(zhì)[6]。其作用機(jī)制主要有以下3 種途徑[7-9]：干擾信號(hào)分子合成，如抑制信號(hào)分子合成酶活性或消除底物等合成過程；降解信號(hào)分子，使之無法達(dá)到發(fā)揮調(diào)控作用的閾值濃度；產(chǎn)生信號(hào)分子類似物與受體蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。因此，利用QSI干擾細(xì)菌QS系統(tǒng)、降低腐敗菌致腐能力成為新的研究方向。研究發(fā)現(xiàn)阿魏精油作為一種新型的QSI可顯著抑制紫色桿菌的QS現(xiàn)象[10]。Chow等[11]報(bào)道了水楊酸對(duì)熒光假單胞菌QS現(xiàn)象具有抑制作用，可有效降低其毒力效應(yīng)。目前已從藥用植物、果蔬、海洋藻類中分離出具有抑制QS的天然活性物質(zhì)，但其提取率低且操作繁瑣，未得到廣泛應(yīng)用。而從現(xiàn)有食品添加劑中篩選QSI，具有成本低廉、便于合成、安全性較高等優(yōu)點(diǎn)。

富馬酸鈉又稱富馬酸一鈉，易溶于水，常作為食品添加劑用于配制酒、飲料、罐頭和果凍等產(chǎn)品，是一種較安全的酸味劑。一些研究表明其具有良好的抗氧化、抑菌作用。在魚、貝類罐頭中添加富馬酸鈉可有效防止其黑變[12]；肖爾卿等[13]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過富馬酸鈉與超高壓協(xié)同處理使草莓汁中H2S含量顯著減少；此外，富馬酸鈉對(duì)腌制蔬菜中的腐敗菌具有較強(qiáng)的抑制作用[14]。但目前，關(guān)于富馬酸鈉的研究主要集中在其作為食品添加劑改善食品風(fēng)味方面，而作為QSI的研究卻鮮有報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)以富馬酸鈉為研究對(duì)象，探究富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌QS現(xiàn)象的抑制效果，以期拓寬富馬酸鈉的應(yīng)用范圍，為新型水產(chǎn)品防腐保鮮劑的研發(fā)提供新思路，豐富水產(chǎn)品保鮮理論。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

熒光假單胞菌分離自腐敗大菱鲆，由渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院保藏。紫色桿菌CV026（Chromobacterium violaceum CV026）為C. violaceum ATCC 31532的mini-Tn5突變體，自身不產(chǎn)AHLs。當(dāng)存在外源AHLs時(shí)，可產(chǎn)生特征性紫色菌素，對(duì)?；鶄?cè)鏈長(zhǎng)度為C4～C8的AHLs敏感程度不同，具有卡那霉素抗性，活化時(shí)需添加20 μg/mL卡那霉素，由渤海大學(xué)食品科學(xué)研究院保藏。

富馬酸鈉 北京索萊寶生物科技有限公司；LB肉湯青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；甲醇 天津市津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；乙酸乙酯、正丁醇、醋酸異戊酯、十二烷基硫酸鈉 天津永晟精細(xì)化工有限公司；結(jié)晶紫 天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；卡那霉素、6 種AHLs信號(hào)分子標(biāo)準(zhǔn)品（C4-HSL、C6-HSL、C8-HSL、C10-HSL、C12-HSL、C14-HSL） 美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Biofuge Stratos臺(tái)式高速離心機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司；MLS-3030CH立式壓力滅菌鍋廣州三洋電機(jī)有限公司；MS105UD電子分析天平瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；imark酶標(biāo)儀美國(guó)Bio-Rad公司；80i顯微鏡 日本尼康公司；7890N/5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）儀 美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 富馬酸鈉的最小抑菌濃度測(cè)定及QS抑制活性的初篩

參考Diao Wenrui等[15]的方法，將報(bào)告菌株CV026和熒光假單胞菌過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（106CFU/mL），按體積比1∶100接種于LB肉湯中，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)至OD595nm為1左右，用牛津杯打孔，加入不同質(zhì)量濃度梯度（1.0～10.0 mg/mL）的富馬酸鈉，以無菌去離子水為空白對(duì)照，28 ℃靜置培養(yǎng)24～48 h后，觀察菌株生長(zhǎng)情況。

