集束化療法對(duì)PI3K/Akt/GSK3-β介導(dǎo)的心肺復(fù)蘇兔心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制

張欣 劉鳳艷 梁建慶 杜雪洋 胡蓉 王鑫

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 1附屬醫(yī)院急診科，甘肅 蘭州 730000；2附屬醫(yī)院北院； 3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；4中醫(yī)臨床學(xué)院；5附屬醫(yī)院腫瘤科)

心搏驟停(CA)后綜合征(PCAS) 的本質(zhì)是缺血/再灌注損傷，可導(dǎo)致多數(shù)患者死亡或留下嚴(yán)重后遺癥。磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/糖原合成酶(GSK)-3β信號(hào)通路在PCAS中發(fā)揮著非常重要的保護(hù)作用〔1〕。本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建兔心肺復(fù)蘇(CPR)模型，研究集束化療法對(duì)CPR后模型兔血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)及PI3K/Akt/GSK-3β蛋白表達(dá)的變化，驗(yàn)證PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路是否是黃芪注射液治療PCAS的可能作用靶點(diǎn)，闡述該藥可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥物和試劑 肝素(天津生化制藥有限公司，6.25 kU/ml，批號(hào)H18030914)；鹽酸腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司，1 mg/ml，批號(hào)181108)；黃芪注射液(正大青春寶藥業(yè)有限公司，每支10 ml，相當(dāng)于原藥材20 g，批號(hào)1812062)；戊巴比妥鈉(上海中西藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)WS20180920)；氨基甲酸乙酯(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20180125)。抗PI3K抗體 (ab151549)、抗Akt抗體 (ab8805)、抗GSK3-β抗體(ab68476)，購自ABCAM公司。

1.2儀器設(shè)備 DHX-300動(dòng)物呼吸機(jī)、RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)、YP100型壓力傳感器、YPJ01型壓力換能器(成都儀器廠)；聚乙烯醫(yī)用塑料心臟導(dǎo)管、動(dòng)脈導(dǎo)管(成都泰盟科技有限公司，外徑2.0 mm，內(nèi)徑1.5 mm)；T形套管；家兔實(shí)驗(yàn)臺(tái)；常用實(shí)驗(yàn)器械一套；肛溫表；聯(lián)想微型計(jì)算機(jī)；健源注射泵(JZB-1800)；Biotek Synergy2多功能酶標(biāo)儀(美國基因有限公司)；高速冷凍離心機(jī)：Multifuge IS-R(德國THERMO公司)。

1.3動(dòng)物模型制備及分組〔1〕日本大耳白兔24只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，雌雄各半，動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK(甘)2015-0003，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所提供。實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)分為假手術(shù)組、腎上腺素組、亞低溫組及集束化治療組，每組6只。25%烏拉坦溶液4 ml/kg麻醉動(dòng)物(從兔耳緣靜脈直接注射，必要時(shí)可追加藥量)。無菌技術(shù)操作下切開氣管,T形套管插入，然后分離暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈、右側(cè)頸靜脈與左側(cè)股動(dòng)脈。經(jīng)左頸總動(dòng)脈插入心臟導(dǎo)管至左心室，連接RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)監(jiān)測左心室血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)；左股動(dòng)脈插入動(dòng)脈導(dǎo)管，連接生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)監(jiān)測平均動(dòng)脈壓(MAP)。采用體外電擊誘發(fā)心室纖顫(室顫)動(dòng)物模型，50 V交流電持續(xù)放電30 s，以監(jiān)護(hù)儀顯示MAP<20 mmHg及出現(xiàn)室顫波，延續(xù)3 min表示動(dòng)物模型制備成功。集束化治療組術(shù)后立即開始CPR、胸外按壓(按壓頻率200次/min，按壓深度為兔胸廓前后徑的1/3)與機(jī)械通氣〔吸氧濃度(FiO2)1.00，通氣頻率45次/min，潮氣量15 ml/kg〕同時(shí)進(jìn)行，并經(jīng)右頸靜脈泵入腎上腺素30 μg/kg、黃芪注射液4 g/kg。復(fù)蘇2 min后若仍為室顫則給予30 J單相波電除顫，之后持續(xù)胸外按壓2 min，如仍為室顫再以同樣能量電除顫，如此反復(fù)3次為1個(gè)周期。15 min后自主循環(huán)仍未恢復(fù)視為復(fù)蘇失敗。若出現(xiàn)室上性自主心律、MAP≥60 mmHg并持續(xù)5 min則表示自主循環(huán)恢復(fù)(ROSC)，復(fù)蘇成功。腎上腺素組僅給予腎上腺素注射液復(fù)蘇。假手術(shù)組不進(jìn)行體外電擊致顫，不實(shí)施亞低溫療法，不靜脈給予藥物。亞低溫組除不給予黃芪注射液外，其余處理同集束化治療組。整個(gè)操作程序遵循Utstein動(dòng)物模型復(fù)蘇指南方案進(jìn)行〔2〕。

