麥冬皂苷D誘導(dǎo)十二指腸平滑肌舒張作用及機(jī)制

張建武 孫浪 劉鑫 羅林 李春臣 羅濤 梅雪

(川北醫(yī)學(xué)院 1藥學(xué)院，四川 南充 637100；2麻醉系；3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機(jī)能中心)

麥冬皂苷(OP)D對(duì)心腦血管和肝、肺具有保護(hù)作用，在抗衰老，抗腫瘤，抗炎，提高免疫和鎮(zhèn)咳祛痰等多方面發(fā)揮活性作用〔1〕。研究〔2，3〕表明OPD亦有降血糖的作用，臨床上常用于肺燥干咳，津傷口渴，陰虛癆嗽，喉痹咽痛，心煩失眠，內(nèi)熱消渴，而且可以用于腸燥便秘的治療〔4〕。臨床上對(duì)治療胃腸平滑肌過度收縮的藥物主要以西藥為主，如鈣離子通道阻斷藥硝苯地平和抗膽堿藥阿托品等，硝苯地平長(zhǎng)期使用可引起負(fù)性肌力和負(fù)性傳導(dǎo)，而阿托品由于其不良反應(yīng)較大，在臨床應(yīng)用中受到一定的限制，因此，開發(fā)有效防治胃腸平滑肌痙攣、低毒、低殘留的天然中草藥意義重大〔5〕。本試驗(yàn)以家兔離體十二指腸平滑肌為研究對(duì)象，研究OPD對(duì)兔離體十二指腸平滑肌收縮的影響，并使用不同的工具藥探討OPD對(duì)離體十二指腸平滑肌產(chǎn)生影響的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 任意性別的健康四川大白兔(2.5～3.0 kg)，由川北醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證編號(hào)SYXK(川)2013-076。

1.2藥物及試劑 OPD(成都曼斯特生物科技有限公司，純度99.60%，批號(hào)：MUST-17022004)；二甲基亞砜(DMSO，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：CAS67-68-5)；肝素(HP，成都市科華化工試劑廠，批號(hào)：CAS 9041-08-1)；釕紅(RR，源葉生物科技有限公司，批號(hào)：CAS11103-72-3)；左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME，碧云天生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)品批號(hào)：S0006)；鹽酸維拉帕米注射液(上海禾豐制藥有限公司，批號(hào)：43161001)。

1.3儀器 兔類通用實(shí)驗(yàn)器械；BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(四川成都泰盟公司)；FT-100生物張力傳感器(四川成都泰盟軟件有限公司)；HW-400E 恒溫平滑肌槽(四川成都泰盟科技有限公司)；優(yōu)普純水/超純水制造系統(tǒng)(四川優(yōu)普超純科技有限公司)。

1.4OPD溶液的配置 稱取OPD 0.1 mg，先加1 ml DMSO充分溶解，再加入9 ml臺(tái)氏液，將其配成濃度為117 μmol/L的OPD溶液。

1.5家兔十二指腸平滑肌制備 取健康家兔，禁食24 h，用木槌猛擊兔頭枕部致死，迅速沿腹中線打開腹腔，每只家兔取十二指腸同一腸段，置于盛有室溫臺(tái)氏液的燒杯中，洗凈腸內(nèi)容物，之后將其剪成1～2 cm的腸管作為實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。

1.6腸管收縮活動(dòng)的記錄 打開 BL-420E生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，調(diào)零，定標(biāo)，在1通道輸入接口處連接張力換能器。調(diào)節(jié)恒溫平滑肌槽，使水溫保持在 (37±0.5)℃，將臺(tái)式液加入預(yù)管內(nèi)，藥物管加入18 ml臺(tái)氏液。將標(biāo)本一端固定于 L 型通氣鉤上，另一端連接張力換能器，持續(xù)通入混合氣體(95% O2+5% CO2)，每秒1～2個(gè)氣泡，標(biāo)準(zhǔn)負(fù)荷1 g，平衡1 h，待腸管運(yùn)動(dòng)穩(wěn)定后，開始進(jìn)行試驗(yàn)。

1.7OPD對(duì)小腸平滑肌的影響

1.7.1OPD對(duì)家兔離體十二指腸平滑肌收縮的影響 待腸管收縮穩(wěn)定達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求后，累積加入已配好的OPD使其終濃度分別達(dá)到0.65×10-6mol/L(低濃度組)、1.30×10-6mol/L(中濃度組)，1.95×10-6mol/L(高濃度組)，加藥間隔為8 min(每只腸管待其穩(wěn)定時(shí)開始加藥)，同時(shí)設(shè)置空白組，僅用含相同濃度DMSO的臺(tái)氏液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。觀察腸道運(yùn)動(dòng)曲線的變化，用區(qū)間測(cè)量法測(cè)量加藥前1 min和加藥后第8 min的腸道收縮數(shù)據(jù)(平均收縮力、收縮振幅和收縮頻率)。

1.7.2工具藥預(yù)處理后OPD對(duì)家兔離體十二指腸平滑肌收縮作用的影響 待腸管收縮曲線穩(wěn)定達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求后，分別加入RR 10 μmol/L(RR組)，HP 50 mg/L(HP組)，L-NAME 100 μmol/L(L-NAME組)，維拉帕米0.1 μmol/L(維拉帕米組)，均孵育15 min后，再累積加入OPD使其終濃度分別達(dá)到0.65×10-6、1.30×10-6、1.95×10-6mol/L，加藥間隔為8 min，記錄加入OPD后腸管收縮的相關(guān)數(shù)據(jù)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差。