報(bào)告菌株CV026過夜活化后，按體積比1∶100接種于LB肉湯中，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)至OD595nm為1左右，與100 mL含有20 μg/mL C6-HSL信號(hào)分子的LB營(yíng)養(yǎng)瓊脂混勻，用牛津杯打孔，加入200 μL質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL的富馬酸鈉，以無菌去離子水為空白對(duì)照，28 ℃靜置培養(yǎng)24～48 h，觀察紫色菌素的產(chǎn)生情況。

1.3.2 富馬酸鈉對(duì)紫色菌素產(chǎn)生及紫色桿菌生長(zhǎng)的影響

參照Kato等[16]方法并稍作修改，將過夜活化后的報(bào)告菌株CV026按體積比1∶100接種于LB肉湯中，加入終質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL的富馬酸鈉，并添加20 μg/mL的C6-HSL信號(hào)分子，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)至OD595nm為1左右。取300 μL菌液于無菌離心管中，加入150 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫酸鈉，振蕩10 s，加入600 μL正丁醇，振蕩5 s，10 000 r/min離心5 min，取上清液200 μL加入96 孔板中，于595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，以無菌去離子水為空白對(duì)照。同時(shí)，為確定富馬酸鈉對(duì)CV026菌株生長(zhǎng)能力的影響，以不加信號(hào)分子的實(shí)驗(yàn)組作為對(duì)照，其余步驟同上。

1.3.3 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌生物被膜的影響

1.3.3.1 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形成量的影響

根據(jù)Rode等[17]方法將熒光假單胞菌過夜培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期（106CFU/mL），按體積比1∶100接種于LB肉湯中，分裝至無菌離心管，每管1 mL，加入富馬酸鈉使其終質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL，以無菌去離子水為陰性對(duì)照，以20 μg/mL C6-HSL為陽(yáng)性對(duì)照，每組3 次重復(fù)，28 ℃靜置培養(yǎng)48 h。待菌液密度測(cè)定結(jié)束后，傾倒菌液，無菌水漂洗浮游菌3～5 次，無菌風(fēng)干燥35 min，0.001 g/mL結(jié)晶紫溶液染色15 min，無菌水沖洗5～7 次，加入體積分?jǐn)?shù)33%冰醋酸充分溶解，取200 μL于96 孔板中，在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值。按下式計(jì)算生物被膜形成率。

式中：ODcontrol為陰性對(duì)照組測(cè)得生物被膜的OD595nm；ODQSI為抑制劑處理組的OD595nm。

1.3.3.2 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形態(tài)的影響

載玻片（25.4 mm×76.2 mm，厚度1～2 mm）預(yù)處理：將載玻片清洗干凈，分別于無水乙醇中超聲30 min，去離子水中超聲30 min，烘干后滅菌備用。

將過夜活化后的熒光假單胞菌按體積比1∶100接種于LB肉湯中，取10 mL菌液加入無菌培養(yǎng)皿中，加入富馬酸鈉使其終質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL，將處理后的載玻片浸沒其中，28 ℃培養(yǎng)72 h。同時(shí)，以不添加富馬酸鈉為陰性對(duì)照組，添加C6-HSL信號(hào)分子為陽(yáng)性對(duì)照組。取出載玻片后，無菌水漂洗3～5 次，適量甲醇固定15 min，0.02 g/mL結(jié)晶紫染色5 min，無菌水沖洗5～7 次，無菌風(fēng)干燥固定，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照記錄。

1.3.4 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌群集和泳動(dòng)的影響

參考Zhang Juanmei等[18]方法制備群集與泳動(dòng)培養(yǎng)基，將不同質(zhì)量濃度的富馬酸鈉經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，加入培養(yǎng)基混勻使其終質(zhì)量濃度為0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL。取5 μL過夜活化的熒光假單胞菌菌懸液加入平板中央，待菌液吸收后28 ℃靜置培養(yǎng)48 h，以不添加富馬酸鈉為陰性對(duì)照，添加C6-HSL信號(hào)分子為陽(yáng)性對(duì)照，每組3 次重復(fù)，期間觀察熒光假單胞菌的遷移情況。1.3.5 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性的影響