1.4亞低溫療法的實(shí)施程序 見文獻(xiàn)〔3〕。

1.5檢測指標(biāo) 復(fù)蘇結(jié)束后檢測左室舒張期末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓上升/下降最大速率(±dp/dt max)、MAP及PI3K、Akt、GSK3-β蛋白。采用RM6240BD型多道生理信號(hào)采集處理系統(tǒng)于致顫前15 min和復(fù)蘇后240 min檢測LVEDP、±dp/dt max和MAP的數(shù)值。復(fù)蘇后觀察4 h，處死白兔，立即采集心肌組織，采用Western印跡法檢測PI3K、Akt、GSK3-β蛋白表達(dá)，最終結(jié)果表示為目的條帶與內(nèi)參β-actin的比值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。

2 結(jié) 果

2.1CPR前后4組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較 致顫前4組血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)均無顯著差異(均P>0.05)。復(fù)蘇后，腎上腺素組、亞低溫組及集束化治療組LVEDP均比假手術(shù)組顯著上升；集束化治療組LVEDP顯著低于腎上腺素組和亞低溫組(均P<0.01);腎上腺素組、亞低溫組和集束化治療組±dp/dt max及MAP明顯低于假手術(shù)組；集束化治療組±dp/dt max及MAP顯著高于腎上腺素組及亞低溫組(均P<0.01)。見表1。

表1 CPR前后各組LVEDP、±dp/dt max、MAP比較

與假手術(shù)組相比:1)P<0.01；與腎上腺素組相比:2)P<0.01；與亞低溫組相比:3)P<0.01；表2同

2.2各組CPR后PI3K、Akt、GSK3-β水平比較 復(fù)蘇后，腎上腺素組、亞低溫組和集束化治療組PI3K、Akt、GSK3-β水平顯著低于假手術(shù)組；集束化治療組PI3K、Akt、GSK3-β水平明顯高于腎上腺素組和亞低溫組(均P<0.01)。見表2和圖1。

表2 CPR后240 min各組PI3K、Akt、GSK3-β表達(dá)比較

圖1 Western 印跡檢測各組心肌細(xì)胞PI3K、Akt、GSK3-β表達(dá)

3 討 論

PCAS是指CA后經(jīng)過有效搶救，雖然達(dá)到ROSC，但由于患者CA，發(fā)生了心肌缺血，心臟恢復(fù)自主循環(huán)，進(jìn)行了心肌缺血再灌注，發(fā)生了缺血/再灌注損傷，這就是PCAS 的病理生理學(xué)本質(zhì)，可導(dǎo)致多數(shù)患者留下嚴(yán)重后遺癥或死亡〔4〕。