2 結(jié) 果

2.1OPD對(duì)家兔離體十二指腸平滑肌收縮活動(dòng)的影響 加藥后與加藥前比較，低、中、高濃度組平均收縮力，中、高濃度組振幅均顯著降低(P<0.05,P<0.01)?？瞻捉M加藥前后各指標(biāo)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。低、中、高濃度組加藥前、后頻率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2RR、HP、L-NAME及維拉帕米預(yù)處理對(duì)OPD舒張十二指腸平滑肌的影響 與對(duì)照組比較，RR組及HP組平滑肌收縮力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。OPD 1.30×10-6mol/L及OPD 1.95×10-6mol/L時(shí)，與對(duì)照組比較，L-NAME組平滑肌收縮力均顯著升高(P<0.05,P<0.01)；OPD 0.65×10-6、1.30×10-6、1.95×10-6mol/L濃度時(shí)，與對(duì)照組比較，維拉帕米組平滑肌收縮力顯著降低(P<0.01)。見表2。

表1 OPD對(duì)家兔離體十二指腸平滑肌收縮活動(dòng)的影響

與加藥前比較：1)P<0.05，2)P<0.01

表2 各組平滑肌收縮力比較

與對(duì)照組比較：1)P<0.05，2)P<0.01

3 討 論

胃腸動(dòng)力紊亂性疾病(DGIM)、胃腸平滑肌功能紊亂、腸易激綜合征的診斷以運(yùn)動(dòng)檢測(cè)指標(biāo)為基礎(chǔ)，其運(yùn)動(dòng)障礙可以是胃腸本身的功能異常，也可能是其他系統(tǒng)疾病的結(jié)果。DGIM 患者往往存在著神經(jīng)或肌肉解剖異常或生化及神經(jīng)傳導(dǎo)異常及腸道測(cè)壓或腸道電活動(dòng)的異?！?〕。相關(guān)研究表明，小腸平滑肌毒蕈堿樣膽堿能受體平衡的變化、L-型鈣離子通道活力改變及Cajal間質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)和數(shù)量的改變?cè)谛∧c平滑肌功能紊亂發(fā)病機(jī)制中有重要意義，其中毒蕈堿樣膽堿能受體，M1 受體主要通過鳥苷酸結(jié)合蛋白(G)g作用于磷脂酸肌醇系統(tǒng)激活磷脂酶C，生成三磷酸肌醇(IP3)和二脂酰甘油(DAG)，從而引起平滑肌的收縮〔7〕。

Chen等〔8〕研究表明OPD可緩解高脂飲食誘導(dǎo)的代謝綜合征，并改變小鼠腸道微生物群的結(jié)構(gòu)，本實(shí)驗(yàn)采用了多種工具藥進(jìn)行實(shí)驗(yàn)機(jī)制的探究，其中HP可作用于IP3受體(IP3R)，IP3R 是廣泛存在于各種細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的一種鈣釋放通道家族。當(dāng)IP3R與 1，4，5 IP3和鈣離子兩種底物分子結(jié)合后，IP3R開放，鈣離子便從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)釋放到細(xì)胞質(zhì)中〔9〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OPD作用途徑與阻斷IP3R導(dǎo)致平滑肌收縮途徑無必然聯(lián)系。

雷諾定受體(RyR)是存在于肌細(xì)胞肌質(zhì)網(wǎng)和其他細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的胞內(nèi)鈣釋放通道之一，鈣離子集合后激活RyR1使通道在開放和關(guān)閉狀態(tài)隨機(jī)轉(zhuǎn)換；進(jìn)一步集合咖啡因則可將通道保持在開放狀態(tài)。Ryanodine 結(jié)合于孔道側(cè)壁，低濃度時(shí)可將通道鎖定在亞電導(dǎo)狀態(tài)(有部分離子流通過)，高濃度則阻斷離子的通過〔10〕。為此，本實(shí)驗(yàn)用RR預(yù)處理兔離體十二指腸平滑肌，結(jié)果表明Ryanodine與IP3R并未介導(dǎo)OPD對(duì)十二指腸平滑肌的舒張作用。

神經(jīng)遞質(zhì)一氧化氮(NO)通過激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶，使胞質(zhì)內(nèi)環(huán)磷鳥苷(cGMP)濃度增高，鈣離子濃度下降，誘導(dǎo)胃腸平滑肌的舒張〔11～13〕。本實(shí)驗(yàn)預(yù)先用L-NAME處理離體十二指腸平滑肌，結(jié)果表明OPD可能是通過激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶從而誘導(dǎo)了平滑肌的舒張。

Qian等〔14〕實(shí)驗(yàn)證明，OPD對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制是：穩(wěn)定線粒體膜電位，減少鈣離子內(nèi)流。此外，蔣鳳榮等〔15〕實(shí)驗(yàn)也證明OPD能穩(wěn)定線粒體膜電位，降低細(xì)胞通透性，防止鈣離子內(nèi)流增加，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免于凋亡。本實(shí)驗(yàn)用工具藥維拉帕米對(duì)離體小腸進(jìn)行預(yù)孵，其作用機(jī)制是阻滯外源性鈣離子經(jīng)L-型鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，降低胞內(nèi)的鈣離子濃度，而鈣離子是細(xì)胞內(nèi)重要的第二信使，高濃度的鈣離子可引起平滑肌收縮，低濃度鈣離子可引起平滑肌舒張〔16〕，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OPD可能是通過抑制細(xì)胞的外鈣內(nèi)流從而引起離體家兔十二指腸平滑肌的舒張作用。

綜上所述，OPD可濃度依賴性地抑制自發(fā)性腸平滑肌的收縮作用，作用機(jī)制可能為通過阻斷L-型鈣通道，抑制外鈣內(nèi)流最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，從而降低了平滑肌的收縮作用，此外，OPD也有可能是通過激活平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鳥苷酸環(huán)化酶從而誘導(dǎo)了平滑肌的舒張。