根據(jù)Ponnuswamy等[19]的方法并稍作修改，按1.3.3節(jié)方法制備含有不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL）富馬酸鈉過夜活化后的熒光假單胞菌菌懸液，制作脫脂奶瓊脂平板，用牛津杯打孔，取200 μL菌液加入孔內(nèi)，28 ℃靜置培養(yǎng)18～24 h，期間觀察其水解圈直徑。以不添加富馬酸鈉為陰性對(duì)照，以添加C6-HSL信號(hào)分子為陽(yáng)性對(duì)照，每組3 次重復(fù)。熒光假單胞菌在生長(zhǎng)過程中分泌胞外蛋白酶，使孔徑周圍出現(xiàn)明顯的水解圈，水解圈直徑的大小表示蛋白酶活性的高低。

1.3.6 GC-MS測(cè)定富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌分泌AHLs的影響

將過夜活化后的熒光假單胞菌按體積比1∶100接種于LB肉湯中，加入富馬酸鈉，使其終質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL，以不添加富馬酸鈉為陰性對(duì)照，添加C6-HSL信號(hào)分子為陽(yáng)性對(duì)照，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)后的菌液10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入等量含體積分?jǐn)?shù)0.1%冰乙酸的乙酸乙酯，得有機(jī)相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)蒸干溶劑，條件設(shè)置為溫度35 ℃、真空度0.1 MPa，加入適量甲醇溶解，將所得AHLs粗提液于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以甲醇為溶劑制備含有6 種AHLs標(biāo)準(zhǔn)品的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，由GC-MS檢測(cè)確定各種標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間。參考趙愛飛等[20]的方法設(shè)置GC-MS條件。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

每組實(shí)驗(yàn)均設(shè)有3 個(gè)平行，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，Origin 8.5軟件進(jìn)行繪圖處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 富馬酸鈉的最小抑菌濃度測(cè)定及QS抑制活性初篩結(jié)果

采用平板法觀察富馬酸鈉質(zhì)量濃度為1.0～10.0 mg/mL時(shí)CV026菌株的生長(zhǎng)情況，確定了富馬酸鈉對(duì)CV026菌株的最小抑菌濃度為3.0 mg/mL。同時(shí)，相同質(zhì)量濃度的富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌不具有抑制作用（圖1A）。因此，選取亞抑菌濃度，即3.0 mg/mL以下質(zhì)量濃度的富馬酸鈉進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度設(shè)為0.5、1.0、1.5 mg/mL和2.0 mg/mL。圖1B為亞抑菌濃度下富馬酸鈉對(duì)CV026菌株QS活性的抑制效果，添加富馬酸鈉的孔徑周圍有乳白色、不透明的抑制圈出現(xiàn)，說明富馬酸鈉可以抑制CV026菌株特征性紫色菌素的產(chǎn)生。

圖1 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌生長(zhǎng)（A）及紫色桿菌CV026產(chǎn)紫色菌素能力（B）的抑制活性Fig. 1 Inhibitory effect of sodium fumarate on growth of Pseudomonas fluorescens (A) and violacein production of CV026 strains (B)

2.2 富馬酸鈉對(duì)紫色菌素產(chǎn)生及紫色桿菌生長(zhǎng)的影響

圖2 不同質(zhì)量濃度富馬酸鈉對(duì)CV026菌株紫色菌素產(chǎn)量和菌液密度的影響Fig. 2 Effect of sodium fumarate on violacein production and bacterial density of CV026

由圖2可見，富馬酸鈉對(duì)CV026菌株QS現(xiàn)象的抑制效果。當(dāng)富馬酸鈉質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，與對(duì)照組相比其紫色菌素產(chǎn)量明顯降低，其抑制率達(dá)50.95%；此外，隨著富馬酸鈉質(zhì)量濃度逐漸增大，CV026菌株的菌液密度呈平穩(wěn)狀態(tài)，說明其對(duì)CV026菌株的生長(zhǎng)代謝能力沒有影響。由此可知，不同質(zhì)量濃度的富馬酸鈉通過干擾細(xì)菌的QS系統(tǒng)，使得在C6-HSL信號(hào)分子存在的情況下，其紫色菌素的產(chǎn)生受到不同程度的抑制，且隨其質(zhì)量濃度增加，這種抑制能力逐漸增強(qiáng)。