腎上腺素是目前臨床公認(rèn)的治療PCAS的“金標(biāo)準(zhǔn)”藥物，使用腎上腺素來挽救CA患者，已有50余年歷史。腎上腺素可以提高ROSC率，但無法改善患者出院存活率。腎上腺素用于CA患者，不僅沒有改善PCAS的病理及生理過程，而且與ROSC呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，降低了PCAS患者短期存活率或遠(yuǎn)期存活率〔5〕。臨床醫(yī)生以物理方法將病人體溫降低到預(yù)期水平來治療疾病的方法稱之為亞低溫療法，或者叫目標(biāo)性體溫管理。目前醫(yī)學(xué)界將輕中度低溫(28～35℃)稱為亞低溫。研究指出，亞低溫治療可有效抑制機(jī)體炎性反應(yīng)、減慢機(jī)體新陳代謝及增強(qiáng)機(jī)體對(duì)缺氧的耐受能力，患者ROSC后及早采取亞低溫治療可改善CA患者腦功能及提高出院存活率〔6〕。亞低溫療法治療PCAS具有巨大的潛力。單純的黃芪注射液或黃芪的有效成分黃芪多糖、黃芪皂苷等均具有一定的改善心血管作用。黃芪注射液對(duì)心肌缺血有顯著療效，其機(jī)制與降低冠狀血管阻力，增加冠狀血流量，改善心肌供血，降低心肌耗氧量有關(guān)〔7〕。

心力衰竭大鼠腹腔注射黃芪注射液，然后測定大鼠的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)大鼠的血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)(LVEDP、±dp/dt max、MAP)明顯改善〔8〕。臨床報(bào)道，PI3K/Akt/GSK-3β 信號(hào)通路對(duì)鼠大腦缺血/再灌注損傷有修復(fù)作用〔4,5〕，可起到神經(jīng)保護(hù)作用，抑制腦損傷面積擴(kuò)大〔6〕。當(dāng)心肌缺血/再灌注損傷時(shí),機(jī)體內(nèi)部分激酶被活化而發(fā)揮保護(hù)作用,稱之為再灌注損傷挽救激酶(RISK),其中PI3K是最重要的一種。PI3K蛋白是一種可催化磷脂酰肌醇D-3位磷酸化的脂類激酶,最早作為一種病毒癌基因產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn),由起催化作用的p110 亞基和起調(diào)節(jié)作用的亞基p85構(gòu)成Akt作為PI3K信號(hào)通路上的重要激酶，其激活抑制了下游GSK-3β活性，而磷酸化GSK-3β又能直接與線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)亞單位ANT結(jié)合，提高mPTP開放閾值，阻止mPTP開放而發(fā)揮抑制凋亡效果〔7〕。GSK-3β目前屬于保守絲氨酸/蘇氨酸激酶家族。多種藥物可以激活PI3K/Akt通路發(fā)揮抗缺血/再灌注損傷的作用，而GSK-3β是PI3K/Akt通路的作用底物,屬于Akt下游因子，激活的PI3K/Akt可促進(jìn)GSK-3β磷酸化〔8,9〕。

集束化治療方法對(duì)PCAS兔心肌有一定的保護(hù)作用，其藥理作用機(jī)制與改善兔血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的表達(dá)有關(guān)〔10〕。楊述亮等〔11〕報(bào)道，PI3K/Akt信號(hào)通路可通過調(diào)控下游的多種效應(yīng)分子，從而對(duì)器官的缺血/再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用，其中GSK-3β是主要效應(yīng)分子。該通路在心肌細(xì)胞缺血/缺氧培養(yǎng)、心肌缺血/再灌注損傷及離體心臟心肌缺血/再灌注損傷中的保護(hù)作用已經(jīng)得到驗(yàn)證。集束化治療方案可明顯改善兔心功能，優(yōu)化血流動(dòng)力學(xué)，調(diào)節(jié)PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路的活性發(fā)揮抑制心肌缺血/再灌注損傷的作用，PI3K/Akt/GSK-3β信號(hào)通路可能會(huì)成為治療PCAS的新靶點(diǎn)。