外源性c-di-GMP影響口腔變形鏈球菌生物膜形成

康佳 付甜 王一席 胡紅梅

(井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部 1口腔系,江西 吉安 343000；2組胚教研室)

齲病是在以細(xì)菌為主的多種因素的作用下發(fā)生的牙體硬組織慢性進(jìn)行性破壞疾病，變形鏈球菌是世界公認(rèn)的依賴于生物膜生存的主要致齲菌〔1〕，這種細(xì)菌因?yàn)槟苓m應(yīng)不斷變化的口腔微生物環(huán)境而成為牙菌斑的主要組成菌之一。它主要通過對(duì)牙面的黏附、凝聚形成牙菌斑生物膜，在生物膜的內(nèi)部充分利用碳水化合物產(chǎn)酸并具有一定的耐酸能力從而發(fā)揮致齲毒力〔2〕，使局部pH下降，從而造成牙釉質(zhì)脫礦，齲病病變過程開始。如果能夠抑制變形鏈球菌的生物膜形成，則可以在一定程度上降低或預(yù)防齲病的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)擬檢測(cè)外源性的環(huán)鳥苷二磷酸(c-di-GMP)對(duì)變形鏈球菌的生長(zhǎng)情況及生物膜形成能力的影響。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器 c-di-GMP(無內(nèi)毒素污染，生物學(xué)活性檢測(cè)，無菌，美國InvivoGen公司，產(chǎn)品編號(hào)：CGP-38-01)。溶于無內(nèi)毒素水中，制備成0.908 mmol/L儲(chǔ)存液，-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。厭氧培養(yǎng)箱(規(guī)格型號(hào)：Y9X-TT，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)。酶標(biāo)儀(Imark，上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司 )。

1.2方法

1.2.1變形鏈球菌的分離及培養(yǎng) 受試者用清水漱口，采用口鏡、探針從受試者全口牙間隙、齦緣，尤其是牙面齲壞部位取牙菌斑，取樣放置入磷酸鹽緩沖液(PBS)中，采用超聲震蕩5～10 s分離細(xì)菌和食物殘?jiān)?，吹打，形成懸濁液，采用接種環(huán)將菌液接種于液體腦心浸液肉湯瓊脂(BHI)固體平板中，畫線，37℃厭氧培養(yǎng)(90%N2，10%CO2)48 h，得到平板菌落形態(tài)(圖1)，采用接種環(huán)挑取菌落，接種至液體BHI培養(yǎng)基中，37℃厭氧培養(yǎng)(90%N2，10%CO2)24 h，得到渾濁菌懸液，取菌懸液進(jìn)行細(xì)菌涂片革蘭染色觀察細(xì)菌形態(tài)(圖2)。

箭頭所指白色菌落為變形鏈球菌圖1 臨床分離株在BHI培養(yǎng)基上的形態(tài)(×5)

1.2.2外源性c-di-GMP對(duì)變形鏈球菌生長(zhǎng)的影響 在 BHI肉湯培養(yǎng)基中接種變形鏈球菌，37℃厭氧條件下(90%N2、10%CO2)培養(yǎng)24 h，取適量菌懸液于新鮮配制的 BHI培養(yǎng)基中，使菌液初始濃度為106CFU/ml(通過計(jì)數(shù)確定 )，取樣10 ml，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各5 ml。實(shí)驗(yàn)組加入1 100 μl c-di-GMP，使得終濃度為 200 μmol，對(duì)照組加入等量生理鹽水，37℃厭氧培養(yǎng)(90%N2，10%CO2)8 h。并在0 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h時(shí)分別取適量菌液進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

圖2 革蘭染色變形鏈球菌(×400)

1.2.3外源性c-di-GMP對(duì)變形鏈球菌生物膜形成能力的研究 在BHI培養(yǎng)基中接種變形鏈球菌，按200 μl/孔將菌懸液轉(zhuǎn)入無菌的96孔酶標(biāo)板中，每組3孔，實(shí)驗(yàn)組使c-di-GMP 終濃度分別為0 μmol/L、2 μmol/L、20 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L，去除游離菌液，每孔用200 μl去離子水輕柔洗滌3～4次以去除未結(jié)合和結(jié)合疏松的細(xì)菌，然后將酶標(biāo)板倒置放置于吸水紙上使其干燥，逐一在每孔中加入50 μl 10 g/L的結(jié)晶紫溶液，室溫下染色15 min，使結(jié)合的細(xì)菌著色。吸去染色液用去離子水洗滌3～4次，洗凈染色液后自然干燥。然后每孔加入200 μl 95%乙醇顯色，使用酶標(biāo)儀在630 nm測(cè)定OD值。