2.3 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌生物被膜的影響

2.3.1 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形成量的影響

生物被膜指附著在接觸物表面的細(xì)菌利用自身分泌多糖、纖維蛋白和脂蛋白等物質(zhì)將菌體包裹形成的一種聚集狀膜樣物[21-22]。作為細(xì)菌保護(hù)自身的生長(zhǎng)方式，其對(duì)環(huán)境變化的耐受力遠(yuǎn)高于浮游菌，一旦在食品加工設(shè)備表面形成后極易對(duì)食品造成嚴(yán)重污染[23]。研究表明，由AHLs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)對(duì)假單胞菌生物膜形成、附著及固定具有重要作用[24]。Zhang Ying等[25]報(bào)道了百里酚和水楊酸對(duì)熒光假單胞菌QS現(xiàn)象及生物被膜形成有較好的抑制效果。因此，本實(shí)驗(yàn)探究不同質(zhì)量濃度富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌生物被膜的抑制作用。如圖3所示，當(dāng)富馬酸鈉質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，其生物被膜形成率降低至31.82%；質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，其生物被膜形成率為84.05%，與陰性對(duì)照組相比均能抑制該菌生物膜的形成；而添加外源C6-HSL信號(hào)分子可促進(jìn)其生物被膜形成。這表明，富馬酸鈉可能通過干擾AHLs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)來抑制生物被膜的形成，且不影響其生長(zhǎng)，與Zhang Ying等[25]的研究結(jié)果相符合。

圖3 不同質(zhì)量濃度富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形成率的影響Fig. 3 Effect of sodium fumarate on biofilm formation rate of Pseudomonas fluorescens

2.3.2 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形態(tài)的影響

由圖4可見，陰性對(duì)照組有大量菌體相連形成密集的紫色膜狀結(jié)構(gòu)，且陽(yáng)性對(duì)照組有局部菌體聚集成具有層次感的深紫色團(tuán)狀結(jié)構(gòu)；而處理組隨富馬酸鈉質(zhì)量濃度增加菌體數(shù)量明顯減少，部分菌體相連，呈稀疏的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。這說明富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌生物被膜形成具有抑制作用，由此推測(cè)富馬酸鈉可能干擾了菌體聚集，從而減少細(xì)菌微菌落和生物被膜的形成。

圖4 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌生物被膜影響的光學(xué)顯微鏡圖（×10）Fig. 4 Optical microscopic images showing the effect of sodium fumarate on biofilm formation of Pseudomonas fluorescens (× 10)

2.4 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌群集與泳動(dòng)的影響

群集與泳動(dòng)是由細(xì)菌鞭毛介導(dǎo)的兩種遷移方式[26]，其不同之處在于前者是群體行為，指細(xì)菌在液體培養(yǎng)基內(nèi)或固體培養(yǎng)基表面的遷移情況，后者則是一種個(gè)體行為，指在固體培養(yǎng)基表面或半固體培養(yǎng)基上的遷移情況[27]。細(xì)菌鞭毛介導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)特性與初期黏附至宿主表面及沿著表面的遷移相關(guān)聯(lián)，并且其在后期形成生物被膜的過程中起關(guān)鍵作用[28]。圖5為不同質(zhì)量濃度富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌群集與泳動(dòng)的抑制效果，與陰性對(duì)照組相比，陽(yáng)性對(duì)照組運(yùn)動(dòng)性顯著增強(qiáng)，這表明外源AHLs可以促進(jìn)該菌群集和泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)特性。隨著富馬酸鈉質(zhì)量濃度的增加，其遷移能力呈濃度依賴性下降。這與上述富馬酸鈉對(duì)該菌生物被膜的抑制作用呈現(xiàn)出一定相關(guān)性，推測(cè)富馬酸鈉可能干擾了熒光假單胞菌黏附至接觸面的能力，從而減少生物被膜的形成。研究表明，肉桂醛能通過影響銅綠假單胞菌的群集和泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)性來減少生物被膜形成[29]。Lou Zaixiang等[30]也發(fā)現(xiàn)牛蒡葉成分可以減弱銅綠假單胞菌的群集運(yùn)動(dòng)能力，從而達(dá)到抑制生物被膜形成的目的，與本研究結(jié)果相似。

圖5 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌群集、泳動(dòng)運(yùn)動(dòng)的影響Fig. 5 Effect of sodium fumarate on swarming and swimming motility of Pseudomonas fluorescens

2.5 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性的影響

熒光假單胞菌可利用自身分泌的胞外蛋白酶將水產(chǎn)品中蛋白質(zhì)及游離氨基酸等物質(zhì)降解，產(chǎn)生多種腐敗代謝物以促進(jìn)菌體生長(zhǎng)代謝，進(jìn)而使水產(chǎn)品風(fēng)味和品質(zhì)發(fā)生劣變[31]。相關(guān)研究表明，熒光假單胞菌所分泌的胞外蛋白酶受AHLs介導(dǎo)的QS系統(tǒng)調(diào)控[32]。Lokender等[33]發(fā)現(xiàn)姜油酮能通過干擾信號(hào)分子受體蛋白來抑制銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)，從而降低蛋白酶活性。因此，本實(shí)驗(yàn)探究不同質(zhì)量濃度富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性的抑制作用。圖6、7顯示了富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性的影響。結(jié)果表明，富馬酸鈉對(duì)該菌蛋白酶活性具有明顯抑制作用，呈濃度依賴性增強(qiáng)；且外源C6-HSL信號(hào)分子的添加刺激該菌分泌AHLs，增強(qiáng)其蛋白酶活性，因此陽(yáng)性對(duì)照組的水解圈直徑最大，達(dá)21.09 mm，與Lokender等[33]報(bào)道的結(jié)果一致。

圖6 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性的影響Fig. 6 Effect of sodium fumarate on extracellular protease activity of Pseudomonas fluorescens

圖7 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌胞外蛋白酶活性的影響Fig. 7 Effect of sodium fumarate on extracellular protease activity of Pseudomonas fluorescens

2.6 GC-MS定量分析富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌分泌AHLs的影響

由圖8可知，6 種AHLs（C4-HSL～C14-HSL）的混合標(biāo)準(zhǔn)品完全分離，峰形尖銳且對(duì)稱，其相應(yīng)的保留時(shí)間依次為4.408、6.254、8.305、10.685、13.374、16.882 min。由于菌株的生長(zhǎng)時(shí)間不同，所分泌的信號(hào)分子含量也有所差異，0～4 h為菌株生長(zhǎng)的遲滯期，4～24 h進(jìn)入到對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期。如圖9所示，在相同培養(yǎng)時(shí)間條件（12 h）下，熒光假單胞菌分泌量較高的信號(hào)分子為C4-HSL、C6-HSL和C8-HSL。隨富馬酸鈉質(zhì)量濃度逐漸增加，各AHLs的峰面積均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，表明富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌AHLs的分泌具有較好的抑制效果，推測(cè)富馬酸鈉可以作為QSI降低QS信號(hào)分子的活性。

圖8 AHLs混合標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS圖Fig. 8 GC-MS graph of AHLs mixed with the standard

圖9 富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌產(chǎn)AHLs的影響Fig. 9 Effect of sodium fumarate on the secretion of AHLs from Pseudomonas fluorescens

3 結(jié) 論

目前，以天然QSI或QSI類似物為靶點(diǎn)來干擾或阻斷QS系統(tǒng)已成為近年來的研究熱點(diǎn)。本研究以富馬酸鈉為研究對(duì)象，利用報(bào)告菌株CV026來驗(yàn)證亞抑菌濃度下富馬酸鈉的QS抑制活性，探究了富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌QS現(xiàn)象及其腐敗活性的抑制作用。結(jié)果表明，富馬酸鈉在不影響細(xì)菌生長(zhǎng)能力條件下明顯抑制了CV026菌株紫色菌素的產(chǎn)生，當(dāng)質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí)，與對(duì)照組相比其抑制率達(dá)50.95%；且在該質(zhì)量濃度下，熒光假單胞菌生物被膜形成率降低至31.82%。因此，推測(cè)富馬酸鈉可能通過干擾熒光假單胞菌QS系統(tǒng)對(duì)其生物被膜、胞外蛋白酶、群集與泳動(dòng)等相關(guān)腐敗特性進(jìn)行抑制，且隨著質(zhì)量濃度增加其抑制能力增強(qiáng)。此外，由GC-MS檢測(cè)結(jié)果可知，富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌AHLs的分泌有較好的抑制效果。由此說明，富馬酸鈉具有較強(qiáng)的QS抑制活性，可作為新型的QSI用于延長(zhǎng)水產(chǎn)品貨架期。本實(shí)驗(yàn)主要研究了富馬酸鈉對(duì)熒光假單胞菌QS現(xiàn)象及腐敗特性的影響，其作用機(jī)制未明確。下一步可利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)，從分子層面明晰富馬酸鈉的抑制機(jī)理。