1.3方法學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1c-di-GMP對(duì)變異鏈球菌生長(zhǎng)的影響 200 μmol/L的外源性c-di-GMP與等量的生理鹽水在對(duì)變形鏈球菌生長(zhǎng)率方面的影響沒有明顯不同，且在相同條件下培養(yǎng)24 h后，兩組之間細(xì)菌數(shù)量也沒有明顯差異(P>0.05)。見表1。

表1 兩組不同時(shí)間細(xì)菌數(shù)量比較

2.2不同濃度c-di-GMP對(duì)變形鏈球菌生物膜形成能力的影響 0 μmol/L、2 μmol/L、20 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L組c-di-GMP抑制率分別為：(0±0.000)%、(48±0.021)%、(82±0.004)%、(92±0.001)%、(86±0.002)%。200 μmol/L濃度組變形鏈球菌的生物膜形成能力達(dá)到最低，抑制率達(dá)到了92%。

3 討 論

變形鏈球菌通過形成細(xì)菌生物膜的形式定植在牙體表面，促進(jìn)細(xì)菌微生物的黏附，并利用口腔中的碳水化合物代謝產(chǎn)酸，造成釉質(zhì)脫礦，齲洞形成。研究發(fā)現(xiàn)c-di-GMP是存在于原核細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中一類新的第二信使，細(xì)菌以外的其他物種的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中不存在這種物質(zhì)〔3〕，c-di-GMP由1個(gè)磷酸二酯鍵連接兩分子的cGMP而成，它是細(xì)菌生存和代謝中的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子之一〔4〕。通過分析變形鏈球菌UA159基因組發(fā)現(xiàn)，在變形鏈球菌中存在一種與GGDEF結(jié)構(gòu)域相關(guān)的蛋白(AAN59731)〔5〕，該蛋白具有c-di-GMP信號(hào)分子作用〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)在幾種細(xì)菌的細(xì)胞內(nèi)均含有較低水平的c-di-GMP，大約每個(gè)細(xì)胞為0.6 pmol/mg，如果細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的c-di-GMP水平為生理量，則不會(huì)干擾三磷酸鳥苷(GTP)的代謝，因?yàn)镚TP的濃度是c-di-GMP的100倍〔7〕。但是，細(xì)胞內(nèi)c-di-GMP的濃度會(huì)受到GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域編碼蛋白過表達(dá)的影響〔8〕。高濃度的c-di-GMP在細(xì)菌中的作用可被精確的描述為c-di-GMP將細(xì)胞鎖定于一種無柄狀態(tài)，相反，低水平c-di-GMP刺激細(xì)胞游動(dòng)和群集運(yùn)動(dòng)〔9〕。由此看來c-di-GMP信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)控概念已經(jīng)很明確，并非所有細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生和多細(xì)胞行為都與c-di-GMP濃度增高有聯(lián)系。比如：群集移動(dòng)就是在c-di-GMP處于較低濃度時(shí)出現(xiàn)的，是一種依賴于細(xì)胞間相互作用的多細(xì)胞行為。c-di-GMP信號(hào)通路的這些調(diào)節(jié)方式提示該信號(hào)通路在個(gè)體細(xì)胞的形成中是不同的，主要依賴于細(xì)胞是否被埋入細(xì)胞外基質(zhì)或是否移動(dòng)。因此，在細(xì)胞周圍微環(huán)境中極小的變化就會(huì)引發(fā)c-di-GMP信號(hào)通路的發(fā)生。c-di-GMP信號(hào)通路的調(diào)節(jié)模式無論是在不相關(guān)菌屬還是在相關(guān)菌屬，或相似菌屬的個(gè)體菌株內(nèi)都有很高的變異性。細(xì)菌生物膜形成是齲病發(fā)生的前提條件，如果可以抑制變異鏈球菌生物膜形成，那就可以有效預(yù)防和控制齲病的發(fā)生和發(fā)展。目前去除牙菌斑生物膜的方法主要有機(jī)械措施，化學(xué)方法及光動(dòng)力療法和聲動(dòng)力療法，但是效果不是很好，在很大的程度上仍然不能抑制變形鏈球菌的生物膜形成。本實(shí)驗(yàn)通過使用外源性c-di-GMP對(duì)變形鏈球菌生物膜的形成進(jìn)行干擾，發(fā)現(xiàn)c-di-GMP對(duì)于生物膜形成有明顯的抑制作用。本研究結(jié)果表明外源性的c-di-GMP對(duì)于變異鏈球菌的生物膜形成具有抑制作用，且其濃度與抑制率在0～200 μmol/L呈正相關(guān)，具體的抑制機(jī)制還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究證明。